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摘要
为筛选对黏虫[ Mythimna separata （Walker） ]具有毒杀作用的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白，本研究提取Cry1类、Cry2类、Cry9类及Vip3A类等11种蛋白，通过人工饲料喂毒方法对黏虫进行生物活性测定。结果表明，Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Be及Cry1Bb蛋白对黏虫具有杀虫活性，其致死中浓度依次为5.09、17.71、26.75、27.42及43.93 μg/g；Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白对黏虫生长具有抑制作用，其浓度为10 μg/g时的体重抑制率分别为78.4%、79.0%、86.9%，浓度为100 μg/g时的体重抑制率分别为92.8%、95.7%、96.7%；Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa蛋白对黏虫无显著活性。本研究为黏虫的生物防治奠定了基础，并为抗虫转基因作物的研究提供优良的候选基因。
关键词
苏云金芽胞杆菌；Cry蛋白；黏虫；杀虫活性；生长抑制
中图分类号：
S 476.11
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.005
Abstract
In order to investigate the insecticidal activity of some Bacillus thuringiensis proteins against Mythimna separata （Walker）， 11 proteins of Cry1， Cry2， Cry9 and Vip3A were extracted and used for bioassay against M. separata by feeding artificial diet. The bioassay results showed that Cry1Ac， Cry1Ab， Cry2Ab， Cry1Be and Cry1Bb had insecticidal activity against M. separata larvae， with a LC50 value of 5.09 μg/g， 17.71 μg/g， 26.75 μg/g， 27.42 μg/g and 43.93 μg/g， respectively. Cry9Aa， Cry9Eb and Cry9Ee only inhibited growth of M. separata， with a growth inhibition rate of 78.4%， 79.0% and 86.9% at the concentration of 10 μg/g， and with an inhibition rate of 92.8%， 95.7% and 96.7%， respectively， at the concentration of 100 μg/g. However， Cry1Ba， Cry1Ca and Vip3Aa showed no apparent toxicity to M. separata larvae. It lays the foundation for biological control of M. separata， and may provide some excellent candidate genes for insectresistant genetically modified crops.
Key words
Bacillus thuringiensis；Cry protein；Mythimna separata；insecticidal activity；growth inhibition
黏蟲[ Mythimna separata （Walker） ]属于鳞翅目夜蛾科，是一种典型的远距离迁飞害虫，主要为害玉米、小麦和水稻等禾谷类粮食作物以及棉花、豆类、蔬菜等上百种植物，严重时造成作物减产甚至绝收[1]，在亚洲和澳洲经常暴发成灾[2]。在我国，除新疆以外，全国各地均有发生。近年来，黏虫在我国的发生为害呈严重趋势，2012-2013年全国黏虫连续暴发，其发生面积之大、虫口密度之高、损失之重，均属历史罕见，严重威胁我国粮食生产安全[3]。黏虫的化学防治已经产生了诸多负面影响，如黏虫抗药性增强、环境污染、农产品质量安全隐患等严重后果，为实现黏虫的综合治理，亟须开辟生物防治等绿色防控途径。
