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【摘要】 目的：探討一种化学诱导小鼠先天性肾积水动物模型的方法。方法：将C57BL/6J孕鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。在第12个妊娠日（GD），对照组采用玉米油灌胃，实验组采用2，3，7，8-四氯二苯并二噁英（TCDD）灌胃。GD18，统计胎鼠的数量、存活率以及畸形发生情况。分析胎鼠及孕鼠各主要脏器组织学结构，电镜观察胎鼠输尿管和肾脏的超微结构。结果：GD18，对照组胎鼠的输尿管和肾脏均正常。实验组胎鼠肾积水发生率为100%（3级86.2%，4级13.8%）。实验组胎鼠下段和中段输尿管黏膜层移行上皮增生，管腔狭窄，输尿管上皮细胞核仁明显，靠边，核大，染色质丰富，异染色质少，常染色质发达；肾间质纤维化，肾小管结构模糊，上皮细胞肿胀，膜性结构破裂。对照组胎鼠肾积水发生率低于实验组。结论：TCDD所诱导的胎鼠肾积水动物模型，与人类肾盂输尿管连接处梗阻（UPJO）在病理学表现上类似，可用于UPJO发病机制与病因学等方面的研究。
【关键词】 小鼠； 先天性肾积水； 动物模型
Study on Animal Model of Congenital Hydronephrosis Induced by Chemical in Mice/LIU Jing，LIU Mingxue，LIU Xing，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：033-036
【Abstract】 Objective：To explore a kind of chemical method that can induce animal model of congenital hydronephrosis in mice.Method：C57BL/6J dams were randomly divided into the experimental group and the control group，ten mice in each group.Pregnant mice in the control group were given corn oil with intragastric administration，2，3，7，8-tetrachlorodibenzodioxin（TCDD） was given to pregnant mice with same method in the experimental group on gestational day（GD） 12.Teratogeny of fetus was distinguished，number and survival rate of fetus were calculated，main organs of fetus and dams were gain for histology analysis，ultramicrostructure of fetal ureter and kidney was observed with transmission electron microscope（TEM），on GD18.Result：On GD18，fetal ureters and kidneys were normal in the control group，incidence rate of hydronephrosis in fetus were 100%（grade 3 was 86.2%，grade 4 was 13.8%） in the experimental group.Epithelial proliferation in mucous membrane of inferior and middle ureter，narrow ureter lumina was found in hydronephrosis fetus.Renal interstitial fibrosis，epithelial cells of nephric tubule was swollen with vague and break structure， epithelial cells of ureter was shown with gross nucleoli，big nucleus，rich caryotin，few heterochromatin，and prosperous euchromatin which were found by TEM in the experimental group，on GD18. Hydronephrosis incidence of fetal in the control group was less than that of the experimental group.Conclusion：The animal model with congenital hydronephrosis was constructed with TCDD in fetal mice is similar to human ureteropelvic junction obstruction（UPJO） in pathology，is useful for study on pathogenesy and aetiology of UPJO.
