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[摘要]目的：探讨麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的物质基础。方法：通过比较麻黄附子细辛汤、给药后含药血清和空白血清的LC-MS/Ms图谱，寻找麻黄附子细辛汤的入血成分；ELISA法测定各时间点含药血清对抗原刺激RBL-2H3细胞释放组胺、氨基己糖苷酶的影响；MTT法测定各时间点含药血清对脂多糖诱导小鼠脾细胞增殖的影响，并对相关指标进行回归分析。结果：灌胃给予麻黄附子细辛汤后，从大鼠血清中发现32个成分，其中27个原型成分，其他5个未知成分。与空白血清相比，麻黄附子细辛汤各时间点含药血清均能降低抗原诱导RBL-2H3细胞释放组胺（P<0.05）；除麻黄附子细辛汤4h含药血清外，其余各时间点含药血清均能抑制抗原诱导的R BL-2H3细胞脱颗粒（P<0.05）；麻黄附子细辛汤15，30min含药血清能显著抑制脂多糖诱导的小鼠脾细胞增殖（P<0.05）。结论：甲基伪麻黄碱、伪庥黄碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头原碱等成分可能为麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的部分物质基础。
[关键词]麻黄附子细辛汤 血清药物化学 血清药理学 抗炎 免疫抑制
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]2095-3089（2017）12-0029-02
麻黄附子细辛汤为张仲景《伤寒论》中的经典名方，由麻黄、附子、细辛3味中药组成。相关临床实践及研究表明，该方在治疗过敏性鼻炎方面，具有显著的疗效，且安全可靠、副作用小、疗效持久。其药理是通过抑制肥大细胞和巨噬细胞释放炎症介质，发挥抗炎作用，能提高降低抗体活性及激活免疫保护作用。本研究拟运用血清药物化学和血清药理学相结合的方法，研究麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的物质基础，旨在为将其开发成预防和治疗过敏性鼻炎新制剂，提供一定的实验依據与参考。
一、材料与方法
（一）材料
1.药物与试剂。所用的药物有麻黄、制附子、细辛，均为本院提供的正品。另有辛芩颗粒、醋酸泼尼松片等。
2.动物。Wistar大鼠，雌雄各半，体重（200±20）g，雌雄各半，体重18-22g，SPF级。适应性饲养3d后，开始用于实验。
3.细胞林。大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株RBL-2H3。
4.仪器。CO2培养箱、倒置显微镜、多功能酶标仪、800B离心机等。
（二）方法
先制备麻黄附子细辛汤，滤液浓缩至1.80g-mL-1生药量。再制备含药血清和空白血清的麻黄附子细辛汤。同时，制备体内、外供试品溶液。采用色谱条件和质谱条件进行分析。第四，麻黄附子细辛汤含药血清的抗炎作用研究含药血清对抗原诱导。研究麻黄附子细辛汤含药血清的免疫作用。制备小鼠脾细胞悬液，分析含药血清对脂多糖（LPS）诱导小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。
（三）统计分析
所有数据用表示，采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析。如方差齐，组间两两比较采用LSD法；如方差不齐，组间两两比较采用Dunnett’sT3，亿P<0.05为有差异性显著。采用SPSS20.0统计软件进行线性回归分析（linear regression）。
二、结果
（一）LC-MS/Ms分析体内外麻黄附子细辛汤成分
