论文部分内容阅读
摘要：目的 建立用丙基酰胺色谱柱检测硫酸锌尿囊素滴眼液中尿囊素含量。方法 色谱柱以丙基酰胺键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（90：10）作为流动相；检测波长为191 nm；进样量：10 μl。结果 辅料峰与尿囊素峰完全分离；线性范围为10μg/L～40μg/L，r2=0.9999，（n=7）；回收率为99.9%，RSD为0.3%，（n=9）；重复测得130801批试制样品硫酸锌尿囊素滴眼液尿囊素含量为标示量的的100.5%，RSD为0.2%（n=9）。结论 本方法专属性、精密度及准确度良好，可用于检测硫酸锌尿囊素滴眼液中尿囊素含量。
关键词：丙基酰胺色谱柱；硫酸锌尿囊素滴眼液；尿囊素；含量测定
【分类号】：R927.2
硫酸锌尿囊素滴眼液用于慢性结膜炎、眦部睑缘炎、春季结膜炎、沙眼等眼科疾病。其质量标准收载于《化学药品地方标准上升国家标准》第三册，该标准采用紫外可见分光光度法测定尿囊素含量，专属性及精密度较差，笔者采用HPLC法用丙基酰胺色谱柱检测硫酸锌尿囊素滴眼液中尿囊素含量。
1 仪器与试药：岛津LC-20AD液相色谱仪，二极管阵列检测器，Venusil HILIC 5μm 100A 4.6×250mm色谱柱，岛津AEG-120G电子分析天平；乙腈为色谱纯，水为纯化水；尿囊素对照品为中检院提供，批号为111501-200202，供含量测定用；尿囊素原料为湖南九典制药有限公司生产，批号为201305H01；样品为本公司中试批量样品，批号为130801、130802 、130803 ；阴性对照样品：缺少尿囊素原料，按处方配制而成，批号为130804。
2 方法与验证
2.1 方法
色谱条件及系统适用性试验：色谱柱以丙基酰胺键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（90：10）作为流动相；检测波长为191 nm，柱温为30℃；流速为1ml/min。理论板数按尿囊素峰计算应不低于3000。
测定法 精密量取本品适量，用流动相稀释制成每ml含尿囊素25μg的溶液，作为供试品溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取尿囊素对照品适量，精密称定，同法测定。
2.2 验证
2.2.1 专属性：取130804批阴性对照样品、130801批样品及尿囊素对照品，按以上方法配制为阴性对照溶液、供试品溶液及对照品溶液，各精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1～3。结果：辅料峰不干扰尿囊素峰。专属性良好。
图1 阴性对照溶液
图2 供试品溶液
图3 对照品溶液
2.2.2 线性：精密称取尿囊素对照品适量，用流动相溶解并稀释制成10、15、20、25、30、35、40μg/L的溶液，各精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，制定标准曲线，求得回归方程y = 22109x - 78.964，r2 = 0.9999（n=7）， 可见线性范围为10～40μg/L。
2.2.3 溶液稳定性：分别于0h、1h、2h、3h、5h、8h、12h、24h时，精密量取对照品溶液及供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算尿囊素峰面积的RSD值，结果：供试品溶液的尿囊素峰面积RSD值为0.1%；对照品溶液的尿囊素峰面积RSD值为0.2%。可见溶液在24小时内稳定性良好。
2.2.4 回收率：精密称取对照品适量，用阴性样品溶解并稀释制成每ml含尿囊素对照品0.8g 、1.0mg 、1.2mg 的溶液，各3份，依法测定，计算回收率及RSD。尿囊素的回收率为99.9%，RSD为0.3%（n=9）。
2.2.5 重复性：精密量取130801批样品适量，依法制成每ml含尿囊素为20μg、25μg、30μg的溶液，各3份、依法测定，计算尿囊素含量及RSD。结果测得尿囊素含量为标示量的100.5%，RSD为0.2%（n=9）。
