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[摘要]目的 研究PR OCR基因多态性位点n;867186与中国人群缺血性脑卒中患者颈动脉斑块纤维帽厚薄及完整性的关系。方法前瞻性纳入本院收治的缺血性脑卒中患者，采集人口统计学资料及脑卒中风险因素等临床信息，颈动脉高分辨磁共振（MRI）判断颈动脉粥样硬化斑块纤维帽厚薄，依据纤维帽厚度及完整程度对纳入患者进行分组。利用Real-dme PCR方法，使用TaqMan探针对厚/完整型纤维帽组及薄/破损型纤维帽组患者PROM基因多态性位点rs867186进行基因分型。结果 本研究共纳入176例缺血性脑卒中患者，其中95例颈动脉斑块具有厚/完整型纤维帽，81例具有薄/破损型纤维帽。对两组患者PROM基因n867186位点多态性分析显示，等位基因A是形成薄/破损型纤维帽斑塊的风险因素（OR=2.89，95% CI：1.03～8.06，P=0.04），其基因频率在厚/完整型纤维帽组和薄/破损型纤维帽组中分别为91.58%和96.91%。结论PROM基因多态性位点rs867186与颈动脉粥样硬化斑块纤维帽变薄/破损相关。
[关键词]PROM;单核苷酸多态性;缺血性脑卒中;动脉粥样硬化;斑块;纤维帽
中图分类号：R543.4 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2019）05-0394-04
doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.05.002
在中国，脑卒中发病率呈逐年上升趋势。脑卒中由于其高发病率和高致死率，已成为世界各国共同面临的公共健康问题[1]。动脉粥样硬化易损斑块破损引发的血栓栓塞是缺血性脑卒中主要的致病因素[2]。及时识别易损斑块患者并进行干预治疗对于预防缺血性脑卒中有重要意义。诊断易损斑块的主要标准包括：活动性炎症、薄纤维帽及大的脂质核心、内皮剥脱伴表面血小板聚集、斑块有裂隙或损伤、严重狭窄[3，4]。其中纤维帽的厚薄及完整性是形态学上判断易损斑块的主要标志之一，薄或破损的纤维帽提示该斑块可能为易损斑块。单核苷酸多态性（single nu-cleotide ploymorphism，SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）显示，动脉粥样硬化、心肌梗死等复杂疾病与许多基因的SNP相关[5，6]。基因的不同多态性不仅影响动脉粥样硬化的发生发展，还可能与动脉粥样硬化斑块的易损性相关。2017年，研究人员通过基因芯片及meta分析，发现蛋白C受体（endothelial protein C re-ceptor，PROCR）基因SNP位点rs867186可能与动脉粥样硬化及主动脉疾病相关[7]，但该多态性位点与动脉粥样硬化斑块易损性及斑块纤维帽完整性的研究未见报道。
本研究通过对176例缺血性脑卒中患者进行颈动脉高分辨率磁共振成像（MRI）检查，判断其颈动脉斑块纤维帽厚薄及完整性，并对PROM基因SNP位点rS867186进行基因分型，探讨PROCR基因多态性与中国人群缺血性脑卒中患者颈动脉MRI影像的纤维帽变薄或破损的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料：前瞻性纳入2014年5月至2017年10月期间首都医科大学附属北京天坛医院收治的缺血性脑卒中患者176例。纳入标准：（1）临床诊断为前循环、非心源性的缺血性脑卒中，诊断标准符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[8];（2）年龄40～85岁;（3）脑卒中发病后6个月内入院;（4）患者或家属签署知情同意书。排除标准：（1）有MRI检查禁忌证;（2）对钆对比剂过敏;（3）心源性脑卒中或动脉炎等其他病因导致的缺血脑卒中病变;（4）既往行颈动脉内膜剥脱术或支架置入术;（5）既往行颈部放疗;（6）既往肝肾病史及行肝移植患者。研究方案经过首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会批准，批准编号为KY2014-004-04。
1.2 方法：收集研究对象基本临床资料，包括人口统计学信息（性别、年龄）、身高、体重、收缩压、舒张压、脑卒中危险因素[高血压、糖尿病、高脂血症、既往短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）或脑卒中史、吸烟史、脑卒中家族史、心肌梗死家族史]、基本实验室检查[甘油三酷（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（GHb）]等。使用Trio Tim 3.0T超导MR设备（Siemens Medical Systems，德国）对纳入患者进行颈动脉高分辨率MRI检查。依据颈动脉高分辨率MRI结果，按照斑块纤维帽性质，将患者分为厚/完整型纤维帽组95例和薄/破损型纤维帽组81例。