【Key words】 Mice； Congenital hydronephrosis； Animal model
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.009 绝大部分先天性肾积水为肾盂输尿管连接处梗阻（UPJO）所导致[1-3]。迄今为止，在针对UPJO发病机制与病因学方面的研究中，还没有比较理想的动物模型供采用。国外有文献报道，多种动物的先天性肾积水是由2，3，7，8-四氯二苯并二噁英（TCDD）诱发的 [4-7]，其中以C57BL/6J小鼠最为敏感。本研究拟采用TCDD诱导C57BL/6J小鼠先天性肾积水，通过观察组织病理学及超微结构表现，评估以该方式建立UPJO所致肾积水动物模型的可行性。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 受试动物 由重庆医科大学实验动物中心提供的10～12周龄清洁级C57BL/6J小鼠，饲养于清洁级笼具，设置环境湿度为55%±5%，温度为23～25 ℃，光照为12 h/12 h明暗交替。适应新环境一周后，雌雄鼠合笼交配，雌鼠外阴出现阴栓当日作为第0个妊娠日（GD）。
1.1.2 主要试剂 美国Sigma-Aldrich公司提供TCDD和玉米油；北京化学试剂公司提供多聚甲醛；苏木精染液、伊红染液、盐酸酒精、二甲苯、中性树胶、4%戊二醛、1%锇酸、甲苯胺蓝、醋酸双氧铀、枸橼酸铅由重庆川东化工有限公司化学试剂厂提供。
1.1.3 主要仪器 H-600透射电镜由日本Hitachi公司提供；解剖显微镜由日本Nikon公司提供；显微摄像系统、光学显微镜购自日本Olympus公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组与处理 孕鼠被随机分为对照组与实验组，每组10只。GD12，对照组采用玉米油灌胃，实验组采用TCDD（25 μg/kg，用玉米油配制成2 μg/mL）灌胃。GD18，处死孕鼠，取孕鼠的心脏、肝脏、肺和肾脏等主要器官用作组织学观察。统计胎鼠的存活情况及数量，有无吸收胎及死胎，对胎鼠进行称重后处死，解剖胎鼠，观察胎鼠是否存在畸形，对胎鼠各主要脏器进行组织学观察。在两组胎鼠中各随机抽取1只，取其肾脏和输尿管，用于超微结构观察。
1.2.2 组织学观察 以4%多聚甲醛固定孕鼠及胎鼠各脏器标本6 h，石蜡包埋、切片，再进行苏木精-伊红（HE）染色。以下为具体操作步骤：切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，苏木精染液染色5～15 min，0.5%盐酸酒精分色30 s，流水冲洗15～30 min，0.1%伊红染液染色2 min，再经70%、85%、95%、100%酒精梯度脱水，每级脱水2～3 min，二甲苯透明2次，中性树胶封片，光学显微镜下观察。
1.2.3 肾积水程度分级 参照文献[8]，根据积水的程度，将胎鼠肾积水分为五级。
1.2.4 透射电镜观察 4 ℃条件下，以4%戊二醛将切割成约0.1 cm3大小的新鲜胎鼠肾脏组织与输尿管预固定2 h，0.1M PBS漂洗3次。1%锇酸固定1 h后，再以0.1M PBS漂洗3次。丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，制备半薄切片，甲苯胺蓝染色，光学显微镜定位。最后制备超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，透射电镜下观察和照相。
2 结果
2.1 TCDD对孕鼠的影响 两组孕鼠均无脱毛，皮毛色泽光亮，活动、饮水及摄食正常，无早产及流产，各主要脏器大体解剖与组织学表现均正常。
2.2 TCDD对胎鼠的影响 对照组胎鼠共68只，无腭裂表现，膀胱、双侧输尿管及肾脏均正常，其余各主要脏器也均正常。实验组胎鼠共65只，均伴有腭裂，下段输尿管及膀胱外观正常，双侧上段輸尿管及肾盂积水扩张明显，输尿管中段扭曲、折叠（图1），其余各脏器均正常。两组胎鼠均为活胎，无吸收胎及死胎。
注：①为对照组，②为实验组。白色箭头指示为肾盂，黑色箭头指示为输尿管。
2.3 胎鼠组织学分析结果 在实验组，肾积水发生率为100%，且均为双侧肾积水，其中9只胎鼠18个肾脏表现为双侧4级肾积水（占13.8%）；56只胎鼠112个肾脏表现为双侧3级肾积水（占86.2%）；组织学表现肾间质纤维化，中下段输尿管黏膜移行上皮增生致使管腔狭窄。对照组输尿管、肾脏组织学表现均正常。对照组胎鼠肾积水发生率低于实验组。胎鼠肾脏、输尿管在GD18的组织学表现，见图2。
