【摘 要】
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【背景】由于碳青霉烯类药物的泛用和滥用，致使肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株与日俱增，产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。目前对肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株的检测方法存在费时费力、特异性差、灵敏度低等问题。【目的】建立一种能同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯酶基因blaKPC的双重芯片式数字PCR方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的特有基因yhaI和碳青霉烯耐药基因blaKPC保守序列设计特
【机 构】
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上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室
【基金项目】
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国家重点研发计划（2018YFE0102400）； 上海交通大学决策咨询课题；
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【背景】由于碳青霉烯类药物的泛用和滥用，致使肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株与日俱增，产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。目前对肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株的检测方法存在费时费力、特异性差、灵敏度低等问题。【目的】建立一种能同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯酶基因blaKPC的双重芯片式数字PCR方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的特有基因yhaI和碳青霉烯耐药基因blaKPC保守序列设计特异性引物和探针，确定双重芯片式数字PCR同时对yhaI和blaKPC两个基因核酸浓度绝对定量的检测范围、检出限和最佳实验体系，并进行了方法特异性、灵敏度、重复性分析及临床菌株的检测。【结果】双重芯片式数字PCR检测灵敏度比双重实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级，在两基因同时检出的情况下，最低检出限分别为3.74 copies/μL （yhaI基因）和1.93 copies/μL (blaKPC基因)；优化后的双重芯片式数字PCR对参考菌株检测特异性的结果与双重实时荧光定量PCR结果一致；利用优化后的双重芯片式数字PCR方法共检测58株临床菌株，其中肺炎克雷伯菌43株，属肺炎克雷伯菌且含有blaKPC基因的菌株13株，这与质谱及耐药谱检测结果一致。【结论】利用双重芯片式数字PCR技术建立了产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的绝对定量检测方法。该方法特异性强、灵敏度高、准确度好，可用于检测具有碳青霉烯酶基因blaKPC的肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析，也为产其他类型碳青霉烯酶的病原菌检测提供新的技术参考。
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