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摘 要：该文建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定葡萄中4种植物生长调节剂的方法。样品经乙腈提取，WAX小柱净化，采用BEH C18色谱柱分离，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱。采用电喷雾离子化，负离子分段扫描和多反应监测模式（MRM）检测，外标法定量。结果表明：赤霉素、对氯苯氧乙酸、氯吡脲、2，4-二氯苯氧乙酸在1～200ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.990；4种植物生长调节剂的方法检出限均为0.2μg/kg，方法定量限为0.5μg/kg，样品添加回收试验的平均回收率为74.8%～101.5%，相对标准偏差为3.3%～8.6%（n=7）。该方法简单、灵敏度高、分析时间短，适用于葡萄中4植物生长调节剂的测定。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱；植物生长调节剂；葡萄
中图分类号 S66 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）10-33-03
Abstract：A method was established for determining 4 plant growth regulator residues in grapes by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.Samples were extracted with acetonitrile，and cleaned up on a WAX cartridge.The target analytes were separated on a BEH C18 column with gradient elution using a mobile phase made up of acetonitrile and water.The samples were detected under negative multiple reactions monitoring（MRM）mode through polarity switching between time segments.The result showed that the linearities of gibberellic acid，4-chlorophenoxyaceticacid，forchlorfenuron，and 2，4-dichlorophenoxyacetic were in the concentration range of 1ng/mL～200ng/mL，with the correlation coefficients higher than 0.990.The limits of detection（LOD）and the limits of quantitation（LOQ）of the method were 0.2μg/kg and 0.5μg/kg.The average spiked recovery rates were in the range of 74.8%～101.5%.The result showed that the relative standard deviation（RSD，n=7）was 3.3%～8.6%.The method proved to be simple，sensitive，rapid and suitable for the determination of 4 plant growth regulator residues in grapes.
Key words：Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；Plant growth regulator；Grapes
植物生長调节剂（Plant growth regulator，PGRs）是一种能提高农产品产量和品质的激素[1]，主要用于葡萄、猕猴桃、番茄、棉花等，人体如果摄入大量的植物生长调节剂，会引成腹泻、免疫力下降等危害，甚至致畸、致癌、致突变等严重后果[2]。近年来，随着植物生长调节剂在水果、蔬菜等农产品中的广泛和大量使用，其危害性已经引起了全社会民众的关注。
目前检测植物生长调节剂残留的常用方法有高效液相色谱法[3]、气质联用法[4]和液质联用法[5-6]。液相色谱法由于抗干扰能力差，存在一定的假阳性；气质联用前处理较为复杂，检测时间较长；液质联用法对于物质的分析从结构上进行确认，大大降低了假阳性，而且前处理方法简单、时间短，适用于多组分快速检测。为此，本研究采用超高效液相色谱-串联质谱技术同时测定了葡萄中4种植物生长调节剂的残留量。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 乙腈（HPLC级，德国MERCK公司）；甲醇（HPLC级，德国CNW公司）；WAX小柱（60mg/3mL 美国Waters公司）；氯化钠、乙酸乙酯为分析纯；超纯水；4种植物生长调节剂标准品：赤霉素（gibberellic acid，GA3）、对氯苯氧乙酸（4-chlorophenoxyaceticacid 4-CPA）、氯吡脲（forchlorfenuron）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic），纯度均大于96%（德国Dr.Ehrenstorfer）。