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）产生的晶体蛋白（Bt蛋白）是主要的杀虫成分，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种害虫，以及一些线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性[4]。
Bt蛋白针对不同夜蛾科昆虫的活性，国外已有不少研究报道。Cry1C、Cry1F对甜菜夜蛾[ Spodoptera exempta （Walker） ]具有高毒力，而Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1B、Cry1D对其有生长抑制作用[5]。Cry1Ab、Cry1Bb、Cry1Fa、Cry2Aa、Cry1Ia和Vip3Aa对草地贪夜蛾[ Spodoptera frugiperda （Smith） ]具有毒杀作用[69]。在国内，相对于Bt对棉铃虫和玉米螟的杀虫作用研究，Bt蛋白对黏虫杀虫活性研究相对滞后，关注较少。仅有少数报道发现Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ac蛋白对黏虫具有杀虫活性[1012]。
针对黏虫为害加重的现状，本文以本实验室11种Bt杀虫蛋白为基础，通过测定其LC50、体重抑制率从而获得对黏虫有活性的蛋白，再对这些蛋白进行序列分析比较研究，系统筛选对黏虫具有较高活性的杀虫蛋白。研究结果可为黏虫的生物防治提供菌株和蛋白资源，为我国抗虫转基因作物的研究提供优良的候选基因。 1材料和方法
1.1菌株和培养基
供试菌株和质粒见表1。
1.2主要试剂和仪器
Taq DNA聚合酶购自康润生物技术公司；限制性内切酶、PrimeSTARHS DNA聚合酶和T4 DNA连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取、DNA回收和PCR产物纯化试剂盒购自Axygen公司，其他生化和化学试剂均为市售。
D250摇床，美国NBS公司；Avanti J26XP高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；Mini Protein Ⅲ蛋白电泳仪，美国BioRad公司；凝胶成像系统，GE公司；CP750超声波破碎仪，宁波新芝生物公司。
1.3供试昆虫及人工饲料
黏虫（M.separata）及人工饲料，由中国农业科学院植物保护研究所迁飞害虫组提供。
1.4cry1Be4表达载体构建
根据本实验室刘东明等克隆的cry1Be4基因的全长序列[13]，设计引物cry1Be_F（ACGCGAGCTCATGAATCTATCAACCGATGCTCGTATTG，Ecl136Ⅱ）和cry1Be_R（ACGCGAGCTCTTCCTCCATAAGGAGTAATTCCACGC，Ecl136Ⅱ），由上海生工生物工程公司合成；PCR扩增条件为94℃预变性10 min；94℃变性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸4 min，30次循环；72℃延伸10 min，目的片段长度为3 603 bp，经单酶切后连接到pEB表达载体上，采用热激法转入大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆进行测序验证，序列测定由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
1.5大肠杆菌Cry及Vip蛋白表達量的测定
Cry1Ba3、Cry1Bb2、Cry1Be4、Cry9Aa3、Cry9Eb1、Cry9Ee1和Vip3Aa11蛋白均于大肠杆菌中进行表达，大肠杆菌的培养采用LB培养基，蛋白的提取采用破碎离心法，具体见Shu等的方法[14]。大肠杆菌中表达的蛋白包括可溶组分和不可溶组分，不可溶组分是由于蛋白在表达的过程中不完全正确折叠所导致的，其在生测过程中所表现的活性较低。为了得到较好的生测结果，需要探索获得可溶组分含量相对较高的表达条件，为生物活性测定提供足够的可溶蛋白。本研究设定了18℃和30℃两个诱导温度，以及0.1、0.5、1.0 mmol/L 3个IPTG终浓度，对大肠杆菌中表达的蛋白进行表达条件的优化。
杀虫晶体蛋白的SDSPAGE分析：吸取蛋白样品进行制样，100℃煮沸5 min，13 000 g离心5 min，取上清液点样于4%浓缩胶，8%分离胶，80 V电泳20 min，150 V电泳直到胶底边缘。电泳结束后取出凝胶，进行脱色、染色及扫描图谱，具体方法详见文献[15]。使用National Institutes of Health开发的ImageJ 1.44 软件，分析电泳后的蛋白条带图谱并定量，具体使用方法参看ImageJ User Guide 1.44。
1.6苏云金芽胞杆菌Cry蛋白表达量的测定提取
Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ca及Cry2Ab蛋白均于苏云金芽胞杆菌中进行表达，苏云金芽胞杆菌的培养采用1/2 LB液体培养基，蛋白的提取采取重复溶解的方法[16]进行，蛋白质的定量分析同1.5小节。
1.7Cry蛋白和Vip蛋白对黏虫的室内生物活性测定
参考蒋善军等的方法[11]，生测法使用含有Bt蛋白的人工饲料饲喂黏虫初孵幼虫，7 d后统计死亡率。具体如下：称取30 g人工饲料放置于灭菌的培养皿中；加入待测样品溶液3 mL（初筛均使用10 μg/g和100 μg/g两个浓度，使用24孔培养板法进行，复筛依据初筛的校正死亡率设定浓度，使用改良的培养皿法进行），充分搅拌，混匀后平均分装于3个培养皿中；根据饲料的干湿程度室温放置一段时间，直到饲料表面没有水滴。每皿接入30头初孵幼虫，每个浓度重复3次，共处理90头试虫（试虫接完后于培养皿盖内垫三层卫生纸，盖紧培养皿，用橡皮筋扎紧，以防试虫逃逸）；将样品置于25℃光照培养箱中培养，L∥D=16 h∥8 h，湿度70%～80%，每天观察饲料干湿程度，适当做出微调（培养箱湿度太低则向里加水，太高则进行干燥处理）；培养7 d后调查死虫和活虫数并称重，计算死亡率、校正死亡率（由于大肠杆菌中表达的蛋白使用20 mmol/L TrisHCl溶解，而苏云金芽胞杆菌中表达的蛋白使用50 mmol/L Na2CO3溶解，因此生测时分别设置对照，校正死亡率也分别计算）。生测数据采用SPSS 13.0计算致死中浓度（LC50）[17]，死亡率、校正死亡率及体重抑制率。
3讨论
本研究提取了对鳞翅目具有杀虫活性的11种Bt蛋白，对鳞翅目夜蛾科的黏虫进行生物活性测定，结果显示Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Bb、Cry1Be和Cry2Ab蛋白对黏虫具有较好的杀虫活性，Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白对黏虫仅具有生长抑制作用，而Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa11蛋白对黏虫无显著毒杀作用。
目前国内关于Bt蛋白对黏虫杀虫活性的研究很少，2010年蒋善军利用Cry1Ab、Cry1Ac蛋白饲喂黏虫，获得了Cry1Ac蛋白对黏虫初孵幼虫处理18 d的LC50为11.23 μg/g，本研究发现了多种对黏虫具有杀虫活性的蛋白，并且获得了其致死中浓度LC50，其中Cry1Bb和Cry1Be对黏虫具有较好的毒杀作用，3种Cry9蛋白对黏虫具有显著的体重抑制作用。已有报道显示Cry1B、Cry9A蛋白与Cry1A蛋白无交互抗性[18]，因此这些蛋白新的活性的发现，有望用于害虫对Cry1A产品抗药性治理，并为抗虫转基因作物的研发提供新的基因来源。 為了分析Cry1Ba与Cry1Bb、Cry1Be对黏虫的活性差异，我们从其蛋白质的氨基酸序列出发，以SWISSMODEL软件预测了Cry1Ba与Cry1Bb、Cry1Be蛋白的三维结构，并使用DNAMAN软件，比较了各结构域的相似性以便于初步分析其杀虫特异性的分子机制。通过比对发现：Cry1Bb和Cry1Be的DomainⅡ氨基酸序列相似度很高，同时两者与Cry1Ba的DomainⅡ的相似度较低，且三者的Domain I氨基酸序列相似度很高，相似度为91.02%，而三者Domain Ⅲ的氨基酸序列相似度都很低（表5）。
近年来大量的研究表明，Cry蛋白上某些氨基酸位点或区域与杀虫特异性有关，由于DomainⅡ是Cry毒素中变化最多的区域[20]，该区域被认为是与Cry毒素作用的特异性有关，同时DomainⅡ上暴露在外面的Loop区域与特异的幼虫中肠蛋白结合有关[2122]，与杀虫特异性有着密不可分的关系。因此，本文以PyMOL软件分析了Cry1Bb、Cry1Be和Cry1Ba蛋白Domain Ⅱ上的Loop 1、Loop 2、Loop 3的氨基酸序列。结果显示：三者Loop 1上的氨基酸序列相似度较高，而Cry1Bb、Cry1Be 的Loop 1、Loop 2、Loop 3氨基酸序列相似度均较高，但两者与Cry1Ba的Loop2、Loop3氨基酸序列差异非常大（表6）。但也有研究发现：Cry4Aa蛋白对尖音库蚊（Culex pipiens）的活性相关区域不是Domain Ⅱ的Loops，可能是Domain Ⅲ的某个位点[23]。
综上所述，Cry1Ba的Loop2、Loop3区域氨基酸序列与Cry1Bb、Cry1Be具有非常大的差异，可能是导致其活性差异的关键因素。进而我们推测Cry1Bb、Cry1Be与黏虫中肠刷状缘膜囊泡BBMV上的受体可以结合，而Cry1Ba无法与之结合。关于其杀虫机理还需进一步深入的研究。
参考文献
[1]李光博. 粘虫[M]∥中国农业科学院植物保护研究所.中国农作物病虫害.北京：中国农业出版社， 1996：657723.