1.3 基因型分析：抽取患者外周血2mL，使用血液基因组DNA提取系统（天根生化科技有限公司）提取DNA，方法见试剂盒操作说明书。利用TaqMan探针方法对PROCR基因SNP位点rs867186进行基因分型。反应体系：DNA模板20ng，TaqMan SNP GenotypingAssays Thermo Fisher，美国，Assay ID：C-25620145-10）0.25μL，2×TaqMan Genotyping Master Mix（Thermo Fish-er）5μL，补水至10μL。7500 Fast Real-Time PCR system（Applied Biosystems，美国）仪器进行基因型检测，反应条件如下：95℃ 10min预变性;95℃15s，60℃ 1min，重复40个循环。
1.4 统计学处理：使用SPSS 17.0版对数据进行统计学分析。使用Shapiro-Wilk方法对计量资料进行正态性检验，符合正态分布的以（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验;非正态分布的以中位数（M）和四分位数间距（IQR）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以例数和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。基因型与Hardy-Weinberg平衡符合程度、组间基因型及等位基因频率差异比较使用χ2检验。基因型与纤维帽变薄/破损相关性用比值比（odds ratio，OR）及95%置信区间（confidence interval，CI）表示。P<0.05为差异有统计学意义。 2 結果
2.1 研究对象基本特征：其中男131例，女45例，平均年龄（59.69±8.73）岁。两组患者基本临床信息比较，见表1。
2.2 PROM基因多态性位点rs867186与纤维帽完整性相关：经过χ2检验厚/完整型纤维帽组和薄/破损型纤维帽组的两组患者中，rs867186位点的基因频率和基因型分布比例均达到Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。对PROCR基因rs867186位点的多态性分析显示：在95例厚/完整型纤维帽组患者中，存在A/A，A/G、G/G三种基因型，在81例薄/破损型纤维帽组患者中只有A/A、A/G两种基因型存在。A/A基因型在薄/破损型纤维帽组患者中分布比例更高，G/G基因型仅在厚/完整型纤维帽组患者中有分布。等位基因A是纤维帽变薄或破损的风险等位基因，其基因频率在薄/破损型纤维帽组中为96.91%，在厚/完整型纤维帽组为91.58%。风险等位基因OR值为2.89（95%CI=1.03～8.06，P=0.04），见表2。
3 讨论
内皮细胞蛋白C受体（endothelial protein C recep-tor，EPCR）由PROCR基因编码，参与激活蛋自C系统，发挥细胞保护、抗炎、抗凝等作用[9]。近年研究发现，PROM基因多态性与血栓性疾病、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病有关[10～12]。PROCR SNP位点rs867186 A/G改变会引起EPCR跨膜区域第219位丝氨酸转变为甘氨基酸（Ser219Gly）[13]，导致表皮生长因子受体（opitelial growth factor receptor，EGFR）结构改变，更易被蛋白酶水解而从内皮细胞膜上脱落，从而使活化的凝血因子Ⅴ和Ⅷ（FⅤ a和FⅧa）增加，凝血酶生成增多，静脉血栓形成风险增加[14，15]。另有研究报道，rs867186等位基因A/G的转变对冠心病有保护作用（OR=0.93，95%CI=0.91～0.96）[7]，但其作用机制尚不明确。
斑块纤维帽主要由平滑肌细胞和细胞外基质（包含胶原纤维和弹性蛋白等）组成，其中细胞外基质在纤维帽中的含量是一个动态变化的过程，其合成与降解受多种因子调节[16]。细胞外基质主要由血管平滑肌细胞合成与分泌，巨噬细胞、内皮细胞分泌的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、自细胞介素（IL-s）、干扰素-γ（IFN-γ）等炎症因子可以诱导局部平滑肌细胞发生凋亡，平滑肌细胞的数量减少和功能减弱会导致细胞外基质合成减少，纤维帽的胶原修复障碍[17]。此外，巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶（MMPs）、胶原酶和弹性蛋自酶等可以降解细胞外基质[18]。当细胞外基质合成减少、降解增加时，纤维帽厚度变薄、强度减弱，更易破裂。
本研究通过对具有厚/完整型纤维帽和薄/破损型纤维帽的两组缺血性脑卒中患者进行基因分型，发现PROM基因rs867186位点A/A基因型在薄/破损型纤维帽组患者中分布比例更高，G/G基因型在厚/完整型纤维帽组患者中分布比例更高。等位基因A是斑块纤维帽变薄或破损的风险因素。本研究揭示PROM基因SNP位点rs867186与中国人群缺血性脑卒中患者颈动脉斑块纤维帽完整性相关，但该多态性影响纤维帽完整性的作用机制尚需要进一步研究。我们推测PROCR基因多态性导致EGFR结构改变，可能导致某些细胞因子的含量或活性变化，从而影响细胞外基质合成与降解平衡，最终引起纤维帽完整性变化。本研究为寻找新的斑块纤维帽完整性预测指标提供思路，对于指导临床治疗及脑卒中预防具有一定意义。后续研究可集中在PRO-CR基因rs867186位点多态性变化，对细胞因子水平、血管平滑肌细胞凋亡、细胞外基质合成与降解的影响，揭示rs867186SNP位点影响纤维帽完整性的可能的分子机制。