2.4 透射电镜分析结果 相对于对照组，实验组胎鼠输尿管上皮细胞常染色质发达，染色质丰富核大，核仁明显，靠边，异染色质少；肾小管上皮细胞结构模糊，肿胀，可见破裂的膜性结构。
3 讨论
目前，主要有以下几种建立肾积水动物模型的方法：第一种，为使输尿管完全梗阻或不完全梗阻而形成肾积水，目前较多采用手术方式包埋或结扎输尿管[9-11]，这种肾积水成模方法不适用于先天性肾积水发病机制以及病因学方面的研究，因其与先天性肾积水相差太远，仅用于输尿管梗阻后肾脏代谢功能与肾脏病理学改变等方面的研究。第二种，某些动物的自发性先天性肾积水，是由于基因突变后出现的，可以经定向培育而保留下来。有学者发现了一个新的C57BL/6J小鼠突变品系，25%的仔鼠出生后2～4周死于双肾积水导致的氮质血症，其双侧肾积水是由于双侧肾盂输尿管连接部进行性梗阻所致[12]。但其他学者研究了同一突变品系的小鼠后并没有发现器质性梗阻，只是水通道蛋白2的正常运输功能因为基因突变而受干扰，导致尿液浓缩缺陷，出现纯合子多饮的症状，产生大量低渗尿引起肾积水，所以该品系小鼠出现的肾积水是功能性的，而非器质性梗阻所致[13]。Friedman等[14]学者发现一种先天性肾积水大鼠，大部分为单侧肾积水，有多尿症状，伴有低渗尿，血尿素氮升高，无明确的尿路梗阻，这种肾积水与人类的UPJO无可比性，估计也是由于大量低渗尿所致。在Tauchi等[15]所报道的先天性肾积水大鼠中，同样也未发现尿路梗阻。这类自发性先天性肾积水具有人为影响因素少的优点，缺点是：种类相对少，来源较困难，在病理学改变上与人类UPJO没有十分肯定的相似之处。第三种，先天性肾积水可由某些药物诱导出现。Dawrant等[16]在CBA/Ca小鼠中，采用阿霉素成功诱导出了VACTERL畸形，该畸形中的双侧肾积水发生率达100%。但该方法诱导的肾积水也不适于用作人类UPJO的动物模型，因为这种双侧肾积水继发于膀胱发育不全，且伴发太多的其他器官畸形。此外，基因工程也可用于制备肾积水动物模型[17-18]，但目前该技术本身存在的一些缺陷有待解决，还处于进一步完善提高的阶段[19]。 在本實验中，笔者采用C57BL/6J小鼠建立先天性肾积水的动物模型。C57BL/6J小鼠具有遗传背景清楚、寿命长、肿瘤自然发生率低、容易饲养等优点，广泛应用于发育生物学的研究，在转基因小鼠的生产中也经常被用到。C57BL/6J小鼠通常被作为标准的近交系小鼠，在生物医学研究领域广泛使用。本实验采用TCDD在C57BL/6J胎鼠中成功地诱导出了先天性双侧肾积水，发生率高达100%。给予25 ?g/kg的TCDD灌胃后，孕鼠主要脏器未出现病理性损害，一般状况良好，无吸收胎与死胎，无流产及早产，表明低剂量TCDD不影响小鼠的晚期妊娠。组织学分析结果表明，实验组胎鼠的中、下段输尿管黏膜移行上皮增生，引起输尿管管腔狭窄，导致输尿管不完全梗阻，最终形成肾积水。透射电镜下观察发现实验组胎鼠的输尿管上皮细胞核仁明显，染色质丰富，核大，表明输尿管上皮细胞增殖活跃，印证了组织学表现。在UPJO的病因中，肾盂输尿管连接处狭窄最常见，占UPJO病因的90%以上。国内学者对狭窄部位组织进行研究后发现，该部位病理改变具有多样性：狭窄部位黏膜及固有层淋巴细胞浸润，黏膜充血水肿；部分患者出现输尿管移行上皮细胞增生，少数呈乳头状增生，移行上皮细胞增生可多达6～10层；平滑肌改变可表现为肌内纤维增生、平滑肌变薄、平滑肌增多增粗、输尿管内外肌层分界不清、平滑肌结构紊乱[20]。TCDD所致胎鼠肾积水在组织病理学改变上类似于人类肾盂输尿管连接处狭窄——UPJO的最主要病理类型，其相似性表现为输尿管移行上皮增生引起输尿管管腔狭窄，导致输尿管不完全梗阻，最终形成肾积水。
因此，在病理学表现上，TCDD诱导出的胎鼠肾积水动物模型与人类UPJO相似，成模率高，可靠性和可重复性高，在妊娠敏感期一次低剂量灌胃即可成模，操作简便、可控性强、经济易行，对孕鼠干扰小，可用于UPJO发病机制及病因学等方面的研究。
本研究仅对妊娠第18天的胎鼠进行了观察，TCDD所诱导的胎鼠肾积水是否会像人类肾积水一样在出生后发生变化，还需进一步研究。
参考文献
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（收稿日期：2017-09-07） （本文编辑：程旭然）