[2]Hirai K. Migration of the oriental armyworm Mythimna separata in East Asia in relation to weather and climate. III. Japan[M]∥ Drake V A， Gatehouse A G. Insect migration：tracking resources through space and time. Cambridge， England：Cambridge University Press， 1995：117130.
[3]江幸福， 张蕾， 程云霞， 等. 我国粘虫发生危害新特点及趋势分析[J]. 应用昆虫学报， 2014， 51（6）：14441449.
[4]Schnepf E， Crickmore N， Van Rie J， et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 1998， 62（3）：775806.
[5]Bai C， Degheele D， Jansens S， et al. Activity of insecticidal crystal proteins and strains of Bacillus thuringiensis against Spodoptera exempta （Walker）[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 1993， 62（3）：211215.
[6]Luo K E， Banks D， Adang M J. Toxicity， binding， and permeability analyses of four Bacillus thuringiensis Cry1 δEndotoxins using brush border membrane vesicles of Spodoptera exigua and Spodoptera frugiperda[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1999， 65（2）：457464.
[7]Bergamasco V B， Mendes D R P， Fernandes O A， et al. Bacillus thuringiensis Cry1Ia10 and Vip3Aa protein interactions and their toxicity in Spodoptera spp.（Lepidoptera）[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2013， 112（2）：152158.
[8]Estruch J J， Warren G W， Mullins M A， et al. Vip3A， a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1996， 93（11）：53895394.
为筛选对黏虫[ Mythimna separata （Walker） ]具有毒杀作用的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白，本研究提取Cry1类、Cry2类、Cry9类及Vip3A类等11种蛋白，通过人工饲料喂毒方法对黏虫进行生物活性测定。结果表明，Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Be及Cry1Bb蛋白对黏虫具有杀虫活性，其致死中浓度依次为5.09、17.71、26.75、27.42及43.93 μg/g；Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白对黏虫生长具有抑制作用，其浓度为10 μg/g时的体重抑制率分别为78.4%、79.0%、86.9%，浓度为100 μg/g时的体重抑制率分别为92.8%、95.7%、96.7%；Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa蛋白对黏虫无显著活性。本研究为黏虫的生物防治奠定了基础，并为抗虫转基因作物的研究提供优良的候选基因。
关键词
苏云金芽胞杆菌；Cry蛋白；黏虫；杀虫活性；生长抑制
中图分类号：
S 476.11
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.005
Abstract
In order to investigate the insecticidal activity of some Bacillus thuringiensis proteins against Mythimna separata （Walker）， 11 proteins of Cry1， Cry2， Cry9 and Vip3A were extracted and used for bioassay against M. separata by feeding artificial diet. The bioassay results showed that Cry1Ac， Cry1Ab， Cry2Ab， Cry1Be and Cry1Bb had insecticidal activity against M. separata larvae， with a LC50 value of 5.09 μg/g， 17.71 μg/g， 26.75 μg/g， 27.42 μg/g and 43.93 μg/g， respectively. Cry9Aa， Cry9Eb and Cry9Ee only inhibited growth of M. separata， with a growth inhibition rate of 78.4%， 79.0% and 86.9% at the concentration of 10 μg/g， and with an inhibition rate of 92.8%， 95.7% and 96.7%， respectively， at the concentration of 100 μg/g. However， Cry1Ba， Cry1Ca and Vip3Aa showed no apparent toxicity to M. separata larvae. It lays the foundation for biological control of M. separata， and may provide some excellent candidate genes for insectresistant genetically modified crops.