本研究的局限性在于纳入患者量较小，尚需要长期收集样本，进一步扩大研究规模来证实PROCR基因多态性与斑块纤维帽厚薄的相关性。另外，由于动脉粥样硬化是全身性的复杂疾病，患者脑血管、冠状动脉、主动脉等血管中也可能存在斑块，本研究未对这些血管中的斑块状态进行评价，因此PROCR基因多态性与其他部位动脉粥样硬化斑块纤维帽完整性的关系尚需进一步研究。
参考文献
[1]Zhou M，Wang H，Zhu J，et al.Cause-specific mortality for 240 causes inChina during 1990-2013：a systematic subnational analysis for the GlobalBurden of Disease Study 2013[J].Lancet，2016，387（10015）：251-272.
[2]Spacek M，Zemanek D，Hutyra M，et al.Vulnerable atheroscleroticplaque-a review of current concepts and advanced imagine J].Biomed PapMel Far Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2018，162（1）：10-17.
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[4]Naghavi M，Libby P，Falk h：，et al.From vulnerable plaque to vulnerablepatient：a call for new definitions and risk assessment strategies[J]：Part1.Circulation，2003，108（14）：1664-1672. [5]McPherson R，Tybjaerg-Hansen A.Genetics of coronary artery disease J].Circ Res，2016，118（4）：564-578.
[6]van der Hay，-，t P，Verweil N.Identification of 64 novel genetic loci providesan expanded view on the genetic architecture of coronary artery disease J].Circ Res，2018，122（3）：433-443.
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（收稿日期：2019-5-9）
基金項目：国家自然科学基金国际合作交流项目（编号：81361120402）;国家自然科学基金面上项目（编号：81572474）
作者单位：1.100070 首都医科大学附属北京天坛医院国家神经系统疾病临床医学研究中心;2.100015首都医科大学附属北京地坛医院检验科;3.100070 首都医科大学附属北京天坛医院神经放射科;4.100070 北京市神经外科研究所
作者简介：李昊文（1983-），博士，副研究员
通讯作者：高培毅，博士，主任医师，E-mail：cjr.gaopeiyi@vip.163.com
[关键词]PROM;单核苷酸多态性;缺血性脑卒中;动脉粥样硬化;斑块;纤维帽
中图分类号：R543.4 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2019）05-0394-04
doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.05.002
在中国，脑卒中发病率呈逐年上升趋势。脑卒中由于其高发病率和高致死率，已成为世界各国共同面临的公共健康问题[1]。动脉粥样硬化易损斑块破损引发的血栓栓塞是缺血性脑卒中主要的致病因素[2]。及时识别易损斑块患者并进行干预治疗对于预防缺血性脑卒中有重要意义。诊断易损斑块的主要标准包括：活动性炎症、薄纤维帽及大的脂质核心、内皮剥脱伴表面血小板聚集、斑块有裂隙或损伤、严重狭窄[3，4]。其中纤维帽的厚薄及完整性是形态学上判断易损斑块的主要标志之一，薄或破损的纤维帽提示该斑块可能为易损斑块。单核苷酸多态性（single nu-cleotide ploymorphism，SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）显示，动脉粥样硬化、心肌梗死等复杂疾病与许多基因的SNP相关[5，6]。基因的不同多态性不仅影响动脉粥样硬化的发生发展，还可能与动脉粥样硬化斑块的易损性相关。2017年，研究人员通过基因芯片及meta分析，发现蛋白C受体（endothelial protein C re-ceptor，PROCR）基因SNP位点rs867186可能与动脉粥样硬化及主动脉疾病相关[7]，但该多态性位点与动脉粥样硬化斑块易损性及斑块纤维帽完整性的研究未见报道。