【关键词】 小鼠； 先天性肾积水； 动物模型
Study on Animal Model of Congenital Hydronephrosis Induced by Chemical in Mice/LIU Jing，LIU Mingxue，LIU Xing，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：033-036
【Abstract】 Objective：To explore a kind of chemical method that can induce animal model of congenital hydronephrosis in mice.Method：C57BL/6J dams were randomly divided into the experimental group and the control group，ten mice in each group.Pregnant mice in the control group were given corn oil with intragastric administration，2，3，7，8-tetrachlorodibenzodioxin（TCDD） was given to pregnant mice with same method in the experimental group on gestational day（GD） 12.Teratogeny of fetus was distinguished，number and survival rate of fetus were calculated，main organs of fetus and dams were gain for histology analysis，ultramicrostructure of fetal ureter and kidney was observed with transmission electron microscope（TEM），on GD18.Result：On GD18，fetal ureters and kidneys were normal in the control group，incidence rate of hydronephrosis in fetus were 100%（grade 3 was 86.2%，grade 4 was 13.8%） in the experimental group.Epithelial proliferation in mucous membrane of inferior and middle ureter，narrow ureter lumina was found in hydronephrosis fetus.Renal interstitial fibrosis，epithelial cells of nephric tubule was swollen with vague and break structure， epithelial cells of ureter was shown with gross nucleoli，big nucleus，rich caryotin，few heterochromatin，and prosperous euchromatin which were found by TEM in the experimental group，on GD18. Hydronephrosis incidence of fetal in the control group was less than that of the experimental group.Conclusion：The animal model with congenital hydronephrosis was constructed with TCDD in fetal mice is similar to human ureteropelvic junction obstruction（UPJO） in pathology，is useful for study on pathogenesy and aetiology of UPJO.