含药血清与空白血清比较，含药血清中发现32个移行成分，其中27个为原型成分，其他5个为未知成分。见图l。
（二）麻黄附子细辛汤含药血清对抗原诱导
麻黄附子细辛汤各时间点含药血清，均能抑制抗原诱导的RBL-2H3肥大细胞释放组胺（P<0.05）。但不同时间点的强度不同。麻黄附子细辛汤2h含药血清抑制抗原诱导的R BL-2H3肥大细胞释放组胺强度，显著优于15，30min，6h含药血清组。
（三）麻黄附子细辛汤含药血清对抗原诱导
与空白血清组相比，除麻黄附子细辛汤4h含药血清外，其余各时间点含药血清均能抑制抗原诱导的RBL-2H3肥大细胞释放β-氨基已糖苷酶（P<0.05）。不同时间点的β-氨基已糖苷酶强度不同。
（四）麻黄附子细辛汤含药血清对脂多糖（LPS）诱导
与空白血清组相比，麻黄附子细辛汤15，30min含药血清组能显著抑制脂多糖诱导的小鼠脾细胞增殖（P<0.05）；麻黄附子细辛汤1，2，4，6h含药血清组抑制脂多糖诱导的小鼠脾细胞增殖效果不明显，差异无统计学意义。麻黄附子细辛汤15min含药血清组与30min含药血清组之间的差异无统计学意义。
（五）血清药物化学与血清药理学指标相关性分析
在被引入回归方程的9个色谱峰中，P31为细辛中的一个未定性成分、P32为麻黄中的一个未定性成分、P8为甲基伪麻黄碱、P6为伪麻黄碱、P13为次乌头原碱、P22为苯甲酰次乌头原碱、P20为苯甲酰乌头原碱、P18为14-苯甲酰-10-羟基-中乌头原碱、P10为新乌头原碱。
三、讨论
血清药物化学、血清药理学在研究中药药效物质基础及药理作用机制方面，日渐显示出重要作用。二者结合既能深入研究入血成分，实现快速、准确地研究中药药效物质基础，体现中药多成分多靶点协同发挥药效作用特点。在本研究中，血清药物化学和血清药理学指标性成分相关性分析表明，与抗炎指标相关的主要为未定性成分P32（麻黄）、未定性成分P31（细辛）、甲基伪麻黄碱、伪麻黄碱，且呈现负相关，说明这4个成分的血药含量增高，抗炎作用增强，且这4个成分主要来源于麻黄与细辛，这与文献报道一致；发现麻黄类生物碱中副作用最大的麻黄碱未被引入回归方程。次乌头原碱与抗炎指标成正相关，机制尚不清楚。与免疫指标相关的主要为附子的生物碱成分，苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头原碱，呈现正相关，说明这3个成分的血药含量增高，免疫抑制作用增强。这与文献报道附子生物碱具免疫抑制作用一致。14-苯甲酰-10-羟基-中乌头原碱与免疫指标呈现负相关，机制尚不清楚。本文后续实验将对各化学成分作进行一步的结构确认，并对推测的药效物质进行细胞实验和整体动物实验验证。
[关键词]麻黄附子细辛汤 血清药物化学 血清药理学 抗炎 免疫抑制
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]2095-3089（2017）12-0029-02
麻黄附子细辛汤为张仲景《伤寒论》中的经典名方，由麻黄、附子、细辛3味中药组成。相关临床实践及研究表明，该方在治疗过敏性鼻炎方面，具有显著的疗效，且安全可靠、副作用小、疗效持久。其药理是通过抑制肥大细胞和巨噬细胞释放炎症介质，发挥抗炎作用，能提高降低抗体活性及激活免疫保护作用。本研究拟运用血清药物化学和血清药理学相结合的方法，研究麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的物质基础，旨在为将其开发成预防和治疗过敏性鼻炎新制剂，提供一定的实验依據与参考。
一、材料与方法
（一）材料
1.药物与试剂。所用的药物有麻黄、制附子、细辛，均为本院提供的正品。另有辛芩颗粒、醋酸泼尼松片等。
2.动物。Wistar大鼠，雌雄各半，体重（200±20）g，雌雄各半，体重18-22g，SPF级。适应性饲养3d后，开始用于实验。
