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摘要：【目的】比较稻鸭共育模式与常规管理模式种植水稻的根际土壤微生物种群多样性，为利用土壤微生物多样性开展水稻生态栽培提供科学依据。【方法】采集常规管理模式水稻根际土壤样品（记为S2）和稻鸭共育模式水稻根际土壤样品（记为S3），采用电位法测定土壤pH、重铬酸钾—外加热法测定土壤有机质含量;针对土壤样品真菌ITS1～ITS2区域和细菌16S rDNA扩增子V3～V4区域进行Illumina MiSeq 2×300 bp双末端测序，分析两种模式土壤真菌和细菌的种类及丰度差异。【结果】S3的pH为5.10，有机质含量为23.91 g/kg;S2的pH为5.34，有机质含量为19.84 g/kg。在真菌门水平上，两种管理模式的根际土壤优势门均为子囊菌门（Ascomycota），S3中子囊菌门的相对丰度为42.36%，S2为93.67%，两者相差2.21倍;在真菌属的水平上，S3的优势属为毛壳菌属（Chaetomium），相对丰度为2.63%，而S2的毛壳菌属相对丰度仅为0.26%，两者相差10.12倍;S3中居第2位的属是嗜热真菌属（Mycothermus），相对丰度为2.21%，而S2的嗜热真菌属相对丰度为0.05%，两者相差44.20倍;S2的优势属是黑盘孢属（Melanconiella），相对丰度为6.66%，而S3的黑盘孢属相对丰度为0.26%，两者相差25.62倍。两种管理模式下相对丰度居前2位的细菌门均为变形菌门（Proteobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria），S3中变形菌门的相对丰度为40.90%，S2为29.45%，两者相差1.38倍;S3中酸杆菌门的相对丰度为18.90%，S2为27.84%，两者相差1.47倍;两种管理模式下相对丰度居前10的细菌属相同，其中7个属隶属变形菌门[其中3个属隶属于根瘤菌目（Rhizobiales）、3个属于隶属粘细菌目（Myxococcales）、1个属隶属于δ-变形菌纲未分目（unidentified Deltaproteobacteria）]、3个属隶属于酸杆菌门，10个属中仅有红微菌属（Rhodomicrobium）在两种管理模式土壤中相对丰度相差2.23倍（S3为1.18%，S2为0.53%），其他9个属相差均在1.00倍左右。【结论】与常规管理模式比较，稻鸭共育模式的水稻根际土壤pH略低，有机质稍高，真菌的种群结构丰富，而细菌的优势门和优势属无明显差异。
关键词： 稻鸭共育模式;水稻;根际土壤;真菌;细菌;种群多样性
中图分类号： S344 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0059-09
0 引言
【研究意義】微生物是土壤有机物的分解者（王芳和图力古尔，2014），同时是土壤有机质和养分转化与循环的动力，是土壤中植物有效养分的储备库（徐一兰等，2016），土壤微生物群落变化在一定程度上可反映土壤质量的变化趋势（张薇等，2005）。稻鸭共育模式种植水稻是指通过鸭子除草除虫及排便肥田，免施化肥与化学农药（含除草剂）的水稻种植方式;而常规种植模式需通过施用化肥、化学农药及除草剂进行管理。化肥和化学农药的过量施用会导致土壤酸化，土壤微生物种群结构也相应发生变化。因此，探讨该两种栽培模式下水稻根际土壤酸度、有机质含量及微生物的种群多样性，对发展有机水稻产业具有重要意义。【前人研究进展】随着分子生物学和高通量测序技术的发展，近几年有关土壤微生物多样性的研究报道较多。王轶等（2014）以有20年历史的长期定位试验田为研究对象，利用末端限制性片段长度多态性分析技术研究土壤真菌群落的多样性，结果发现长期施用有机肥与施用化肥相比可提高土壤真菌多样性，改变其群落结构;陆晓菊等（2015）采用人工分离和PCR研究三七连作6年的健康植株与根腐病植株根际土壤细菌种群结构，结果发现三七连作土传病害的发生与土壤细菌的种群结构及其优势细菌的种群比例具有密切的关联性;杜思瑶等（2017）采用Illumina平台Hiseq 2500高通量测序技术，研究有机和常规设施种植模式及轮作对土壤细菌多样性和群落结构的影响，结果表明有机设施种植的土壤细菌多样性高于常规设施种植，有机设施种植下轮作与连作土壤的细菌群落结构表现出明显差异，而常规设施种植下轮作与连作土壤的细菌群落结构无明显差异;韦俊等（2017）采用16S rRNA测序技术分析不同套作模式下烤烟根际土壤细菌群落结构及多样性差异，发现套种模式比单作烤烟根际土壤细菌多样性明显提高，且不同程度地降低土壤中潜在的致病菌丰度。可见，土壤微生物种群结构多样性与植物的健康生长密切相关。【本研究切入点】前人主要针对旱地中的土壤细菌或真菌种群多样性进行研究，而针对稻鸭共育模式和常规管理模式下稻田土壤微生物种群多样性的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】基于Illumina MiSeq测序平台，利用双末端（Paired-End）测序方法，构建真菌ITS1～ITS2区域和细菌16S rDNA扩增子V3～V4区域的小片段文库，进行双末端测序，分析稻鸭共育模式与常规管理模式稻田土壤真菌和细菌的种类及丰度差异，揭示化肥和农药对土壤微生物种群结构的潜在影响，为利用土壤微生物多样性开展水稻生态栽培提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 土壤样品采集
