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【摘要】 目的：研究大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶（glycylproline dipeptidyl aminopeptidase，GPDA）基因表达变化的影响。方法：Sprague-Dawley大鼠36只。将所有大鼠随机分为三组，假手术组、脊髓损伤未使用药物干预组（创伤组）、脊髓损伤+甲强龙干预组（甲强龙组）。在大鼠脊髓损伤后24 h将损伤的脊髓组织切取，进行逆转录PCR反应并检测GDPA的表达。结果：假手术组GDPA的mRNA的表达的相对丰度为1.5403±0.1604；脊髓损伤24 h后创伤组GDPA的表达的相对丰度为0.5994±0.3414，与假手术组相比差异有非常显著统计学意义（P<0.01）；GDPA在脊髓损伤后使用甲强龙干预组中的表达相对丰度为1.8432±0.1294，与创伤组比较差异有非常显著统计学意义（P<0.01）。结论：大剂量甲基强的松龙的早期使用能促进脊髓损伤后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达恢复，发挥细胞保护作用。
【关键词】 脊髓损伤； 甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶； 甲基强的松龙； RT-PCR
Effect of High Dose Methylprednisolone on Glycyl Proline Dipeptidyl Aminopeptidase mRNA Expression after Spinal Cord Injury/LUO Fen-qi，XU Jie.//Medical Innovation of China，2012，9（31）：004-005
【Abstract】 Objective：To investigate effect of high dose methylprednisolone （MP） on Glycyl Proline Dipeptidyl Aminopeptidase mRNA expression after spinal cord injury mRNA expression after spinal cord injury.Method：Thirty SD rats were divided equally into operation but none injury group， Allen’s weight drop injury group and injury with high dose MP group. Twenty four hours after the operation， the spinal lesion and neighbor areas were moved for examination of Glycyl Proline Dipeptidyl Aminopeptidase mRNA expression by Retrograde Polymerase Chain Reaction technique （RT-PCR）.Result：The Glycyl Proline Dipeptidyl Aminopeptidase mRNA expression were 1.5403±0.1604， 0.5994±0.3414 （P<0.01）， 1.8432±0.1294 （P<0.01） in three group. It increased significantly after spinal cord injury and treatment with MP.Conclusion：MP can greatly increase the expression of Glycyl Proline Dipeptidyl Aminopeptidase and protect the neighbor areas after spinal cord injury.
【Key words】 Spinal cord injury； Glycyl proline dipeptidyl aminopeptidase； Methylprednisolone； RT-PCR
First-author’s address：Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.31.002
脊髓損伤后，神经细胞增生肥大，胞浆呈嗜酸性，突起变粗，分支增多。这些改变可起到减轻损伤及填补组织损伤而形成的空洞等作用，为神经再生创造条件；但聚集的星形胶质细胞所形成的胶质性瘢痕及其所分泌和表达的抑制性因子形成机械及化学屏障对上下行神经元轴突的再生有明显的阻碍作用[1]。N2末端为甘氨酰2脯氨酰的肽键能被GDPA特异地水解，而该肽键正是构成胶质的基本结构[2]，因此，推测GPDA在缓解星形胶质细胞所构成的机械和化学屏障中起到作用，从而改善脊髓继发性损伤的进一步发展。本文对GDPA基因在多种情况下表达的变化进行研究，并探讨脊髓损伤早期，GDPA对继发性脊髓损伤的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 Sprague-Dawley大鼠（中科院上海实验动物中心提供，10周龄）36只，体重180～240g。根据随机表分为三组。假手术组、脊髓损伤未使用药物干预组（创伤组）、脊髓损伤+甲强龙干预组 （甲强龙组）。每组12只。在大鼠脊髓损伤后24 h将损伤的脊髓组织切取，进行逆转录PCR反应。检测GDPA的表达。