【Key words】 Mice； Congenital hydronephrosis； Animal model
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.009 绝大部分先天性肾积水为肾盂输尿管连接处梗阻（UPJO）所导致[1-3]。迄今为止，在针对UPJO发病机制与病因学方面的研究中，还没有比较理想的动物模型供采用。国外有文献报道，多种动物的先天性肾积水是由2，3，7，8-四氯二苯并二噁英（TCDD）诱发的 [4-7]，其中以C57BL/6J小鼠最为敏感。本研究拟采用TCDD诱导C57BL/6J小鼠先天性肾积水，通过观察组织病理学及超微结构表现，评估以该方式建立UPJO所致肾积水动物模型的可行性。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 受试动物 由重庆医科大学实验动物中心提供的10～12周龄清洁级C57BL/6J小鼠，饲养于清洁级笼具，设置环境湿度为55%±5%，温度为23～25 ℃，光照为12 h/12 h明暗交替。适应新环境一周后，雌雄鼠合笼交配，雌鼠外阴出现阴栓当日作为第0个妊娠日（GD）。
1.1.2 主要试剂 美国Sigma-Aldrich公司提供TCDD和玉米油；北京化学试剂公司提供多聚甲醛；苏木精染液、伊红染液、盐酸酒精、二甲苯、中性树胶、4%戊二醛、1%锇酸、甲苯胺蓝、醋酸双氧铀、枸橼酸铅由重庆川东化工有限公司化学试剂厂提供。
1.1.3 主要仪器 H-600透射电镜由日本Hitachi公司提供；解剖显微镜由日本Nikon公司提供；显微摄像系统、光学显微镜购自日本Olympus公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组与处理 孕鼠被随机分为对照组与实验组，每组10只。GD12，对照组采用玉米油灌胃，实验组采用TCDD（25 μg/kg，用玉米油配制成2 μg/mL）灌胃。GD18，处死孕鼠，取孕鼠的心脏、肝脏、肺和肾脏等主要器官用作组织学观察。统计胎鼠的存活情况及数量，有无吸收胎及死胎，对胎鼠进行称重后处死，解剖胎鼠，观察胎鼠是否存在畸形，对胎鼠各主要脏器进行组织学观察。在两组胎鼠中各随机抽取1只，取其肾脏和输尿管，用于超微结构观察。
1.2.2 组织学观察 以4%多聚甲醛固定孕鼠及胎鼠各脏器标本6 h，石蜡包埋、切片，再进行苏木精-伊红（HE）染色。以下为具体操作步骤：切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，苏木精染液染色5～15 min，0.5%盐酸酒精分色30 s，流水冲洗15～30 min，0.1%伊红染液染色2 min，再经70%、85%、95%、100%酒精梯度脱水，每级脱水2～3 min，二甲苯透明2次，中性树胶封片，光学显微镜下观察。
1.2.3 肾积水程度分级 参照文献[8]，根据积水的程度，将胎鼠肾积水分为五级。
1.2.4 透射电镜观察 4 ℃条件下，以4%戊二醛将切割成约0.1 cm3大小的新鲜胎鼠肾脏组织与输尿管预固定2 h，0.1M PBS漂洗3次。1%锇酸固定1 h后，再以0.1M PBS漂洗3次。丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，制备半薄切片，甲苯胺蓝染色，光学显微镜定位。最后制备超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，透射电镜下观察和照相。
2 结果
2.1 TCDD对孕鼠的影响 两组孕鼠均无脱毛，皮毛色泽光亮，活动、饮水及摄食正常，无早产及流产，各主要脏器大体解剖与组织学表现均正常。
2.2 TCDD对胎鼠的影响 对照组胎鼠共68只，无腭裂表现，膀胱、双侧输尿管及肾脏均正常，其余各主要脏器也均正常。实验组胎鼠共65只，均伴有腭裂，下段输尿管及膀胱外观正常，双侧上段輸尿管及肾盂积水扩张明显，输尿管中段扭曲、折叠（图1），其余各脏器均正常。两组胎鼠均为活胎，无吸收胎及死胎。
注：①为对照组，②为实验组。白色箭头指示为肾盂，黑色箭头指示为输尿管。
2.3 胎鼠组织学分析结果 在实验组，肾积水发生率为100%，且均为双侧肾积水，其中9只胎鼠18个肾脏表现为双侧4级肾积水（占13.8%）；56只胎鼠112个肾脏表现为双侧3级肾积水（占86.2%）；组织学表现肾间质纤维化，中下段输尿管黏膜移行上皮增生致使管腔狭窄。对照组输尿管、肾脏组织学表现均正常。对照组胎鼠肾积水发生率低于实验组。胎鼠肾脏、输尿管在GD18的组织学表现，见图2。