于水稻蜡熟期（2017年7月18日）从广西宾阳县思陇镇采集水稻根际土壤，采样时水稻即将收获，田水已排干，土壤已基本硬化。采自水稻常规管理模式水稻田的土壤样品标记为S2，该田块采用化肥、化学农药和除草剂进行常规管理;采自稻鸭共育模式水稻田的土壤样品标记为S3，该田块位于常规管理模式田块的隔壁。用五点取样法，每点连根带泥拔2株水稻植株，共10株，收集根际土壤混匀后带回实验室。每处理土壤样品分成2份，1份用于pH和有机质含量检测，1份用于DNA提取和测序。 1. 2 土壤样品pH和有机质含量检测
采用电位法（S220型梅特勒—托利多酸度计）测定土壤pH，水∶土=2.5∶1.0。用重铬酸钾—外加热法测定土壤有机质含量（鲍士旦，2000）。
1. 3 土壤样品真菌ITS1～ITS2区域和细菌16S rDNA扩增子V3～V4区域测序及多样性分析
提取土壤的总DNA，针对真菌的核糖体内转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）的ITS1～ITS2区域，及细菌16S rDNA扩增子序列（16S rDNA amplicon sequencing）V3～V4区域，基于Illumina MiSeq测序平台，利用双末端测序方法构建小片段文库进行双末端测序（2×300 bp）。通过对Reads拼接过滤、操作分类单元（Operational taxonomic units，OTUs）聚类、物种注释及丰度分析，根据物种注释结果，选取每个样品在不同分类水平上最大丰度排名前10的物种及其相对丰度绘制柱形累加图，以便直观查看各样品在不同分类水平上相对丰度较高的物种及其比例;再对OTUs进行Alpha多样性指数等分析，对不同样品在97%一致性阈值水平下的Alpha多样性指数进行统计，比较样品间的差异。样品测序与分析委托广西普斐生物信息科技有限公司完成。
2 结果与分析
2. 1 土壤样品pH和有机质含量测定结果
两种水稻栽培管理模式土壤样品的测定结果显示，S2的pH为5.34，有机质含量为19.84 g/kg;S3的pH为5.10，有机质含量为23.91 g/kg。可见，两种模式的土壤样品均呈酸性，与常规管理模式比较，稻鸭共育模式的土壤有机质含量增加，但土壤pH略低。
2. 2 土壤样品真菌种群多样性分析结果
2. 2. 1 测序数据的获得 从S2的总DNA中测得原始序列36073条，平均每条长度为280 nt，对原始数据进行拼接、过滤，得到有效序列35425条，有效率98.20%;从S3的总DNA中获得原始序列38843条，平均每条长度283 nt，有效序列38438条，有效率98.96%。从OTUs丰度稀释曲线（图1）可看出，随着测序数据量的增大，稀释曲线斜率逐渐下降，趋向平坦，说明测序数据量足够反映出样品中的物种组成特征。从样品分类等级稀释曲线（图2）可看出，S3中的物种丰富度和均匀度均高于S2。
2. 2. 2 OTU分析结果 使用UPARSE对样品的有效序列进行聚类，相似性≥97%的tag聚为同一OTU，共获得436个OTUs，使用代表性序列与每个样品进行比较，发现S2包含260个OTUs，而S3包含373个OTUs。将所有样品进行均一化处理后绘制韦恩图，分析不同样品间共有和特有的OTUs，结果如图3所示。S2和S3有197个共有OTUs，S2特有的OTUs 63個，S3特有的OTUs 176个，即S3的真菌种类多于S2。S2和S3的Chao1指数分别为362.14和381.78，Shannon指数分别为2.20和5.45。可见，与S2比较，S3的真菌种群更丰富。
2. 2. 3 真菌门水平的注释及相对丰度 使用UNITE ITS数据库对OTUs的代表序列进行物种注释。在真菌门的水平上共注释出5个门，包括子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和囊球菌门（Glomeromycota）。S2和S3的最优势门均是子囊菌门;S2中，子囊菌门的相对丰度为93.67%、接合菌门为2.26%、担子菌门为1.43%、囊球菌门为0.20%、壶菌门为0.02%，其他门（Others）的相对丰度之和为2.43%;S3中，子囊菌门的相对丰度为42.36%、接合菌门为27.01%、担子菌门为11.62%、壶菌门为0.26%、囊球菌门为0.23%，其他门（Others）的相对丰度之和为18.54%。图4为相对丰度排名前5位的真菌门。S3中的接合菌门、担子菌门和壶菌门的相对丰度均比S2高，分别是S2相应门的11.95、8.13和13.00倍，但子囊菌门比S2低，S2是S3的2.21倍，囊球菌门的相对丰度相当。
