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摘 要：本实验对依托红霉素片中的依托红霉素的测定方法进行研究。方法：采用C18 色谱柱，0.01mol/L十二烷基磺酸钠（含0.2%三乙胺，并用磷酸调节pH值至3.4）-乙腈（60∶40）为流动相，检测波长为205nm，流速为1.0ml/min。依托红霉素在0.5～3.0mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。依托红霉素平均回收率分别为99.3%。结论：本法简便、准确，可用于依托红霉素片中依托红霉素的含量测定。
关键词：依托红霉素片；含量；测定
依托红霉素片属大环内酯类抗生素，对葡萄球菌属、各组链球菌和革兰阳性杆菌均具抗菌活性。本实验采用高效液相色谱法对依托红霉素片含量进行测定。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography ＼ HPLC）又称“高分离度液相色谱”，是色谱法的一个重要分支。1960年中后期以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了高效液相色谱法。高效液相色谱法具有、高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广等特点。本实验对依托红霉素片中的依托红霉素的测定方法进行研究。
1仪器与试药
1.1仪器：ZXTA-20双极反渗透实验室超纯水机（北京卓信博澳仪器有限公司）；FA2004电子天平仪器（上海天平仪器技术有限公司）；HWP-5实验室蒸馏水器（郑州泽铭科技有限公司）；HAD-KQ-300GVDV三频恒温数控超声波清洗器（北京恒奥德仪器仪表有限公司）；赛默飞Spectronic 200可见分光光度计（百道亨仪器设备（北京）有限公司）；WC-52B1精密恒温槽（上海思尔达科学仪器有限公司）；DTA-27多功能静音型台式超声波清洗机（鼎泰（湖北）生化科技设备制造公司）；上海PHS-25台式数显pH计（上海圣科仪器设备有限公司产品）。
1.2色谱柱：迪马C18钻石色谱柱（220 mm×4.6mm，5μm）。
1.3对照品：依托红霉素
1.4试剂：甲醇（武汉强松精细化學品有限公司）、乙腈（永华化学科技（江苏）有限公司）、磷酸（武汉强松精细化学品有限公司）、十二烷基磺酸钠（武汉强松精细化学品有限公司）、三乙胺（武汉强松精细化学品有限公司）、醋酸钠（淄博鑫荣化工科技有限公司）、醋酸铵（淄博鑫荣化工科技有限公司）、氨水（淄博鑫荣化工科技有限公司）、甲酸（武汉强松精细化学品有限公司）、磷酸二氢钾（淄博鑫荣化工科技有限公司）、磷酸二氢钠（武汉强松精细化学品有限公司）。
2测定方法确定
2.1色谱条件
色谱条件条件如下[1-6]。流动相：0.01mol/L十二烷基磺酸钠（含0.2%三乙胺，并用磷酸调节pH值至3.4）-乙腈（60∶40）为流动相，检测波长：205nm，流速：1.0m·min-1。
2.2对照品溶液的制备
精密称取依托红霉素对照品适量，加流动相制成每毫升含1毫克依托红霉素的溶液，即得。
2.3供试品溶液的制备
取依托红霉素片，研碎，置25毫升容量瓶中，加入流动相10毫升，超声处理5分钟，放冷，用流动相定容，滤过，即得。
2.4精密度试验
精密称取依托红霉素对照品溶液精密吸取10μl，测定6次，记录峰面积。结果，RSD=0.56%，表明本方法精密度良好。
2.5对照品的线性考察
精密称取适量依托红霉素对照品，加入流动相溶液使溶解分别配制成每毫升含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0毫克的溶液。依照2.1项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，依托红霉素在0.5～3.0mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.6重现性试验
称取同一批的依托红霉素片样品6份，测定含量并计算RSD值，结果RSD为0.76%，结果表明此方法的重现性良好。
2.7阴性溶液的制备
依照处方取辅料等，按样品制备工艺制成阴性对照样品，依上述方法测定，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.8准确度试验