3.细胞林。大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株RBL-2H3。
4.仪器。CO2培养箱、倒置显微镜、多功能酶标仪、800B离心机等。
（二）方法
先制备麻黄附子细辛汤，滤液浓缩至1.80g-mL-1生药量。再制备含药血清和空白血清的麻黄附子细辛汤。同时，制备体内、外供试品溶液。采用色谱条件和质谱条件进行分析。第四，麻黄附子细辛汤含药血清的抗炎作用研究含药血清对抗原诱导。研究麻黄附子细辛汤含药血清的免疫作用。制备小鼠脾细胞悬液，分析含药血清对脂多糖（LPS）诱导小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。
（三）统计分析
所有数据用表示，采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析。如方差齐，组间两两比较采用LSD法；如方差不齐，组间两两比较采用Dunnett’sT3，亿P<0.05为有差异性显著。采用SPSS20.0统计软件进行线性回归分析（linear regression）。
二、结果
（一）LC-MS/Ms分析体内外麻黄附子细辛汤成分
含药血清与空白血清比较，含药血清中发现32个移行成分，其中27个为原型成分，其他5个为未知成分。见图l。
（二）麻黄附子细辛汤含药血清对抗原诱导
麻黄附子细辛汤各时间点含药血清，均能抑制抗原诱导的RBL-2H3肥大细胞释放组胺（P<0.05）。但不同时间点的强度不同。麻黄附子细辛汤2h含药血清抑制抗原诱导的R BL-2H3肥大细胞释放组胺强度，显著优于15，30min，6h含药血清组。
（三）麻黄附子细辛汤含药血清对抗原诱导
与空白血清组相比，除麻黄附子细辛汤4h含药血清外，其余各时间点含药血清均能抑制抗原诱导的RBL-2H3肥大细胞释放β-氨基已糖苷酶（P<0.05）。不同时间点的β-氨基已糖苷酶强度不同。
（四）麻黄附子细辛汤含药血清对脂多糖（LPS）诱导
与空白血清组相比，麻黄附子细辛汤15，30min含药血清组能显著抑制脂多糖诱导的小鼠脾细胞增殖（P<0.05）；麻黄附子细辛汤1，2，4，6h含药血清组抑制脂多糖诱导的小鼠脾细胞增殖效果不明显，差异无统计学意义。麻黄附子细辛汤15min含药血清组与30min含药血清组之间的差异无统计学意义。
（五）血清药物化学与血清药理学指标相关性分析
在被引入回归方程的9个色谱峰中，P31为细辛中的一个未定性成分、P32为麻黄中的一个未定性成分、P8为甲基伪麻黄碱、P6为伪麻黄碱、P13为次乌头原碱、P22为苯甲酰次乌头原碱、P20为苯甲酰乌头原碱、P18为14-苯甲酰-10-羟基-中乌头原碱、P10为新乌头原碱。
三、讨论
血清药物化学、血清药理学在研究中药药效物质基础及药理作用机制方面，日渐显示出重要作用。二者结合既能深入研究入血成分，实现快速、准确地研究中药药效物质基础，体现中药多成分多靶点协同发挥药效作用特点。在本研究中，血清药物化学和血清药理学指标性成分相关性分析表明，与抗炎指标相关的主要为未定性成分P32（麻黄）、未定性成分P31（细辛）、甲基伪麻黄碱、伪麻黄碱，且呈现负相关，说明这4个成分的血药含量增高，抗炎作用增强，且这4个成分主要来源于麻黄与细辛，这与文献报道一致；发现麻黄类生物碱中副作用最大的麻黄碱未被引入回归方程。次乌头原碱与抗炎指标成正相关，机制尚不清楚。与免疫指标相关的主要为附子的生物碱成分，苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头原碱，呈现正相关，说明这3个成分的血药含量增高，免疫抑制作用增强。这与文献报道附子生物碱具免疫抑制作用一致。14-苯甲酰-10-羟基-中乌头原碱与免疫指标呈现负相关，机制尚不清楚。本文后续实验将对各化学成分作进行一步的结构确认，并对推测的药效物质进行细胞实验和整体动物实验验证。