1.2 手术方法 腹部消毒后腹腔内注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，腰背部备皮消毒，充分暴露T8～9脊髓腰膨大。采用改良的Allen打击法（5 g×5 cm）制作脊髓损伤模型，甲强龙组大鼠静脉注射甲基强的松龙（30 mg/kg），假手术组未做任何处理关闭切口，创伤组大鼠静脉内注射等量的0.9%氯化钠溶液。24 h后切除脊髓损伤部位上下1 cm的脊髓组织切取，进行RT-PCR反应。 1.3 逆转录PCR反应
1.3.1 脊髓神经细胞总的RNA使用Trizol液提取 1 ml Trizol液中加入1 g组织，反复吹打数次。混合均匀后加入0.2 ml氯仿，并予以离心（12 500 r/min，10 min）。吸取上部清液，加入0.5 ml异丙醇，离心（12 500 r/min，10 min）。
沉淀物加入30 μl DEPC溶化。
1.3.2 RNA定量和鉴定 紫外分光光度计定量RNA，计算OD260、OD280及比值。取总RNA3 μg，电泳（琼脂糖凝胶）30 min，使用紫外光显示28 s及18 s两条rRNA带，说明RNA提取完整性好。
1.3.3 以Vector NTI Suite软件设计检测引物 引物序列：正义：5’TTGCGTGCTGCTATAGTGG 3’，反义：
5’ ACTGCGCCACGAATTTGGG 3’，扩增产物长度：
254bp。β-Actin检测引物序列如下：正义：5’ GGGCAATGG
TCAGTAGGAT 3’（176-196），反义：5’ CAGTGTGTGACGAG
TCCGT 3’（277-257）。扩增长度为264 bp。
1.3.4 用One-tube RT-PCR system（Roche公司）进行一步法反转录和扩增。
1.4 取5 μl PCR扩增产物电泳，扫描DNA密度，分析基因表达的相对丰度。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件在计算机上进行分析。计量资料以（x±s）表示，两组间采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
假手术组GDPA的mRNA的表达的相对丰度为1.5403±0.1604；脊髓损伤24 h后创伤组GDPA的表达的相对丰度为0.5994±0.3414，与假手术组相比差异有非常显著统计学意义（P<0.01）；GDPA在脊髓损伤后使用甲强龙干预组中的表达相对丰度为1.8432±0.1294，與创伤组比较差异有非常显著统计学意义（P<0.01）。表明大剂量甲基强的松龙的早期使用能促进脊髓损伤后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达恢复，发挥细胞保护作用。（表1，图1）。β-Actin的RT-PCR结果见图2，甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶mRNA的RT-PCR结果见图3。
表1 脊髓损伤后24 h二肽氨基肽酶表达情况（x±s）
组别 表达相对丰度
假手术组 1.5403±0.1604
创伤组 0.5994±0.3414
甲强龙组 1.8432±0.1294
图1 GPDA表达的相对丰度
图2 β-Actin的RT-PCR结果
图3 甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶mRNA的RT-PCR结果
注：M1： 50bp ladder， sangon 公司产品；M2： DL-2000 marker， Takara公司产品
3 讨论
外伤后脊髓的功能完全恢复的可能性是比较小的，在受到外伤后很短时间内就会发生继发性的损伤，所以给予早期保护治疗非常的重要。甲基强地松龙为激素类药物，其可对此疾病进行治疗，现今多应用于急性脊髓损伤的早期治疗。
早在1966年，Hopsu-Havu等[3]发现甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶。而后多位专家经过分析证明了该酶的活性[4]。为了探索其他哺乳动物组织中是否含有此酶， 他们首先以鼠肝为样品进行了研究，同样证实在鼠肝和鼠肾中都存在这种新的二肽氨基肽酶，即现在所称的GPDA[5-6]。
文中建立的模型应用打击法，造成模型脊髓损伤，此模型和人体受到外伤的情况比较相似，相关性比较好。本研究发现脊髓组织有甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达，脊髓损伤24 h后，甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达显著降低，大剂量甲基强的松龙能促进甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达，到达治疗效果。
参考文献
[1] Park S J，Oh I S，Kwon J Y，et al.The effect of irradiation and methylprednisolone in spinal cord injured rats[J].Spine，2011，36（6）：434-440.
[2] Hall E D.Antioxidant therapies for acute spinal cord injury[J].Neurotherapeutics，2011，8（2）：152-167.
[3] Hopsu-Havu V K，Glenner G G.A new dipeptide naphthylamidase hydrolyzing glycyl-prolyl-beta-naphthylamide[J].Histochemie，1966，7（3）：197-201.
[4] Liu H D，Ni R Z，Xiao M B，et al.Clinical significance of serum GPDA-F determined by immunoelectrophoresis in diagnosis of hepatocellular carcinoma[J].Immunology，2006，5（2）：247-249.