2.2.6 仪器精密度 精密量取对照品溶液及供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，连续重复进样6次，计算尿囊素峰面积的RSD值，结果：供试品溶液的尿囊素峰面积RSD值为0.1%；对照品溶液的尿囊素峰面积RSD值为0.1%。可见仪器精密度良好。
2.2.7 样品检测
精密量取中试三批样品适量，依法测定，计算尿囊素含量及RSD。结果测得130801批、130802批、130803批含量分别为标示量的100.3%、99.7%、99.2%。
3 結论
本方法专属性、精密度、准确度及溶液稳定性良好，可用于检测硫酸锌尿囊素滴眼液中尿囊素含量。
4 讨论
4.1经研究发现，尿囊素的稳定性受溶液pH影响很大，在碱性或中性溶液中（pH6.0～7.0）稳定性差，在偏酸溶液中（pH5.0～5.5）稳定性较好，而目前该品种市面上大多数产品的溶液pH值为pH6.0～7.0，部分产品采用高效液相色谱法测得的含量甚至已经低于下限。硫酸锌尿囊素滴眼液质量标准收载于《化学药品地方标准上升国家标准》第三册，该标准采用紫外可见分光光度法测定尿囊素含量，众所周知，紫外可见分光光度法专属性比高效液相色谱法差，导致采用紫外可见分光光度法测得结果比实际含量偏高，误以为产品稳定性良好。笔者参照缩泉胶囊质量标准[1]中的山药含量测定项的色谱条件对硫酸锌尿囊素滴眼液中的尿囊素进行检测，经验证，该色谱条件可完全分离尿囊素峰和降解峰及辅料峰，专属性更好，更适合用于硫酸锌尿囊素滴眼液中的尿囊素含量测定，测得的结果准确性更高。
4.2 冯炜菁等人曾利用C18色谱柱测定硫酸锌尿囊素滴眼液中的尿囊素含量[2]，经实验证明，尿囊素在C18色谱柱中几乎无保留，故难以确保主峰与辅料峰和杂质峰达到完全分离。尿囊素为强极性化合物，丙基酰胺色谱柱在处理强极性化合物方面比反相C18色谱柱更有优势，按以上色谱条件进行检测，尿囊素峰可与辅料峰和杂质峰达到完全分离，专属性更强。
参考文献：
[1]国药典委员会.缩泉胶囊质量标准.关于2010年版《中国药典》（一部）增补本公示（2013年8月5日）.
[3] 冯炜菁，梁蔚阳.高效液相色谱法测定硫酸锌尿囊素滴眼液中尿囊素的含量[J].中国新药杂志，2008，17[24]：2130～2131.
关键词：丙基酰胺色谱柱；硫酸锌尿囊素滴眼液；尿囊素；含量测定
【分类号】：R927.2
硫酸锌尿囊素滴眼液用于慢性结膜炎、眦部睑缘炎、春季结膜炎、沙眼等眼科疾病。其质量标准收载于《化学药品地方标准上升国家标准》第三册，该标准采用紫外可见分光光度法测定尿囊素含量，专属性及精密度较差，笔者采用HPLC法用丙基酰胺色谱柱检测硫酸锌尿囊素滴眼液中尿囊素含量。
1 仪器与试药：岛津LC-20AD液相色谱仪，二极管阵列检测器，Venusil HILIC 5μm 100A 4.6×250mm色谱柱，岛津AEG-120G电子分析天平；乙腈为色谱纯，水为纯化水；尿囊素对照品为中检院提供，批号为111501-200202，供含量测定用；尿囊素原料为湖南九典制药有限公司生产，批号为201305H01；样品为本公司中试批量样品，批号为130801、130802 、130803 ；阴性对照样品：缺少尿囊素原料，按处方配制而成，批号为130804。
2 方法与验证
2.1 方法
色谱条件及系统适用性试验：色谱柱以丙基酰胺键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（90：10）作为流动相；检测波长为191 nm，柱温为30℃；流速为1ml/min。理论板数按尿囊素峰计算应不低于3000。
测定法 精密量取本品适量，用流动相稀释制成每ml含尿囊素25μg的溶液，作为供试品溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取尿囊素对照品适量，精密称定，同法测定。
2.2 验证