本研究通过对176例缺血性脑卒中患者进行颈动脉高分辨率磁共振成像（MRI）检查，判断其颈动脉斑块纤维帽厚薄及完整性，并对PROM基因SNP位点rS867186进行基因分型，探讨PROCR基因多态性与中国人群缺血性脑卒中患者颈动脉MRI影像的纤维帽变薄或破损的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料：前瞻性纳入2014年5月至2017年10月期间首都医科大学附属北京天坛医院收治的缺血性脑卒中患者176例。纳入标准：（1）临床诊断为前循环、非心源性的缺血性脑卒中，诊断标准符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[8];（2）年龄40～85岁;（3）脑卒中发病后6个月内入院;（4）患者或家属签署知情同意书。排除标准：（1）有MRI检查禁忌证;（2）对钆对比剂过敏;（3）心源性脑卒中或动脉炎等其他病因导致的缺血脑卒中病变;（4）既往行颈动脉内膜剥脱术或支架置入术;（5）既往行颈部放疗;（6）既往肝肾病史及行肝移植患者。研究方案经过首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会批准，批准编号为KY2014-004-04。
1.2 方法：收集研究对象基本临床资料，包括人口统计学信息（性别、年龄）、身高、体重、收缩压、舒张压、脑卒中危险因素[高血压、糖尿病、高脂血症、既往短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）或脑卒中史、吸烟史、脑卒中家族史、心肌梗死家族史]、基本实验室检查[甘油三酷（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（GHb）]等。使用Trio Tim 3.0T超导MR设备（Siemens Medical Systems，德国）对纳入患者进行颈动脉高分辨率MRI检查。依据颈动脉高分辨率MRI结果，按照斑块纤维帽性质，将患者分为厚/完整型纤维帽组95例和薄/破损型纤维帽组81例。
1.3 基因型分析：抽取患者外周血2mL，使用血液基因组DNA提取系统（天根生化科技有限公司）提取DNA，方法见试剂盒操作说明书。利用TaqMan探针方法对PROCR基因SNP位点rs867186进行基因分型。反应体系：DNA模板20ng，TaqMan SNP GenotypingAssays Thermo Fisher，美国，Assay ID：C-25620145-10）0.25μL，2×TaqMan Genotyping Master Mix（Thermo Fish-er）5μL，补水至10μL。7500 Fast Real-Time PCR system（Applied Biosystems，美国）仪器进行基因型检测，反应条件如下：95℃ 10min预变性;95℃15s，60℃ 1min，重复40个循环。
1.4 统计学处理：使用SPSS 17.0版对数据进行统计学分析。使用Shapiro-Wilk方法对计量资料进行正态性检验，符合正态分布的以（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验;非正态分布的以中位数（M）和四分位数间距（IQR）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以例数和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。基因型与Hardy-Weinberg平衡符合程度、组间基因型及等位基因频率差异比较使用χ2检验。基因型与纤维帽变薄/破损相关性用比值比（odds ratio，OR）及95%置信区间（confidence interval，CI）表示。P<0.05为差异有统计学意义。 2 結果
2.1 研究对象基本特征：其中男131例，女45例，平均年龄（59.69±8.73）岁。两组患者基本临床信息比较，见表1。
2.2 PROM基因多态性位点rs867186与纤维帽完整性相关：经过χ2检验厚/完整型纤维帽组和薄/破损型纤维帽组的两组患者中，rs867186位点的基因频率和基因型分布比例均达到Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。对PROCR基因rs867186位点的多态性分析显示：在95例厚/完整型纤维帽组患者中，存在A/A，A/G、G/G三种基因型，在81例薄/破损型纤维帽组患者中只有A/A、A/G两种基因型存在。A/A基因型在薄/破损型纤维帽组患者中分布比例更高，G/G基因型仅在厚/完整型纤维帽组患者中有分布。等位基因A是纤维帽变薄或破损的风险等位基因，其基因频率在薄/破损型纤维帽组中为96.91%，在厚/完整型纤维帽组为91.58%。风险等位基因OR值为2.89（95%CI=1.03～8.06，P=0.04），见表2。
3 讨论