[5] Thompson Coon J，Rogers G，Hewson P，et al.Surveillance of cirrhosis for hepatocellular carcinoma：systematic review and economic analysis[J].Health Technol Assess，2007，11（34）：201-206.
[6] Stammers A T，Liu J，Kwon B K.Expression of inflammatory cytokines following acute spinal cord injury in a rodent model[J].J Neurosci Res，2012，90（4）：782-790.
（收稿日期：2012-08-07） （本文编辑：连胜利）
【关键词】 脊髓损伤； 甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶； 甲基强的松龙； RT-PCR
Effect of High Dose Methylprednisolone on Glycyl Proline Dipeptidyl Aminopeptidase mRNA Expression after Spinal Cord Injury/LUO Fen-qi，XU Jie.//Medical Innovation of China，2012，9（31）：004-005
【Abstract】 Objective：To investigate effect of high dose methylprednisolone （MP） on Glycyl Proline Dipeptidyl Aminopeptidase mRNA expression after spinal cord injury mRNA expression after spinal cord injury.Method：Thirty SD rats were divided equally into operation but none injury group， Allen’s weight drop injury group and injury with high dose MP group. Twenty four hours after the operation， the spinal lesion and neighbor areas were moved for examination of Glycyl Proline Dipeptidyl Aminopeptidase mRNA expression by Retrograde Polymerase Chain Reaction technique （RT-PCR）.Result：The Glycyl Proline Dipeptidyl Aminopeptidase mRNA expression were 1.5403±0.1604， 0.5994±0.3414 （P<0.01）， 1.8432±0.1294 （P<0.01） in three group. It increased significantly after spinal cord injury and treatment with MP.Conclusion：MP can greatly increase the expression of Glycyl Proline Dipeptidyl Aminopeptidase and protect the neighbor areas after spinal cord injury.
【Key words】 Spinal cord injury； Glycyl proline dipeptidyl aminopeptidase； Methylprednisolone； RT-PCR
First-author’s address：Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.31.002
脊髓損伤后，神经细胞增生肥大，胞浆呈嗜酸性，突起变粗，分支增多。这些改变可起到减轻损伤及填补组织损伤而形成的空洞等作用，为神经再生创造条件；但聚集的星形胶质细胞所形成的胶质性瘢痕及其所分泌和表达的抑制性因子形成机械及化学屏障对上下行神经元轴突的再生有明显的阻碍作用[1]。N2末端为甘氨酰2脯氨酰的肽键能被GDPA特异地水解，而该肽键正是构成胶质的基本结构[2]，因此，推测GPDA在缓解星形胶质细胞所构成的机械和化学屏障中起到作用，从而改善脊髓继发性损伤的进一步发展。本文对GDPA基因在多种情况下表达的变化进行研究，并探讨脊髓损伤早期，GDPA对继发性脊髓损伤的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 Sprague-Dawley大鼠（中科院上海实验动物中心提供，10周龄）36只，体重180～240g。根据随机表分为三组。假手术组、脊髓损伤未使用药物干预组（创伤组）、脊髓损伤+甲强龙干预组 （甲强龙组）。每组12只。在大鼠脊髓损伤后24 h将损伤的脊髓组织切取，进行逆转录PCR反应。检测GDPA的表达。
1.2 手术方法 腹部消毒后腹腔内注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，腰背部备皮消毒，充分暴露T8～9脊髓腰膨大。采用改良的Allen打击法（5 g×5 cm）制作脊髓损伤模型，甲强龙组大鼠静脉注射甲基强的松龙（30 mg/kg），假手术组未做任何处理关闭切口，创伤组大鼠静脉内注射等量的0.9%氯化钠溶液。24 h后切除脊髓损伤部位上下1 cm的脊髓组织切取，进行RT-PCR反应。 1.3 逆转录PCR反应
1.3.1 脊髓神经细胞总的RNA使用Trizol液提取 1 ml Trizol液中加入1 g组织，反复吹打数次。混合均匀后加入0.2 ml氯仿，并予以离心（12 500 r/min，10 min）。吸取上部清液，加入0.5 ml异丙醇，离心（12 500 r/min，10 min）。
沉淀物加入30 μl DEPC溶化。