2.4 透射电镜分析结果 相对于对照组，实验组胎鼠输尿管上皮细胞常染色质发达，染色质丰富核大，核仁明显，靠边，异染色质少；肾小管上皮细胞结构模糊，肿胀，可见破裂的膜性结构。
3 讨论
目前，主要有以下几种建立肾积水动物模型的方法：第一种，为使输尿管完全梗阻或不完全梗阻而形成肾积水，目前较多采用手术方式包埋或结扎输尿管[9-11]，这种肾积水成模方法不适用于先天性肾积水发病机制以及病因学方面的研究，因其与先天性肾积水相差太远，仅用于输尿管梗阻后肾脏代谢功能与肾脏病理学改变等方面的研究。第二种，某些动物的自发性先天性肾积水，是由于基因突变后出现的，可以经定向培育而保留下来。有学者发现了一个新的C57BL/6J小鼠突变品系，25%的仔鼠出生后2～4周死于双肾积水导致的氮质血症，其双侧肾积水是由于双侧肾盂输尿管连接部进行性梗阻所致[12]。但其他学者研究了同一突变品系的小鼠后并没有发现器质性梗阻，只是水通道蛋白2的正常运输功能因为基因突变而受干扰，导致尿液浓缩缺陷，出现纯合子多饮的症状，产生大量低渗尿引起肾积水，所以该品系小鼠出现的肾积水是功能性的，而非器质性梗阻所致[13]。Friedman等[14]学者发现一种先天性肾积水大鼠，大部分为单侧肾积水，有多尿症状，伴有低渗尿，血尿素氮升高，无明确的尿路梗阻，这种肾积水与人类的UPJO无可比性，估计也是由于大量低渗尿所致。在Tauchi等[15]所报道的先天性肾积水大鼠中，同样也未发现尿路梗阻。这类自发性先天性肾积水具有人为影响因素少的优点，缺点是：种类相对少，来源较困难，在病理学改变上与人类UPJO没有十分肯定的相似之处。第三种，先天性肾积水可由某些药物诱导出现。Dawrant等[16]在CBA/Ca小鼠中，采用阿霉素成功诱导出了VACTERL畸形，该畸形中的双侧肾积水发生率达100%。但该方法诱导的肾积水也不适于用作人类UPJO的动物模型，因为这种双侧肾积水继发于膀胱发育不全，且伴发太多的其他器官畸形。此外，基因工程也可用于制备肾积水动物模型[17-18]，但目前该技术本身存在的一些缺陷有待解决，还处于进一步完善提高的阶段[19]。 在本實验中，笔者采用C57BL/6J小鼠建立先天性肾积水的动物模型。C57BL/6J小鼠具有遗传背景清楚、寿命长、肿瘤自然发生率低、容易饲养等优点，广泛应用于发育生物学的研究，在转基因小鼠的生产中也经常被用到。C57BL/6J小鼠通常被作为标准的近交系小鼠，在生物医学研究领域广泛使用。本实验采用TCDD在C57BL/6J胎鼠中成功地诱导出了先天性双侧肾积水，发生率高达100%。给予25 ?g/kg的TCDD灌胃后，孕鼠主要脏器未出现病理性损害，一般状况良好，无吸收胎与死胎，无流产及早产，表明低剂量TCDD不影响小鼠的晚期妊娠。组织学分析结果表明，实验组胎鼠的中、下段输尿管黏膜移行上皮增生，引起输尿管管腔狭窄，导致输尿管不完全梗阻，最终形成肾积水。透射电镜下观察发现实验组胎鼠的输尿管上皮细胞核仁明显，染色质丰富，核大，表明输尿管上皮细胞增殖活跃，印证了组织学表现。在UPJO的病因中，肾盂输尿管连接处狭窄最常见，占UPJO病因的90%以上。国内学者对狭窄部位组织进行研究后发现，该部位病理改变具有多样性：狭窄部位黏膜及固有层淋巴细胞浸润，黏膜充血水肿；部分患者出现输尿管移行上皮细胞增生，少数呈乳头状增生，移行上皮细胞增生可多达6～10层；平滑肌改变可表现为肌内纤维增生、平滑肌变薄、平滑肌增多增粗、输尿管内外肌层分界不清、平滑肌结构紊乱[20]。TCDD所致胎鼠肾积水在组织病理学改变上类似于人类肾盂输尿管连接处狭窄——UPJO的最主要病理类型，其相似性表现为输尿管移行上皮增生引起输尿管管腔狭窄，导致输尿管不完全梗阻，最终形成肾积水。
因此，在病理学表现上，TCDD诱导出的胎鼠肾积水动物模型与人类UPJO相似，成模率高，可靠性和可重复性高，在妊娠敏感期一次低剂量灌胃即可成模，操作简便、可控性强、经济易行，对孕鼠干扰小，可用于UPJO发病机制及病因学等方面的研究。
本研究仅对妊娠第18天的胎鼠进行了观察，TCDD所诱导的胎鼠肾积水是否会像人类肾积水一样在出生后发生变化，还需进一步研究。
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（收稿日期：2017-09-07） （本文编辑：程旭然）