内皮细胞蛋白C受体（endothelial protein C recep-tor，EPCR）由PROCR基因编码，参与激活蛋自C系统，发挥细胞保护、抗炎、抗凝等作用[9]。近年研究发现，PROM基因多态性与血栓性疾病、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病有关[10～12]。PROCR SNP位点rs867186 A/G改变会引起EPCR跨膜区域第219位丝氨酸转变为甘氨基酸（Ser219Gly）[13]，导致表皮生长因子受体（opitelial growth factor receptor，EGFR）结构改变，更易被蛋白酶水解而从内皮细胞膜上脱落，从而使活化的凝血因子Ⅴ和Ⅷ（FⅤ a和FⅧa）增加，凝血酶生成增多，静脉血栓形成风险增加[14，15]。另有研究报道，rs867186等位基因A/G的转变对冠心病有保护作用（OR=0.93，95%CI=0.91～0.96）[7]，但其作用机制尚不明确。
斑块纤维帽主要由平滑肌细胞和细胞外基质（包含胶原纤维和弹性蛋白等）组成，其中细胞外基质在纤维帽中的含量是一个动态变化的过程，其合成与降解受多种因子调节[16]。细胞外基质主要由血管平滑肌细胞合成与分泌，巨噬细胞、内皮细胞分泌的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、自细胞介素（IL-s）、干扰素-γ（IFN-γ）等炎症因子可以诱导局部平滑肌细胞发生凋亡，平滑肌细胞的数量减少和功能减弱会导致细胞外基质合成减少，纤维帽的胶原修复障碍[17]。此外，巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶（MMPs）、胶原酶和弹性蛋自酶等可以降解细胞外基质[18]。当细胞外基质合成减少、降解增加时，纤维帽厚度变薄、强度减弱，更易破裂。
本研究通过对具有厚/完整型纤维帽和薄/破损型纤维帽的两组缺血性脑卒中患者进行基因分型，发现PROM基因rs867186位点A/A基因型在薄/破损型纤维帽组患者中分布比例更高，G/G基因型在厚/完整型纤维帽组患者中分布比例更高。等位基因A是斑块纤维帽变薄或破损的风险因素。本研究揭示PROM基因SNP位点rs867186与中国人群缺血性脑卒中患者颈动脉斑块纤维帽完整性相关，但该多态性影响纤维帽完整性的作用机制尚需要进一步研究。我们推测PROCR基因多态性导致EGFR结构改变，可能导致某些细胞因子的含量或活性变化，从而影响细胞外基质合成与降解平衡，最终引起纤维帽完整性变化。本研究为寻找新的斑块纤维帽完整性预测指标提供思路，对于指导临床治疗及脑卒中预防具有一定意义。后续研究可集中在PRO-CR基因rs867186位点多态性变化，对细胞因子水平、血管平滑肌细胞凋亡、细胞外基质合成与降解的影响，揭示rs867186SNP位点影响纤维帽完整性的可能的分子机制。
本研究的局限性在于纳入患者量较小，尚需要长期收集样本，进一步扩大研究规模来证实PROCR基因多态性与斑块纤维帽厚薄的相关性。另外，由于动脉粥样硬化是全身性的复杂疾病，患者脑血管、冠状动脉、主动脉等血管中也可能存在斑块，本研究未对这些血管中的斑块状态进行评价，因此PROCR基因多态性与其他部位动脉粥样硬化斑块纤维帽完整性的关系尚需进一步研究。
参考文献
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[6]van der Hay，-，t P，Verweil N.Identification of 64 novel genetic loci providesan expanded view on the genetic architecture of coronary artery disease J].Circ Res，2018，122（3）：433-443.
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[8]中华医学会神经病学分会.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014[J].中华神经科杂志，2015 ，48（4）：246-257.
[9]Pendurthi UR，Rao LVM.Endothelial cell protein Creceptor-dependentsignaling[J].Curr Opin Hematol，2018，250）：219-226.
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（收稿日期：2019-5-9）
基金項目：国家自然科学基金国际合作交流项目（编号：81361120402）;国家自然科学基金面上项目（编号：81572474）
作者单位：1.100070 首都医科大学附属北京天坛医院国家神经系统疾病临床医学研究中心;2.100015首都医科大学附属北京地坛医院检验科;3.100070 首都医科大学附属北京天坛医院神经放射科;4.100070 北京市神经外科研究所
作者简介：李昊文（1983-），博士，副研究员
通讯作者：高培毅，博士，主任医师，E-mail：cjr.gaopeiyi@vip.163.com