精密称取已知含量的样品9份，加入依托红霉素对照品，测定含量并技术回收率，回收率为99.3%，RSD为0.83%。
2.9样品稳定性试验
取供试品溶液，分别于第0、1、2、3、4、5小时测定并记录色谱图。测定依托红霉素片中依托红霉素的RSD=0.73%。结果表明供试品5小时内稳定。
2.10样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定依托红霉素片三批样品中依托红霉素的含量，结果三批样品的含量分别为标示量的100.6%、99.8%、99.6%。
3讨论
分别考察以甲醇-水为流动相梯度洗脱；甲醇-0.02mol·L-1醋酸钠（62∶40）；乙腈-40mmol·L-1醋酸铵水溶液（氨水调pH至10.5）33：67）；A为0.1%甲酸-水（V/V），流动相B为乙腈，线性洗脱梯度；乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；10%甲酸水溶液-甲醇/乙腈/水/甲酸（22.5/22.5/40/10，V/V）；磷酸二氢钾溶液（0.05mol·L-1） -甲醇 （400∶600） （pH4.0）和磷酸二氢钾溶液 （0.05mol·L-1） -乙腈（55∶45） 梯度洗脱；0.01mol/L十二烷基磺酸钠（含0.2%三乙胺，并用磷酸调节pH值至3.4）-乙腈（60∶40），结果以0.01mol/L十二烷基磺酸钠（含0.2%三乙胺，并用磷酸调节pH值至3.4）-乙腈（60∶40）为流动相为流动相，供试品各峰分离效果最好。本实验表明此方法可用于依托红霉素片中依托红霉素的含量测定。
参考文献：
[1]崔丽君，徐广通，徐惠，许崇娟.反相高效液相色谱二元流动相组分的最佳化研究[J].山东建材学院学报.1993（03）
[2]徐敬华，刘楠，徐鹏九，王莲，闫冬.高效液相色谱-质谱法研究依托红霉素颗粒的生物等效性[J].中国新药杂志.2008（15）
[3]汪小江，王连生，田笠卿.反相高效液相色谱中溶质保留值与流动相组成关系的探讨[J].色谱. 1992（02）
[4]邹汉法，张玉奎，卢佩章.气液色谱动力学过程的理论研究——吸附作用对色谱峰形参数的影响[J].分析化学. 1989（08）
[5]盛龙生，王颖，马仁玲，丁岗，李茜，张尊建.液相色谱/光电二极管阵列检测/质谱联用技术在中药分析中的应用[J].色谱.2003（06）
[6]徐红，侯健.高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法[J].计量与测试技术.2010（02）
关键词：依托红霉素片；含量；测定
依托红霉素片属大环内酯类抗生素，对葡萄球菌属、各组链球菌和革兰阳性杆菌均具抗菌活性。本实验采用高效液相色谱法对依托红霉素片含量进行测定。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography ＼ HPLC）又称“高分离度液相色谱”，是色谱法的一个重要分支。1960年中后期以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了高效液相色谱法。高效液相色谱法具有、高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广等特点。本实验对依托红霉素片中的依托红霉素的测定方法进行研究。
1仪器与试药
1.1仪器：ZXTA-20双极反渗透实验室超纯水机（北京卓信博澳仪器有限公司）；FA2004电子天平仪器（上海天平仪器技术有限公司）；HWP-5实验室蒸馏水器（郑州泽铭科技有限公司）；HAD-KQ-300GVDV三频恒温数控超声波清洗器（北京恒奥德仪器仪表有限公司）；赛默飞Spectronic 200可见分光光度计（百道亨仪器设备（北京）有限公司）；WC-52B1精密恒温槽（上海思尔达科学仪器有限公司）；DTA-27多功能静音型台式超声波清洗机（鼎泰（湖北）生化科技设备制造公司）；上海PHS-25台式数显pH计（上海圣科仪器设备有限公司产品）。
1.2色谱柱：迪马C18钻石色谱柱（220 mm×4.6mm，5μm）。
1.3对照品：依托红霉素
1.4试剂：甲醇（武汉强松精细化學品有限公司）、乙腈（永华化学科技（江苏）有限公司）、磷酸（武汉强松精细化学品有限公司）、十二烷基磺酸钠（武汉强松精细化学品有限公司）、三乙胺（武汉强松精细化学品有限公司）、醋酸钠（淄博鑫荣化工科技有限公司）、醋酸铵（淄博鑫荣化工科技有限公司）、氨水（淄博鑫荣化工科技有限公司）、甲酸（武汉强松精细化学品有限公司）、磷酸二氢钾（淄博鑫荣化工科技有限公司）、磷酸二氢钠（武汉强松精细化学品有限公司）。