Key words
Bacillus thuringiensis；Cry protein；Mythimna separata；insecticidal activity；growth inhibition
黏蟲[ Mythimna separata （Walker） ]属于鳞翅目夜蛾科，是一种典型的远距离迁飞害虫，主要为害玉米、小麦和水稻等禾谷类粮食作物以及棉花、豆类、蔬菜等上百种植物，严重时造成作物减产甚至绝收[1]，在亚洲和澳洲经常暴发成灾[2]。在我国，除新疆以外，全国各地均有发生。近年来，黏虫在我国的发生为害呈严重趋势，2012-2013年全国黏虫连续暴发，其发生面积之大、虫口密度之高、损失之重，均属历史罕见，严重威胁我国粮食生产安全[3]。黏虫的化学防治已经产生了诸多负面影响，如黏虫抗药性增强、环境污染、农产品质量安全隐患等严重后果，为实现黏虫的综合治理，亟须开辟生物防治等绿色防控途径。
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）产生的晶体蛋白（Bt蛋白）是主要的杀虫成分，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种害虫，以及一些线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性[4]。
Bt蛋白针对不同夜蛾科昆虫的活性，国外已有不少研究报道。Cry1C、Cry1F对甜菜夜蛾[ Spodoptera exempta （Walker） ]具有高毒力，而Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1B、Cry1D对其有生长抑制作用[5]。Cry1Ab、Cry1Bb、Cry1Fa、Cry2Aa、Cry1Ia和Vip3Aa对草地贪夜蛾[ Spodoptera frugiperda （Smith） ]具有毒杀作用[69]。在国内，相对于Bt对棉铃虫和玉米螟的杀虫作用研究，Bt蛋白对黏虫杀虫活性研究相对滞后，关注较少。仅有少数报道发现Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ac蛋白对黏虫具有杀虫活性[1012]。
针对黏虫为害加重的现状，本文以本实验室11种Bt杀虫蛋白为基础，通过测定其LC50、体重抑制率从而获得对黏虫有活性的蛋白，再对这些蛋白进行序列分析比较研究，系统筛选对黏虫具有较高活性的杀虫蛋白。研究结果可为黏虫的生物防治提供菌株和蛋白资源，为我国抗虫转基因作物的研究提供优良的候选基因。 1材料和方法
1.1菌株和培养基
供试菌株和质粒见表1。
1.2主要试剂和仪器
Taq DNA聚合酶购自康润生物技术公司；限制性内切酶、PrimeSTARHS DNA聚合酶和T4 DNA连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取、DNA回收和PCR产物纯化试剂盒购自Axygen公司，其他生化和化学试剂均为市售。
D250摇床，美国NBS公司；Avanti J26XP高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；Mini Protein Ⅲ蛋白电泳仪，美国BioRad公司；凝胶成像系统，GE公司；CP750超声波破碎仪，宁波新芝生物公司。
1.3供试昆虫及人工饲料
黏虫（M.separata）及人工饲料，由中国农业科学院植物保护研究所迁飞害虫组提供。
1.4cry1Be4表达载体构建
根据本实验室刘东明等克隆的cry1Be4基因的全长序列[13]，设计引物cry1Be_F（ACGCGAGCTCATGAATCTATCAACCGATGCTCGTATTG，Ecl136Ⅱ）和cry1Be_R（ACGCGAGCTCTTCCTCCATAAGGAGTAATTCCACGC，Ecl136Ⅱ），由上海生工生物工程公司合成；PCR扩增条件为94℃预变性10 min；94℃变性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸4 min，30次循环；72℃延伸10 min，目的片段长度为3 603 bp，经单酶切后连接到pEB表达载体上，采用热激法转入大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆进行测序验证，序列测定由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
1.5大肠杆菌Cry及Vip蛋白表達量的测定