1.3.2 RNA定量和鉴定 紫外分光光度计定量RNA，计算OD260、OD280及比值。取总RNA3 μg，电泳（琼脂糖凝胶）30 min，使用紫外光显示28 s及18 s两条rRNA带，说明RNA提取完整性好。
1.3.3 以Vector NTI Suite软件设计检测引物 引物序列：正义：5’TTGCGTGCTGCTATAGTGG 3’，反义：
5’ ACTGCGCCACGAATTTGGG 3’，扩增产物长度：
254bp。β-Actin检测引物序列如下：正义：5’ GGGCAATGG
TCAGTAGGAT 3’（176-196），反义：5’ CAGTGTGTGACGAG
TCCGT 3’（277-257）。扩增长度为264 bp。
1.3.4 用One-tube RT-PCR system（Roche公司）进行一步法反转录和扩增。
1.4 取5 μl PCR扩增产物电泳，扫描DNA密度，分析基因表达的相对丰度。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件在计算机上进行分析。计量资料以（x±s）表示，两组间采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
假手术组GDPA的mRNA的表达的相对丰度为1.5403±0.1604；脊髓损伤24 h后创伤组GDPA的表达的相对丰度为0.5994±0.3414，与假手术组相比差异有非常显著统计学意义（P<0.01）；GDPA在脊髓损伤后使用甲强龙干预组中的表达相对丰度为1.8432±0.1294，與创伤组比较差异有非常显著统计学意义（P<0.01）。表明大剂量甲基强的松龙的早期使用能促进脊髓损伤后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达恢复，发挥细胞保护作用。（表1，图1）。β-Actin的RT-PCR结果见图2，甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶mRNA的RT-PCR结果见图3。
表1 脊髓损伤后24 h二肽氨基肽酶表达情况（x±s）
组别 表达相对丰度
假手术组 1.5403±0.1604
创伤组 0.5994±0.3414
甲强龙组 1.8432±0.1294
图1 GPDA表达的相对丰度
图2 β-Actin的RT-PCR结果
图3 甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶mRNA的RT-PCR结果
注：M1： 50bp ladder， sangon 公司产品；M2： DL-2000 marker， Takara公司产品
3 讨论
外伤后脊髓的功能完全恢复的可能性是比较小的，在受到外伤后很短时间内就会发生继发性的损伤，所以给予早期保护治疗非常的重要。甲基强地松龙为激素类药物，其可对此疾病进行治疗，现今多应用于急性脊髓损伤的早期治疗。
早在1966年，Hopsu-Havu等[3]发现甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶。而后多位专家经过分析证明了该酶的活性[4]。为了探索其他哺乳动物组织中是否含有此酶， 他们首先以鼠肝为样品进行了研究，同样证实在鼠肝和鼠肾中都存在这种新的二肽氨基肽酶，即现在所称的GPDA[5-6]。
文中建立的模型应用打击法，造成模型脊髓损伤，此模型和人体受到外伤的情况比较相似，相关性比较好。本研究发现脊髓组织有甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达，脊髓损伤24 h后，甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达显著降低，大剂量甲基强的松龙能促进甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达，到达治疗效果。
参考文献
[1] Park S J，Oh I S，Kwon J Y，et al.The effect of irradiation and methylprednisolone in spinal cord injured rats[J].Spine，2011，36（6）：434-440.
[2] Hall E D.Antioxidant therapies for acute spinal cord injury[J].Neurotherapeutics，2011，8（2）：152-167.
[3] Hopsu-Havu V K，Glenner G G.A new dipeptide naphthylamidase hydrolyzing glycyl-prolyl-beta-naphthylamide[J].Histochemie，1966，7（3）：197-201.
[4] Liu H D，Ni R Z，Xiao M B，et al.Clinical significance of serum GPDA-F determined by immunoelectrophoresis in diagnosis of hepatocellular carcinoma[J].Immunology，2006，5（2）：247-249.
[5] Thompson Coon J，Rogers G，Hewson P，et al.Surveillance of cirrhosis for hepatocellular carcinoma：systematic review and economic analysis[J].Health Technol Assess，2007，11（34）：201-206.
[6] Stammers A T，Liu J，Kwon B K.Expression of inflammatory cytokines following acute spinal cord injury in a rodent model[J].J Neurosci Res，2012，90（4）：782-790.
（收稿日期：2012-08-07） （本文编辑：连胜利）