【摘 要】
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目的 克隆胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因,构建质粒表达载体pIRES-TK,并利用该载体转染ACC-2细胞,建立了稳定表达TK基闪的ACC-2细胞克隆.方法 通过PCR从逆转录病毒重组体pLNSX-TK
【机 构】
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山东大学附属省立医院口腔颌面外科,山东大学附属省立医院科研中心
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目的 克隆胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因,构建质粒表达载体pIRES-TK,并利用该载体转染ACC-2细胞,建立了稳定表达TK基闪的ACC-2细胞克隆.方法 通过PCR从逆转录病毒重组体pLNSX-TK中扩增出TK基因全长序列,将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中,构建重组表达载体pIRES-TK,用电穿孔法以该质粒转染ACC-2细胞,经G418筛选获得稳定表达TK基因的ACC-2细胞株,提取该细胞株的总RNA,用RT-PCR检测TK基因的表达.结果 PCR扩增出1128 bp大小的片段,测序结果与GeneBank报道的TK序列基本一致;阳性重组质粒pIRES-TK经XhoI和MulI双酶切后获得2692 Bb和1128 bp的片段:RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出361 bp的预期片段.结论 成功扩增了TK基因的DNA片段;成功构建了质粒表达载体pIRES-TK:建立了稳定表达TK基因的ACC-2细胞株,为TK/GCV自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定良好的基础.
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