2. 2. 4 真菌属水平的注释及相对丰度 在属的水平上，S2注释出34个属，S3注释出41个属;但S2有87%的序列、S3有79%的序列不能注释出来，原因可能是测序的reads不够长或ITS的区分度不够高，不能区分出不同的属。图5为相对丰度排名前10位的真菌属。
在S2中，黑盘孢属（Melanconiella）的相对丰度为6.66%，为优势属，S3中黑盘孢属的相对丰度为0.26%，两者相差25.62倍。黑盘孢属的分类地位是黑盘孢科（Melanconidaceae）间座壳目（Diaporthales）粪壳菌纲（Sordariomycetes）子囊菌门。S2中相对丰度居第2位的属是Minutisphaera（1.57%），S3中Minutisphaera的相对丰度为0.22%，两者相差7.14倍。Minutisphaera的分类地位是座囊菌纲未分科（Incertae sedis Dothideomycetes）座囊菌纲未分目（Incertae sedis Dothideomycetes）座囊菌纲（Dothideomycetes）子囊菌门。
在S3中，毛壳菌属（Chaetomium）的相对丰度为2.63%，为优势属，S2中毛壳菌属的相对丰度为0.26%，两者相差10.12倍。毛壳菌属的分类地位是毛壳菌科（Chaetomiaceae）粪壳菌目（Sordariales）粪壳菌纲子囊菌门。S3中相对丰度居第2位的属是嗜热真菌属（Mycothermus），相对丰度为2.21%，S2中嗜热真菌属的相对丰度为0.05%，两者相差44.20倍。嗜热真菌属的分类地位为毛壳菌科粪壳菌目粪壳菌纲子囊菌门。 此外，在S3中相对丰度大于1.00%的属还有2个，分别是翅孢壳属（Emericellopsis，相对丰度1.24%）和腥黑粉菌属（Tilletia，相对丰度1.18%）;在S2中，翅孢壳属的相对丰度为0.09%，与S3相差13.78倍，但未发现腥黑粉菌属。翅孢壳属的分类地位是肉座菌目未分科（Incertae sedis Hypocreales）肉座菌目（Hypocreales）粪壳菌纲子囊菌门。腥黑粉菌属的分类地位是腥黑粉菌科（Tilletiaceae）腥黑粉菌目（Tilletiales）外担子菌纲（Exobasidiomycetes）担子菌门。
2. 3 细菌种群多样性分析结果
2. 3. 1 测序数据的获得 从S2的总DNA中获得原始序列33396条，有效序列30854条，有效率92.39%，平均每条长度456 nt;从S3的总DNA中获得原始序列37875条，有效序列34050条，有效率89.90%，平均每条长度457 nt。从OTUs丰度稀释曲线（图6）可看出，随着测序数据量的增大，稀释曲线斜率逐渐下降，趋向平坦，说明测序数据量足够反映出样品中的物种组成特征。从细菌分类等级稀释曲线（图7）可看出，S2和S3中物种的丰富度和均匀度差异不明显。
2. 3. 2 OTU分析 使用UPARSE对样品的有效序列进行聚类，相似性≥97%的tag聚为同一OTUs，共获得484个OTUs，使用代表性序列与每个样品进行比较，发现S2包含454个OTUs，S3包含468个OTUs。OTUs的韦恩图见图8，S2和S3有438个共有OTUs ，S2特有16个OTUs ，S3特有30个OTUs，说明S2和S3的细菌种类差异不明显。S2和S3的Chao1指数分别为459.25和470.64，Shannon指数分别为7.801和7.854。可见，S3的细菌种群多样性与S2无明显差异。
2. 3. 3 细菌门水平的注释及相对丰度 使用Silva 16s rRNA数据库对OTUs的代表序列进行物种注释，以分析其物种组成。在细菌门的水平上，S2和S3中的优势细菌门一致，相对丰度前5个门依次是变形菌门（Proteobacteria）>酸杆菌门（Acidobacteria）>硝化螺旋菌门（Nitrospirae）>绿弯菌门（Chloroflexi）>拟杆菌门（Bacteroidetes）。其中，S3中的变形菌门相对丰度为40.90%，高于S2（29.45%），两者相差1.38倍，S3中的酸杆菌门相对丰度（18.90%）小于S2（27.84%），两者相差1.47倍 ;S3中该两个门相对丰度之和为59.80%，S2中该两个门相对丰度之和为57.29%。可见，变形菌门和酸杆菌门在两个土壤样品中均占绝对优势。在门的水平上，S2和S3中的细菌门类和相对丰度差异不明显。图9为相对丰度排名前10位的细菌门。