Cry1Ba3、Cry1Bb2、Cry1Be4、Cry9Aa3、Cry9Eb1、Cry9Ee1和Vip3Aa11蛋白均于大肠杆菌中进行表达，大肠杆菌的培养采用LB培养基，蛋白的提取采用破碎离心法，具体见Shu等的方法[14]。大肠杆菌中表达的蛋白包括可溶组分和不可溶组分，不可溶组分是由于蛋白在表达的过程中不完全正确折叠所导致的，其在生测过程中所表现的活性较低。为了得到较好的生测结果，需要探索获得可溶组分含量相对较高的表达条件，为生物活性测定提供足够的可溶蛋白。本研究设定了18℃和30℃两个诱导温度，以及0.1、0.5、1.0 mmol/L 3个IPTG终浓度，对大肠杆菌中表达的蛋白进行表达条件的优化。
杀虫晶体蛋白的SDSPAGE分析：吸取蛋白样品进行制样，100℃煮沸5 min，13 000 g离心5 min，取上清液点样于4%浓缩胶，8%分离胶，80 V电泳20 min，150 V电泳直到胶底边缘。电泳结束后取出凝胶，进行脱色、染色及扫描图谱，具体方法详见文献[15]。使用National Institutes of Health开发的ImageJ 1.44 软件，分析电泳后的蛋白条带图谱并定量，具体使用方法参看ImageJ User Guide 1.44。
1.6苏云金芽胞杆菌Cry蛋白表达量的测定提取
Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ca及Cry2Ab蛋白均于苏云金芽胞杆菌中进行表达，苏云金芽胞杆菌的培养采用1/2 LB液体培养基，蛋白的提取采取重复溶解的方法[16]进行，蛋白质的定量分析同1.5小节。
1.7Cry蛋白和Vip蛋白对黏虫的室内生物活性测定
参考蒋善军等的方法[11]，生测法使用含有Bt蛋白的人工饲料饲喂黏虫初孵幼虫，7 d后统计死亡率。具体如下：称取30 g人工饲料放置于灭菌的培养皿中；加入待测样品溶液3 mL（初筛均使用10 μg/g和100 μg/g两个浓度，使用24孔培养板法进行，复筛依据初筛的校正死亡率设定浓度，使用改良的培养皿法进行），充分搅拌，混匀后平均分装于3个培养皿中；根据饲料的干湿程度室温放置一段时间，直到饲料表面没有水滴。每皿接入30头初孵幼虫，每个浓度重复3次，共处理90头试虫（试虫接完后于培养皿盖内垫三层卫生纸，盖紧培养皿，用橡皮筋扎紧，以防试虫逃逸）；将样品置于25℃光照培养箱中培养，L∥D=16 h∥8 h，湿度70%～80%，每天观察饲料干湿程度，适当做出微调（培养箱湿度太低则向里加水，太高则进行干燥处理）；培养7 d后调查死虫和活虫数并称重，计算死亡率、校正死亡率（由于大肠杆菌中表达的蛋白使用20 mmol/L TrisHCl溶解，而苏云金芽胞杆菌中表达的蛋白使用50 mmol/L Na2CO3溶解，因此生测时分别设置对照，校正死亡率也分别计算）。生测数据采用SPSS 13.0计算致死中浓度（LC50）[17]，死亡率、校正死亡率及体重抑制率。
3讨论
本研究提取了对鳞翅目具有杀虫活性的11种Bt蛋白，对鳞翅目夜蛾科的黏虫进行生物活性测定，结果显示Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Bb、Cry1Be和Cry2Ab蛋白对黏虫具有较好的杀虫活性，Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白对黏虫仅具有生长抑制作用，而Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa11蛋白对黏虫无显著毒杀作用。
目前国内关于Bt蛋白对黏虫杀虫活性的研究很少，2010年蒋善军利用Cry1Ab、Cry1Ac蛋白饲喂黏虫，获得了Cry1Ac蛋白对黏虫初孵幼虫处理18 d的LC50为11.23 μg/g，本研究发现了多种对黏虫具有杀虫活性的蛋白，并且获得了其致死中浓度LC50，其中Cry1Bb和Cry1Be对黏虫具有较好的毒杀作用，3种Cry9蛋白对黏虫具有显著的体重抑制作用。已有报道显示Cry1B、Cry9A蛋白与Cry1A蛋白无交互抗性[18]，因此这些蛋白新的活性的发现，有望用于害虫对Cry1A产品抗药性治理，并为抗虫转基因作物的研发提供新的基因来源。 為了分析Cry1Ba与Cry1Bb、Cry1Be对黏虫的活性差异，我们从其蛋白质的氨基酸序列出发，以SWISSMODEL软件预测了Cry1Ba与Cry1Bb、Cry1Be蛋白的三维结构，并使用DNAMAN软件，比较了各结构域的相似性以便于初步分析其杀虫特异性的分子机制。通过比对发现：Cry1Bb和Cry1Be的DomainⅡ氨基酸序列相似度很高，同时两者与Cry1Ba的DomainⅡ的相似度较低，且三者的Domain I氨基酸序列相似度很高，相似度为91.02%，而三者Domain Ⅲ的氨基酸序列相似度都很低（表5）。