1.2 仪器与设备 Waters Xevo TQ-MS 液质联用仪（美国Waters公司）；高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；氮吹仪（美国Organomation公司）；旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；匀浆机（德国IKA公司）；超纯水仪（成都超纯科技有限公司）；超声仪KQ-600DE（江苏昆山市超声仪器公司）。 1.3 仪器参数
1.3.1 色谱条件 BEHC18色谱柱（2.1×100mm，粒径1.7μm），柱温30℃，进样体积5μL，流动相为水-乙腈（梯度洗脱），流速为0.4mL/min。
1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源，负离子电离（ESI-），脱溶剂气800L/h，干燥气温度400℃，锥孔气50L/h，离子源温度150℃。在分析过程中，以离子对（1母离子和2个子离子）信息比较进行定性分析，以母离子和响应值最高的子离子进行定量分析。
1.4 样品处理 取2g样品于50mL离心管中，加入10mL乙腈提取液，涡旋1min，超声提取10min，加入3g氯化钠，涡旋混匀，离心后，取上清液于另一支离心管中，再加入10mL乙腈提取液，重复上述操作，合并提取液，在45℃条件下浓缩至近干，加5mL水溶解残渣，涡旋。WAX小柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，将上述5mL溶解液上样，依次用3mL水和3mL 2%的甲酸溶液淋洗，抽至近干后，分别用3.0mL甲醇和3.0mL 5%的氨化甲醇溶液洗脱，于45℃条件下氮吹至干，再加l.0mL乙腈-水（10∶90，V/V）溶解，涡旋混合1min，过0.22μm滤膜后，供UPLC-MS/MS分析。
1.5 标准曲线及检出限 4种植物生长调节剂标准溶液的配制：分别精密称取赤霉素、对氯苯氧乙酸、氯吡脲和2，4-二氯苯氧乙酸标准品适量于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解稀释成浓度为1.00mg/mL的标准储备液，量取标准储备液适量，再逐步稀释成工作液。在选定的色谱条件和质谱条件下测定，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，分别得到4种植物生长调节剂的线性方程和相关系数。计算3倍信噪时所对应的样品浓度作为方法的检出限，10倍信噪时所对应的样品浓度作为方法的定量限。
1.6 方法回收率及精密度实验 采用对阴性样品进行加标回收试验来确定方法的准确度和精密度，即对本底不含植物生长调节剂的阴性葡萄样品，分别添加3个水平的4种植物生长调节剂标准溶液，按照1.4项下进行样品前处理，在1.3.1项下的色谱条件和1.3.2项下的质谱条件下测定，计算样品加标回收率。每个添加水平连续重复进样7次，测得各组分的峰面积，计算其相对标准偏差（RSD）。
2 结果与分析
2.1 提取条件的选择 比较了乙腈、甲醇、乙酸乙酯作为提取溶剂对葡萄中4种植物生长调节剂的提取效率，结果表明，乙腈和甲醇对4种植物生长调节剂的提取效率要高于乙酸乙酯。而由于样品本身含水量较高，以甲醇作为提取剂时，要用大量除水剂去除样品中的水分；用乙腈作为提取剂时，则只需要在提取后加入少量氯化钠，就可以使乙腈和水相分离，因此选择乙腈作为提取溶剂。
2.2 色谱条件的选择 将甲醇和乙腈分别作为有机流动相进行比较，结果表明，乙腈灵敏度要高于甲醇；同时比较了定容液的组成对各个组分的影响，结果表明，当乙腈和水体积比为2∶8时，各组分达到最大响应值，故选择乙腈和水体积比为2∶8作为最后上机定容溶液。
2.3 线性相关性 在上述优化后的条件下，对4种植物生长调节剂分别进行了标准品（见图1）和加标回收实验（见图2）分析，采用外标法定量，在上述仪器条件下进行测定，以MS/MS定量离子色谱峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线，并求出相应的线性回归方程及相关系数，4种植物生长调节剂在相应的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比计算分别得到4种植物生长调节剂的检出限和定量限，结果见表2。由表2可知，4种植物生长调节剂的检出限均为0.2μg/kg，定量限均为0.5μg/kg。
2.4 方法的准确度和精密度 按照1.6方法进行回收率和精密度实验（见表3），计算加标回收率和相对标准偏差。由表3可以看出，样品在3个添加水平下4种植物生长调节剂的回收率在74.8%～101.5%，相对标准偏差在3.3%～8.6%。上述结果表明，运用本方法得到的数据是准确可靠的。结合前面所述的方法检出限低的特点可知，本方法能够从根本上消除检测结果出现假阴性的可能性。
3 结论
本文通过对提取条件和质谱条件的优化，建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定葡萄中4种植物生长调节剂残留量的方法，该方法前处理简单、灵敏度高，线性关系、准确度和精密度良好，能满足葡萄中4种植物生长调节剂残留限量要求，方法适应性良好。
参考文献
[1]Giannakoula A E，Ilias I F，Maksimovic J J D，et al.The effects of plant growth regulators on growth，yield，and phenolic profile of lentil plants[J].J Food Compos Anal，2012，28：46-53.
[2]吴凤琪，靳保辉，陈波，等.水果中8种外源性植物生长调节剂的液相色谱-串联质谱测定[J].中国农学通报，2010，26（15）：115-119.
[3]张慧荣，周围，王波，等.UPLC法测定苹果中4种新型植物生长调节剂农药残留[J].分析实验室，2014，33（9）：1097-1100.
[4]徐宜宏，蔣施，付海滨，等.气相色谱-质谱法同时测定树莓中6种农药的残留[J].农药，2014，53（2）：113-115.