2. 3. 4 細菌属水平的注释及相对丰度 在属的水平上，S2和S3中相对丰度排名前10位的细菌属为：Bryobacter、Candidatus Solibacter、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、Candidatus Koribacter、红微菌属（Rhodomicrobium）、Syntrophorhabdus、Anaeromyxobacter、Haliangium、Rhizomicrobium和堆囊粘细菌属（Sorangium）（图10）。注释出的相对丰度前10位的属仅属于两个门（变形菌门和酸杆菌门），其中7个属隶属于变形菌门：3个属（慢生根瘤菌属、红微菌属和Rhizomicrobium）隶属于变形菌门的根瘤菌目（Rhizobiales），3个属（Anaeromyxobacter、Haliangium和堆囊粘细菌属）隶属于变形菌门的粘细菌目（Myxococcales），Syntrophorhabdus隶属于变形菌门δ-变形菌纲未分目（unidentified Deltaproteobacteria）;3个属（Bryobacter、Candidatus Solibacter和Candidatus Koribacter）隶属于酸杆菌门。
S2和S3中相对丰度排名前10名的细菌属中有9个属在两种样品中的相对丰度相差1.00倍左右，仅有红微菌属相差2.23倍（在S2的相对丰度为0.53%，在S3的相对丰度为1.18%）。
3 讨论
针对水稻常规管理模式和稻鸭共育模式的土壤样品进行真菌和细菌的高通量测序，结果发现，两个样品中均注释出5个真菌门。子囊菌门是两个样品的优势门，自然界中子囊菌门也是已知真菌中最大的门，已知种类超过64000种（Wikipedia，2018a），营养方式有腐生、寄生和共生，其中寄生植物可引起植物病害（谢联辉，2006）。本研究的S2中，子囊菌门的相对丰度达93.67%，S3则相对多样化，除了子囊菌门（相对丰度42.36%）外，接合菌门和担子菌门的相对丰度也较高，分别为27.01%和11.62%，壶菌门的相对丰度为0.26%，也相对高于S2中壶菌门的相对丰度（0.02%）。接合菌门和担子菌门的大多数种类为腐生性，有些与植物共生形成菌根，少数可引起植物病害（谢联辉，2006）;壶菌门为水生真菌，大多数种类为腐生性，可降解甲壳素和角蛋白等难降解材料（Wikipedia，2018b），少数寄生植物引起病害。两个样品的囊球菌门相对丰度相当（S2为0.20%，S3为0.23%），已知的囊球菌门与超过80%的植物种类共生形成菌根，协助植物从土壤中吸收水分和矿质元素（Wikipedia，2018c）。
与S2相比，在S3中以营腐生生活为主的接合菌门和担子菌门的相对丰度比S2高11.95和8.13倍，其原因可能是稻鸭共育模式土壤中有机质含量更高，诱发具有腐生性真菌的繁殖并降解大分子有机质，尤其是壶菌门相对丰度比水稻常规管理模式土壤高13.00倍，是由于稻田中鸭毛的角蛋白大量存在而诱发可降解角蛋白等难降解材料的壶菌门一些种类的繁殖。 在S2中，相对丰度最高的属是黑盘孢属（6.66%），远大于S3的黑盘孢属（0.26%）;相对丰度居第2位的属是Minutisphaera（1.57%），S3中Minutisphaera的相对丰度为0.22%。黑盘孢属多数种类是木本阔叶植物衰老枝条的寄生菌（Voglmayr et al.，2012;Senanayake et al.，2017），Minutisphaera是淡水子囊菌的一个属，在淡水中的木质碎片上腐生（Ferrer et al.，2011;Raja et al.，2013）。这2个属在S2中的相对丰度均较高，其可能原因是：采集样品的水稻田位于大明山脚，自山上流下的带有木本植物枝条的流水到达水稻田后，水稻常规管理模式土壤中由于施用化肥、农药等化学物质使腐生性真菌種群减少，树枝腐烂慢，因而土壤中保留较多的寄生或腐生在树木枝条及其碎片上的黑盘孢属和Minutisphaera的真菌。
在S3中，相对丰度最高的属是毛壳菌属（2.63%），其相丰度大于S2（0.26%）;相对丰度居第2位的属是嗜热真菌属（2.21%），而S2中嗜热真菌属的相对丰度为0.05%。毛壳菌属和嗜热真菌属均隶属毛壳菌科粪壳菌目真菌，毛壳菌科多数为腐生菌，能产生纤维素酶、木聚糖酶和漆酶等，具有在常温条件和极端条件下分解纤维素和木质素的能力，在自然界的物质循环中起重要作用，有些种类可产生抗生素物质或其他代谢物质，而促进植物生长和提高抗病力（谭悠久，2005），但在一定条件下可导致木本植物病害或人类的皮肤病害（郭云忠，2012）;嗜热真菌属中的Mycothermus thermophilus（Syn. Scytalidium thermo-philum/Humicola insolens）在人工培养条件下可产生高浓度的纤维素酶和半纤维素酶，可降解稻草产生可发酵糖（Basotra et al.，2016）。稻鸭共育模式土壤中的嗜热真菌属可能在鸭粪发酵过程中产生的高温条件下产纤维素酶和半纤维素酶，使稻草降解成为土壤微生物或植物可直接利用的低分子化合物。