2测定方法确定
2.1色谱条件
色谱条件条件如下[1-6]。流动相：0.01mol/L十二烷基磺酸钠（含0.2%三乙胺，并用磷酸调节pH值至3.4）-乙腈（60∶40）为流动相，检测波长：205nm，流速：1.0m·min-1。
2.2对照品溶液的制备
精密称取依托红霉素对照品适量，加流动相制成每毫升含1毫克依托红霉素的溶液，即得。
2.3供试品溶液的制备
取依托红霉素片，研碎，置25毫升容量瓶中，加入流动相10毫升，超声处理5分钟，放冷，用流动相定容，滤过，即得。
2.4精密度试验
精密称取依托红霉素对照品溶液精密吸取10μl，测定6次，记录峰面积。结果，RSD=0.56%，表明本方法精密度良好。
2.5对照品的线性考察
精密称取适量依托红霉素对照品，加入流动相溶液使溶解分别配制成每毫升含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0毫克的溶液。依照2.1项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，依托红霉素在0.5～3.0mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.6重现性试验
称取同一批的依托红霉素片样品6份，测定含量并计算RSD值，结果RSD为0.76%，结果表明此方法的重现性良好。
2.7阴性溶液的制备
依照处方取辅料等，按样品制备工艺制成阴性对照样品，依上述方法测定，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.8准确度试验
精密称取已知含量的样品9份，加入依托红霉素对照品，测定含量并技术回收率，回收率为99.3%，RSD为0.83%。
2.9样品稳定性试验
取供试品溶液，分别于第0、1、2、3、4、5小时测定并记录色谱图。测定依托红霉素片中依托红霉素的RSD=0.73%。结果表明供试品5小时内稳定。
2.10样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定依托红霉素片三批样品中依托红霉素的含量，结果三批样品的含量分别为标示量的100.6%、99.8%、99.6%。
3讨论
分别考察以甲醇-水为流动相梯度洗脱；甲醇-0.02mol·L-1醋酸钠（62∶40）；乙腈-40mmol·L-1醋酸铵水溶液（氨水调pH至10.5）33：67）；A为0.1%甲酸-水（V/V），流动相B为乙腈，线性洗脱梯度；乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；10%甲酸水溶液-甲醇/乙腈/水/甲酸（22.5/22.5/40/10，V/V）；磷酸二氢钾溶液（0.05mol·L-1） -甲醇 （400∶600） （pH4.0）和磷酸二氢钾溶液 （0.05mol·L-1） -乙腈（55∶45） 梯度洗脱；0.01mol/L十二烷基磺酸钠（含0.2%三乙胺，并用磷酸调节pH值至3.4）-乙腈（60∶40），结果以0.01mol/L十二烷基磺酸钠（含0.2%三乙胺，并用磷酸调节pH值至3.4）-乙腈（60∶40）为流动相为流动相，供试品各峰分离效果最好。本实验表明此方法可用于依托红霉素片中依托红霉素的含量测定。
参考文献：
[1]崔丽君，徐广通，徐惠，许崇娟.反相高效液相色谱二元流动相组分的最佳化研究[J].山东建材学院学报.1993（03）
[2]徐敬华，刘楠，徐鹏九，王莲，闫冬.高效液相色谱-质谱法研究依托红霉素颗粒的生物等效性[J].中国新药杂志.2008（15）
[3]汪小江，王连生，田笠卿.反相高效液相色谱中溶质保留值与流动相组成关系的探讨[J].色谱. 1992（02）
[4]邹汉法，张玉奎，卢佩章.气液色谱动力学过程的理论研究——吸附作用对色谱峰形参数的影响[J].分析化学. 1989（08）
[5]盛龙生，王颖，马仁玲，丁岗，李茜，张尊建.液相色谱/光电二极管阵列检测/质谱联用技术在中药分析中的应用[J].色谱.2003（06）
[6]徐红，侯健.高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法[J].计量与测试技术.2010（02）