[5]牟艳莉，郭德华，丁卓平.高效液相色谱-串联质谱法检测瓜果中的4种植物生长调节剂的残留量[J].色谱，2013，31（10）：1016-1020.
[6]王静静，鹿毅，杨涛，等.HPLC-MS/MS法同时测定果蔬中6种植物生长抑制剂残留[J].分析测试学报，2011，30（2）：128-134.
（责编：张宏民）
关键词：超高效液相色谱-串联质谱；植物生长调节剂；葡萄
中图分类号 S66 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）10-33-03
Abstract：A method was established for determining 4 plant growth regulator residues in grapes by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.Samples were extracted with acetonitrile，and cleaned up on a WAX cartridge.The target analytes were separated on a BEH C18 column with gradient elution using a mobile phase made up of acetonitrile and water.The samples were detected under negative multiple reactions monitoring（MRM）mode through polarity switching between time segments.The result showed that the linearities of gibberellic acid，4-chlorophenoxyaceticacid，forchlorfenuron，and 2，4-dichlorophenoxyacetic were in the concentration range of 1ng/mL～200ng/mL，with the correlation coefficients higher than 0.990.The limits of detection（LOD）and the limits of quantitation（LOQ）of the method were 0.2μg/kg and 0.5μg/kg.The average spiked recovery rates were in the range of 74.8%～101.5%.The result showed that the relative standard deviation（RSD，n=7）was 3.3%～8.6%.The method proved to be simple，sensitive，rapid and suitable for the determination of 4 plant growth regulator residues in grapes.
Key words：Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；Plant growth regulator；Grapes
植物生長调节剂（Plant growth regulator，PGRs）是一种能提高农产品产量和品质的激素[1]，主要用于葡萄、猕猴桃、番茄、棉花等，人体如果摄入大量的植物生长调节剂，会引成腹泻、免疫力下降等危害，甚至致畸、致癌、致突变等严重后果[2]。近年来，随着植物生长调节剂在水果、蔬菜等农产品中的广泛和大量使用，其危害性已经引起了全社会民众的关注。
目前检测植物生长调节剂残留的常用方法有高效液相色谱法[3]、气质联用法[4]和液质联用法[5-6]。液相色谱法由于抗干扰能力差，存在一定的假阳性；气质联用前处理较为复杂，检测时间较长；液质联用法对于物质的分析从结构上进行确认，大大降低了假阳性，而且前处理方法简单、时间短，适用于多组分快速检测。为此，本研究采用超高效液相色谱-串联质谱技术同时测定了葡萄中4种植物生长调节剂的残留量。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 乙腈（HPLC级，德国MERCK公司）；甲醇（HPLC级，德国CNW公司）；WAX小柱（60mg/3mL 美国Waters公司）；氯化钠、乙酸乙酯为分析纯；超纯水；4种植物生长调节剂标准品：赤霉素（gibberellic acid，GA3）、对氯苯氧乙酸（4-chlorophenoxyaceticacid 4-CPA）、氯吡脲（forchlorfenuron）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic），纯度均大于96%（德国Dr.Ehrenstorfer）。
1.2 仪器与设备 Waters Xevo TQ-MS 液质联用仪（美国Waters公司）；高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；氮吹仪（美国Organomation公司）；旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；匀浆机（德国IKA公司）；超纯水仪（成都超纯科技有限公司）；超声仪KQ-600DE（江苏昆山市超声仪器公司）。 1.3 仪器参数
1.3.1 色谱条件 BEHC18色谱柱（2.1×100mm，粒径1.7μm），柱温30℃，进样体积5μL，流动相为水-乙腈（梯度洗脱），流速为0.4mL/min。