在S3中，相对丰度较高的还有2个属，分别是翅孢壳属（1.24%）和腥黑粉菌属（1.18%），在S2中翅孢壳属的相对丰度仅为0.09%，比S3少13.78倍，未发现腥黑粉菌属。据报道，翅孢壳属具有生物降解黄曲霉素的活性（Wang et al.，2018a），腥黑粉菌属中的狼尾草腥黑粉菌（Tilletiabarclayana）是稻粒黑粉病的病原菌（戴雷等，2011）。调查发现，在稻鸭共育模式中，由于没有施用化学农药，稻曲病（Ustilaginoidea virens）发生较严重。稻曲病的发生导致的谷粒受害是否易诱发黄曲霉菌，进而产生的黄曲霉素诱导能降解黄曲霉素的翅孢壳属真菌的繁殖、稻曲病菌可产生稻曲菌素（Ustiloxins）和黑粉菌素（Ustilaginoidins）（吕仕琼等，2010），翅孢壳属是否也能产生降解该两种毒素的物质等问题有待进一步探讨;田间是否在发生稻曲病的同时也发生稻粒黑粉病尚需进一步调研;如何有效控制有机稻种植的稻曲病问题，亦是需要攻关的难题。
有关细菌的种群多样性，高通量测序结果表明，S2和S3中的优势细菌门相同，S3中的变形菌门相对丰度为40.90%，高于S2（29.45%），但S3中的酸杆菌门相对丰度（18.90%）低于S2（27.84%）。据报道，变形菌门属于嗜营养菌，在含碳量丰富的环境中快速生长，而酸杆菌门是贫营养菌群，其丰度受土壤酸碱度调节，与土壤有机碳含量呈反比关系（逄好胜，2016）。S2的pH 5.34，有机质19.84 g/kg，S3的pH 5.10，有机质23.91 g/kg，说明S3的有机质含量稍高，变形菌门相对丰度也稍高;S2和S3的pH均为酸性，但S2的有机质含量稍低，因此，酸杆菌门的相对丰度稍高，与逄好胜（2016）的报道相吻合。
相对丰度排名前10位的细菌属中有3个属隶属酸杆菌门、7个属隶属变形菌门，变形菌门的7个属分别归于2个目，即粘细菌目和根瘤菌目。粘细菌目的细菌因能形成对温度、干旱、辐射、盐胁迫均具有抗性的粘孢子而具有较高的环境适应力，广泛分布于全球各地的土壤中;此外，草食动物粪便、腐败植物表面、树皮、树叶表面甚至水体中也发现粘细菌的存在;粘细菌为有机化能自养型，能降解利用较多的生物大分子（周秀文，2013）。根瘤菌目的多数种类可与豆科植物根系共生形成根瘤并具有固氮作用。本研究注释到的慢生根瘤菌属的很多种类可与豆科植物共生形成根瘤，并具有固氮作用，有些种类是森林土壤微生物群落的主要组分，不能形成根瘤，也没有固氮能力，与典型的固氮菌相比生长更慢。本研究采集土壤样品的田块位于山谷之中，慢生根瘤菌属有可能随水流进入稻田。在多篇涉及高通量测序土壤微生物种群的文献中均可见到Rhizomicrobium的报道（逄好胜，2016;Ishaq et al.， 2017;Wang et al.， 2018b），但未查阅到Rhizomicrobium相关特性的报道。红微菌属是一种需微氧至厌氧的紫色光合细菌，具有菌绿素A和B，可进行光合作用（Wikipedia，2018d）;紫色光合细菌具有极其多样的碳源代谢能力，可代谢几乎所有的发酵产物，包括CO2、小分子有机酸和CH4等，同时是一种自生固氮菌，具有固氮能力，可为稻田提供氮素，进而提高土壤肥力（俎千惠等，2016）。有机质含量偏低的S2中，红微菌属的相对丰度为0.53%，而有机质含量较高的S3为1.18%。可见，红微菌属的相对丰度与土壤有机质含量呈正相关。
虽然两种水稻管理模式土壤中均以腐生菌为主，但稻鸭共育模式中微生物种群更丰富。土壤微生物可降解土壤中的各种有机物，包括植物、动物及微生物的残体（宋勇春等，2001;王满等，2017），为水稻提供更丰富的可吸收的营养物质;同时，土壤微生物可转化和释放水稻生长必需的营养元素，如自生固氮微生物可将大气中的氮气合成氨后被水稻吸收利用（沈仁芳和赵学强，2015;潘彦硕等，2018），解磷、解钾微生物可释放土壤中的磷、钾及其他矿质营养元素等（金崇伟等，2005;党雯等，2014;乔志伟，2017），满足和促进水稻的健康生长。因此，土壤微生物种群多样性丰富，是土壤健康、活力旺盛的表现，在健康的土壤中种植水稻也相应地表现出更强的生长势和抗逆性。 张薇，魏海雷，高洪文，胡跃高. 2005. 土壤微生物多样性及其环境影响因子研究进展[J]. 生态学杂志，24（1）： 48-52. [Zhang W，Wei H L，Gao H W，Hu Y G. 2005. Advan-ces of studies on soil microbial diversity and environmental impact factors[J]. Chinese Journal of Ecology，24（1）：48-52.]