近年来大量的研究表明，Cry蛋白上某些氨基酸位点或区域与杀虫特异性有关，由于DomainⅡ是Cry毒素中变化最多的区域[20]，该区域被认为是与Cry毒素作用的特异性有关，同时DomainⅡ上暴露在外面的Loop区域与特异的幼虫中肠蛋白结合有关[2122]，与杀虫特异性有着密不可分的关系。因此，本文以PyMOL软件分析了Cry1Bb、Cry1Be和Cry1Ba蛋白Domain Ⅱ上的Loop 1、Loop 2、Loop 3的氨基酸序列。结果显示：三者Loop 1上的氨基酸序列相似度较高，而Cry1Bb、Cry1Be 的Loop 1、Loop 2、Loop 3氨基酸序列相似度均较高，但两者与Cry1Ba的Loop2、Loop3氨基酸序列差异非常大（表6）。但也有研究发现：Cry4Aa蛋白对尖音库蚊（Culex pipiens）的活性相关区域不是Domain Ⅱ的Loops，可能是Domain Ⅲ的某个位点[23]。
综上所述，Cry1Ba的Loop2、Loop3区域氨基酸序列与Cry1Bb、Cry1Be具有非常大的差异，可能是导致其活性差异的关键因素。进而我们推测Cry1Bb、Cry1Be与黏虫中肠刷状缘膜囊泡BBMV上的受体可以结合，而Cry1Ba无法与之结合。关于其杀虫机理还需进一步深入的研究。
参考文献
[1]李光博. 粘虫[M]∥中国农业科学院植物保护研究所.中国农作物病虫害.北京：中国农业出版社， 1996：657723.
[2]Hirai K. Migration of the oriental armyworm Mythimna separata in East Asia in relation to weather and climate. III. Japan[M]∥ Drake V A， Gatehouse A G. Insect migration：tracking resources through space and time. Cambridge， England：Cambridge University Press， 1995：117130.
[3]江幸福， 张蕾， 程云霞， 等. 我国粘虫发生危害新特点及趋势分析[J]. 应用昆虫学报， 2014， 51（6）：14441449.
[4]Schnepf E， Crickmore N， Van Rie J， et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 1998， 62（3）：775806.
[5]Bai C， Degheele D， Jansens S， et al. Activity of insecticidal crystal proteins and strains of Bacillus thuringiensis against Spodoptera exempta （Walker）[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 1993， 62（3）：211215.
[6]Luo K E， Banks D， Adang M J. Toxicity， binding， and permeability analyses of four Bacillus thuringiensis Cry1 δEndotoxins using brush border membrane vesicles of Spodoptera exigua and Spodoptera frugiperda[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1999， 65（2）：457464.
[7]Bergamasco V B， Mendes D R P， Fernandes O A， et al. Bacillus thuringiensis Cry1Ia10 and Vip3Aa protein interactions and their toxicity in Spodoptera spp.（Lepidoptera）[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2013， 112（2）：152158.
[8]Estruch J J， Warren G W， Mullins M A， et al. Vip3A， a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1996， 93（11）：53895394.