2.2.1 专属性：取130804批阴性对照样品、130801批样品及尿囊素对照品，按以上方法配制为阴性对照溶液、供试品溶液及对照品溶液，各精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1～3。结果：辅料峰不干扰尿囊素峰。专属性良好。
图1 阴性对照溶液
图2 供试品溶液
图3 对照品溶液
2.2.2 线性：精密称取尿囊素对照品适量，用流动相溶解并稀释制成10、15、20、25、30、35、40μg/L的溶液，各精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，制定标准曲线，求得回归方程y = 22109x - 78.964，r2 = 0.9999（n=7）， 可见线性范围为10～40μg/L。
2.2.3 溶液稳定性：分别于0h、1h、2h、3h、5h、8h、12h、24h时，精密量取对照品溶液及供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算尿囊素峰面积的RSD值，结果：供试品溶液的尿囊素峰面积RSD值为0.1%；对照品溶液的尿囊素峰面积RSD值为0.2%。可见溶液在24小时内稳定性良好。
2.2.4 回收率：精密称取对照品适量，用阴性样品溶解并稀释制成每ml含尿囊素对照品0.8g 、1.0mg 、1.2mg 的溶液，各3份，依法测定，计算回收率及RSD。尿囊素的回收率为99.9%，RSD为0.3%（n=9）。
2.2.5 重复性：精密量取130801批样品适量，依法制成每ml含尿囊素为20μg、25μg、30μg的溶液，各3份、依法测定，计算尿囊素含量及RSD。结果测得尿囊素含量为标示量的100.5%，RSD为0.2%（n=9）。
2.2.6 仪器精密度 精密量取对照品溶液及供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，连续重复进样6次，计算尿囊素峰面积的RSD值，结果：供试品溶液的尿囊素峰面积RSD值为0.1%；对照品溶液的尿囊素峰面积RSD值为0.1%。可见仪器精密度良好。
2.2.7 样品检测
精密量取中试三批样品适量，依法测定，计算尿囊素含量及RSD。结果测得130801批、130802批、130803批含量分别为标示量的100.3%、99.7%、99.2%。
3 結论
本方法专属性、精密度、准确度及溶液稳定性良好，可用于检测硫酸锌尿囊素滴眼液中尿囊素含量。
4 讨论
4.1经研究发现，尿囊素的稳定性受溶液pH影响很大，在碱性或中性溶液中（pH6.0～7.0）稳定性差，在偏酸溶液中（pH5.0～5.5）稳定性较好，而目前该品种市面上大多数产品的溶液pH值为pH6.0～7.0，部分产品采用高效液相色谱法测得的含量甚至已经低于下限。硫酸锌尿囊素滴眼液质量标准收载于《化学药品地方标准上升国家标准》第三册，该标准采用紫外可见分光光度法测定尿囊素含量，众所周知，紫外可见分光光度法专属性比高效液相色谱法差，导致采用紫外可见分光光度法测得结果比实际含量偏高，误以为产品稳定性良好。笔者参照缩泉胶囊质量标准[1]中的山药含量测定项的色谱条件对硫酸锌尿囊素滴眼液中的尿囊素进行检测，经验证，该色谱条件可完全分离尿囊素峰和降解峰及辅料峰，专属性更好，更适合用于硫酸锌尿囊素滴眼液中的尿囊素含量测定，测得的结果准确性更高。
4.2 冯炜菁等人曾利用C18色谱柱测定硫酸锌尿囊素滴眼液中的尿囊素含量[2]，经实验证明，尿囊素在C18色谱柱中几乎无保留，故难以确保主峰与辅料峰和杂质峰达到完全分离。尿囊素为强极性化合物，丙基酰胺色谱柱在处理强极性化合物方面比反相C18色谱柱更有优势，按以上色谱条件进行检测，尿囊素峰可与辅料峰和杂质峰达到完全分离，专属性更强。
参考文献：
[1]国药典委员会.缩泉胶囊质量标准.关于2010年版《中国药典》（一部）增补本公示（2013年8月5日）.
[3] 冯炜菁，梁蔚阳.高效液相色谱法测定硫酸锌尿囊素滴眼液中尿囊素的含量[J].中国新药杂志，2008，17[24]：2130～2131.