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（責任编辑 麻小燕）
关键词： 稻鸭共育模式;水稻;根际土壤;真菌;细菌;种群多样性
中图分类号： S344 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0059-09
0 引言
【研究意義】微生物是土壤有机物的分解者（王芳和图力古尔，2014），同时是土壤有机质和养分转化与循环的动力，是土壤中植物有效养分的储备库（徐一兰等，2016），土壤微生物群落变化在一定程度上可反映土壤质量的变化趋势（张薇等，2005）。稻鸭共育模式种植水稻是指通过鸭子除草除虫及排便肥田，免施化肥与化学农药（含除草剂）的水稻种植方式;而常规种植模式需通过施用化肥、化学农药及除草剂进行管理。化肥和化学农药的过量施用会导致土壤酸化，土壤微生物种群结构也相应发生变化。因此，探讨该两种栽培模式下水稻根际土壤酸度、有机质含量及微生物的种群多样性，对发展有机水稻产业具有重要意义。【前人研究进展】随着分子生物学和高通量测序技术的发展，近几年有关土壤微生物多样性的研究报道较多。王轶等（2014）以有20年历史的长期定位试验田为研究对象，利用末端限制性片段长度多态性分析技术研究土壤真菌群落的多样性，结果发现长期施用有机肥与施用化肥相比可提高土壤真菌多样性，改变其群落结构;陆晓菊等（2015）采用人工分离和PCR研究三七连作6年的健康植株与根腐病植株根际土壤细菌种群结构，结果发现三七连作土传病害的发生与土壤细菌的种群结构及其优势细菌的种群比例具有密切的关联性;杜思瑶等（2017）采用Illumina平台Hiseq 2500高通量测序技术，研究有机和常规设施种植模式及轮作对土壤细菌多样性和群落结构的影响，结果表明有机设施种植的土壤细菌多样性高于常规设施种植，有机设施种植下轮作与连作土壤的细菌群落结构表现出明显差异，而常规设施种植下轮作与连作土壤的细菌群落结构无明显差异;韦俊等（2017）采用16S rRNA测序技术分析不同套作模式下烤烟根际土壤细菌群落结构及多样性差异，发现套种模式比单作烤烟根际土壤细菌多样性明显提高，且不同程度地降低土壤中潜在的致病菌丰度。可见，土壤微生物种群结构多样性与植物的健康生长密切相关。【本研究切入点】前人主要针对旱地中的土壤细菌或真菌种群多样性进行研究，而针对稻鸭共育模式和常规管理模式下稻田土壤微生物种群多样性的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】基于Illumina MiSeq测序平台，利用双末端（Paired-End）测序方法，构建真菌ITS1～ITS2区域和细菌16S rDNA扩增子V3～V4区域的小片段文库，进行双末端测序，分析稻鸭共育模式与常规管理模式稻田土壤真菌和细菌的种类及丰度差异，揭示化肥和农药对土壤微生物种群结构的潜在影响，为利用土壤微生物多样性开展水稻生态栽培提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 土壤样品采集
于水稻蜡熟期（2017年7月18日）从广西宾阳县思陇镇采集水稻根际土壤，采样时水稻即将收获，田水已排干，土壤已基本硬化。采自水稻常规管理模式水稻田的土壤样品标记为S2，该田块采用化肥、化学农药和除草剂进行常规管理;采自稻鸭共育模式水稻田的土壤样品标记为S3，该田块位于常规管理模式田块的隔壁。用五点取样法，每点连根带泥拔2株水稻植株，共10株，收集根际土壤混匀后带回实验室。每处理土壤样品分成2份，1份用于pH和有机质含量检测，1份用于DNA提取和测序。 1. 2 土壤样品pH和有机质含量检测
采用电位法（S220型梅特勒—托利多酸度计）测定土壤pH，水∶土=2.5∶1.0。用重铬酸钾—外加热法测定土壤有机质含量（鲍士旦，2000）。
1. 3 土壤样品真菌ITS1～ITS2区域和细菌16S rDNA扩增子V3～V4区域测序及多样性分析
提取土壤的总DNA，针对真菌的核糖体内转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）的ITS1～ITS2区域，及细菌16S rDNA扩增子序列（16S rDNA amplicon sequencing）V3～V4区域，基于Illumina MiSeq测序平台，利用双末端测序方法构建小片段文库进行双末端测序（2×300 bp）。通过对Reads拼接过滤、操作分类单元（Operational taxonomic units，OTUs）聚类、物种注释及丰度分析，根据物种注释结果，选取每个样品在不同分类水平上最大丰度排名前10的物种及其相对丰度绘制柱形累加图，以便直观查看各样品在不同分类水平上相对丰度较高的物种及其比例;再对OTUs进行Alpha多样性指数等分析，对不同样品在97%一致性阈值水平下的Alpha多样性指数进行统计，比较样品间的差异。样品测序与分析委托广西普斐生物信息科技有限公司完成。