1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源，负离子电离（ESI-），脱溶剂气800L/h，干燥气温度400℃，锥孔气50L/h，离子源温度150℃。在分析过程中，以离子对（1母离子和2个子离子）信息比较进行定性分析，以母离子和响应值最高的子离子进行定量分析。
1.4 样品处理 取2g样品于50mL离心管中，加入10mL乙腈提取液，涡旋1min，超声提取10min，加入3g氯化钠，涡旋混匀，离心后，取上清液于另一支离心管中，再加入10mL乙腈提取液，重复上述操作，合并提取液，在45℃条件下浓缩至近干，加5mL水溶解残渣，涡旋。WAX小柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，将上述5mL溶解液上样，依次用3mL水和3mL 2%的甲酸溶液淋洗，抽至近干后，分别用3.0mL甲醇和3.0mL 5%的氨化甲醇溶液洗脱，于45℃条件下氮吹至干，再加l.0mL乙腈-水（10∶90，V/V）溶解，涡旋混合1min，过0.22μm滤膜后，供UPLC-MS/MS分析。
1.5 标准曲线及检出限 4种植物生长调节剂标准溶液的配制：分别精密称取赤霉素、对氯苯氧乙酸、氯吡脲和2，4-二氯苯氧乙酸标准品适量于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解稀释成浓度为1.00mg/mL的标准储备液，量取标准储备液适量，再逐步稀释成工作液。在选定的色谱条件和质谱条件下测定，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，分别得到4种植物生长调节剂的线性方程和相关系数。计算3倍信噪时所对应的样品浓度作为方法的检出限，10倍信噪时所对应的样品浓度作为方法的定量限。
1.6 方法回收率及精密度实验 采用对阴性样品进行加标回收试验来确定方法的准确度和精密度，即对本底不含植物生长调节剂的阴性葡萄样品，分别添加3个水平的4种植物生长调节剂标准溶液，按照1.4项下进行样品前处理，在1.3.1项下的色谱条件和1.3.2项下的质谱条件下测定，计算样品加标回收率。每个添加水平连续重复进样7次，测得各组分的峰面积，计算其相对标准偏差（RSD）。
2 结果与分析
2.1 提取条件的选择 比较了乙腈、甲醇、乙酸乙酯作为提取溶剂对葡萄中4种植物生长调节剂的提取效率，结果表明，乙腈和甲醇对4种植物生长调节剂的提取效率要高于乙酸乙酯。而由于样品本身含水量较高，以甲醇作为提取剂时，要用大量除水剂去除样品中的水分；用乙腈作为提取剂时，则只需要在提取后加入少量氯化钠，就可以使乙腈和水相分离，因此选择乙腈作为提取溶剂。
2.2 色谱条件的选择 将甲醇和乙腈分别作为有机流动相进行比较，结果表明，乙腈灵敏度要高于甲醇；同时比较了定容液的组成对各个组分的影响，结果表明，当乙腈和水体积比为2∶8时，各组分达到最大响应值，故选择乙腈和水体积比为2∶8作为最后上机定容溶液。
2.3 线性相关性 在上述优化后的条件下，对4种植物生长调节剂分别进行了标准品（见图1）和加标回收实验（见图2）分析，采用外标法定量，在上述仪器条件下进行测定，以MS/MS定量离子色谱峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线，并求出相应的线性回归方程及相关系数，4种植物生长调节剂在相应的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比计算分别得到4种植物生长调节剂的检出限和定量限，结果见表2。由表2可知，4种植物生长调节剂的检出限均为0.2μg/kg，定量限均为0.5μg/kg。
2.4 方法的准确度和精密度 按照1.6方法进行回收率和精密度实验（见表3），计算加标回收率和相对标准偏差。由表3可以看出，样品在3个添加水平下4种植物生长调节剂的回收率在74.8%～101.5%，相对标准偏差在3.3%～8.6%。上述结果表明，运用本方法得到的数据是准确可靠的。结合前面所述的方法检出限低的特点可知，本方法能够从根本上消除检测结果出现假阴性的可能性。
3 结论
本文通过对提取条件和质谱条件的优化，建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定葡萄中4种植物生长调节剂残留量的方法，该方法前处理简单、灵敏度高，线性关系、准确度和精密度良好，能满足葡萄中4种植物生长调节剂残留限量要求，方法适应性良好。
参考文献
[1]Giannakoula A E，Ilias I F，Maksimovic J J D，et al.The effects of plant growth regulators on growth，yield，and phenolic profile of lentil plants[J].J Food Compos Anal，2012，28：46-53.
[2]吴凤琪，靳保辉，陈波，等.水果中8种外源性植物生长调节剂的液相色谱-串联质谱测定[J].中国农学通报，2010，26（15）：115-119.
[3]张慧荣，周围，王波，等.UPLC法测定苹果中4种新型植物生长调节剂农药残留[J].分析实验室，2014，33（9）：1097-1100.
[4]徐宜宏，蔣施，付海滨，等.气相色谱-质谱法同时测定树莓中6种农药的残留[J].农药，2014，53（2）：113-115.
[5]牟艳莉，郭德华，丁卓平.高效液相色谱-串联质谱法检测瓜果中的4种植物生长调节剂的残留量[J].色谱，2013，31（10）：1016-1020.
[6]王静静，鹿毅，杨涛，等.HPLC-MS/MS法同时测定果蔬中6种植物生长抑制剂残留[J].分析测试学报，2011，30（2）：128-134.
（责编：张宏民）