2 结果与分析
2. 1 土壤样品pH和有机质含量测定结果
两种水稻栽培管理模式土壤样品的测定结果显示，S2的pH为5.34，有机质含量为19.84 g/kg;S3的pH为5.10，有机质含量为23.91 g/kg。可见，两种模式的土壤样品均呈酸性，与常规管理模式比较，稻鸭共育模式的土壤有机质含量增加，但土壤pH略低。
2. 2 土壤样品真菌种群多样性分析结果
2. 2. 1 测序数据的获得 从S2的总DNA中测得原始序列36073条，平均每条长度为280 nt，对原始数据进行拼接、过滤，得到有效序列35425条，有效率98.20%;从S3的总DNA中获得原始序列38843条，平均每条长度283 nt，有效序列38438条，有效率98.96%。从OTUs丰度稀释曲线（图1）可看出，随着测序数据量的增大，稀释曲线斜率逐渐下降，趋向平坦，说明测序数据量足够反映出样品中的物种组成特征。从样品分类等级稀释曲线（图2）可看出，S3中的物种丰富度和均匀度均高于S2。
2. 2. 2 OTU分析结果 使用UPARSE对样品的有效序列进行聚类，相似性≥97%的tag聚为同一OTU，共获得436个OTUs，使用代表性序列与每个样品进行比较，发现S2包含260个OTUs，而S3包含373个OTUs。将所有样品进行均一化处理后绘制韦恩图，分析不同样品间共有和特有的OTUs，结果如图3所示。S2和S3有197个共有OTUs，S2特有的OTUs 63個，S3特有的OTUs 176个，即S3的真菌种类多于S2。S2和S3的Chao1指数分别为362.14和381.78，Shannon指数分别为2.20和5.45。可见，与S2比较，S3的真菌种群更丰富。
2. 2. 3 真菌门水平的注释及相对丰度 使用UNITE ITS数据库对OTUs的代表序列进行物种注释。在真菌门的水平上共注释出5个门，包括子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和囊球菌门（Glomeromycota）。S2和S3的最优势门均是子囊菌门;S2中，子囊菌门的相对丰度为93.67%、接合菌门为2.26%、担子菌门为1.43%、囊球菌门为0.20%、壶菌门为0.02%，其他门（Others）的相对丰度之和为2.43%;S3中，子囊菌门的相对丰度为42.36%、接合菌门为27.01%、担子菌门为11.62%、壶菌门为0.26%、囊球菌门为0.23%，其他门（Others）的相对丰度之和为18.54%。图4为相对丰度排名前5位的真菌门。S3中的接合菌门、担子菌门和壶菌门的相对丰度均比S2高，分别是S2相应门的11.95、8.13和13.00倍，但子囊菌门比S2低，S2是S3的2.21倍，囊球菌门的相对丰度相当。
2. 2. 4 真菌属水平的注释及相对丰度 在属的水平上，S2注释出34个属，S3注释出41个属;但S2有87%的序列、S3有79%的序列不能注释出来，原因可能是测序的reads不够长或ITS的区分度不够高，不能区分出不同的属。图5为相对丰度排名前10位的真菌属。
在S2中，黑盘孢属（Melanconiella）的相对丰度为6.66%，为优势属，S3中黑盘孢属的相对丰度为0.26%，两者相差25.62倍。黑盘孢属的分类地位是黑盘孢科（Melanconidaceae）间座壳目（Diaporthales）粪壳菌纲（Sordariomycetes）子囊菌门。S2中相对丰度居第2位的属是Minutisphaera（1.57%），S3中Minutisphaera的相对丰度为0.22%，两者相差7.14倍。Minutisphaera的分类地位是座囊菌纲未分科（Incertae sedis Dothideomycetes）座囊菌纲未分目（Incertae sedis Dothideomycetes）座囊菌纲（Dothideomycetes）子囊菌门。
在S3中，毛壳菌属（Chaetomium）的相对丰度为2.63%，为优势属，S2中毛壳菌属的相对丰度为0.26%，两者相差10.12倍。毛壳菌属的分类地位是毛壳菌科（Chaetomiaceae）粪壳菌目（Sordariales）粪壳菌纲子囊菌门。S3中相对丰度居第2位的属是嗜热真菌属（Mycothermus），相对丰度为2.21%，S2中嗜热真菌属的相对丰度为0.05%，两者相差44.20倍。嗜热真菌属的分类地位为毛壳菌科粪壳菌目粪壳菌纲子囊菌门。 此外，在S3中相对丰度大于1.00%的属还有2个，分别是翅孢壳属（Emericellopsis，相对丰度1.24%）和腥黑粉菌属（Tilletia，相对丰度1.18%）;在S2中，翅孢壳属的相对丰度为0.09%，与S3相差13.78倍，但未发现腥黑粉菌属。翅孢壳属的分类地位是肉座菌目未分科（Incertae sedis Hypocreales）肉座菌目（Hypocreales）粪壳菌纲子囊菌门。腥黑粉菌属的分类地位是腥黑粉菌科（Tilletiaceae）腥黑粉菌目（Tilletiales）外担子菌纲（Exobasidiomycetes）担子菌门。
2. 3 细菌种群多样性分析结果
2. 3. 1 测序数据的获得 从S2的总DNA中获得原始序列33396条，有效序列30854条，有效率92.39%，平均每条长度456 nt;从S3的总DNA中获得原始序列37875条，有效序列34050条，有效率89.90%，平均每条长度457 nt。从OTUs丰度稀释曲线（图6）可看出，随着测序数据量的增大，稀释曲线斜率逐渐下降，趋向平坦，说明测序数据量足够反映出样品中的物种组成特征。从细菌分类等级稀释曲线（图7）可看出，S2和S3中物种的丰富度和均匀度差异不明显。
2. 3. 2 OTU分析 使用UPARSE对样品的有效序列进行聚类，相似性≥97%的tag聚为同一OTUs，共获得484个OTUs，使用代表性序列与每个样品进行比较，发现S2包含454个OTUs，S3包含468个OTUs。OTUs的韦恩图见图8，S2和S3有438个共有OTUs ，S2特有16个OTUs ，S3特有30个OTUs，说明S2和S3的细菌种类差异不明显。S2和S3的Chao1指数分别为459.25和470.64，Shannon指数分别为7.801和7.854。可见，S3的细菌种群多样性与S2无明显差异。
2. 3. 3 细菌门水平的注释及相对丰度 使用Silva 16s rRNA数据库对OTUs的代表序列进行物种注释，以分析其物种组成。在细菌门的水平上，S2和S3中的优势细菌门一致，相对丰度前5个门依次是变形菌门（Proteobacteria）>酸杆菌门（Acidobacteria）>硝化螺旋菌门（Nitrospirae）>绿弯菌门（Chloroflexi）>拟杆菌门（Bacteroidetes）。其中，S3中的变形菌门相对丰度为40.90%，高于S2（29.45%），两者相差1.38倍，S3中的酸杆菌门相对丰度（18.90%）小于S2（27.84%），两者相差1.47倍 ;S3中该两个门相对丰度之和为59.80%，S2中该两个门相对丰度之和为57.29%。可见，变形菌门和酸杆菌门在两个土壤样品中均占绝对优势。在门的水平上，S2和S3中的细菌门类和相对丰度差异不明显。图9为相对丰度排名前10位的细菌门。
2. 3. 4 細菌属水平的注释及相对丰度 在属的水平上，S2和S3中相对丰度排名前10位的细菌属为：Bryobacter、Candidatus Solibacter、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、Candidatus Koribacter、红微菌属（Rhodomicrobium）、Syntrophorhabdus、Anaeromyxobacter、Haliangium、Rhizomicrobium和堆囊粘细菌属（Sorangium）（图10）。注释出的相对丰度前10位的属仅属于两个门（变形菌门和酸杆菌门），其中7个属隶属于变形菌门：3个属（慢生根瘤菌属、红微菌属和Rhizomicrobium）隶属于变形菌门的根瘤菌目（Rhizobiales），3个属（Anaeromyxobacter、Haliangium和堆囊粘细菌属）隶属于变形菌门的粘细菌目（Myxococcales），Syntrophorhabdus隶属于变形菌门δ-变形菌纲未分目（unidentified Deltaproteobacteria）;3个属（Bryobacter、Candidatus Solibacter和Candidatus Koribacter）隶属于酸杆菌门。
S2和S3中相对丰度排名前10名的细菌属中有9个属在两种样品中的相对丰度相差1.00倍左右，仅有红微菌属相差2.23倍（在S2的相对丰度为0.53%，在S3的相对丰度为1.18%）。
3 讨论
针对水稻常规管理模式和稻鸭共育模式的土壤样品进行真菌和细菌的高通量测序，结果发现，两个样品中均注释出5个真菌门。子囊菌门是两个样品的优势门，自然界中子囊菌门也是已知真菌中最大的门，已知种类超过64000种（Wikipedia，2018a），营养方式有腐生、寄生和共生，其中寄生植物可引起植物病害（谢联辉，2006）。本研究的S2中，子囊菌门的相对丰度达93.67%，S3则相对多样化，除了子囊菌门（相对丰度42.36%）外，接合菌门和担子菌门的相对丰度也较高，分别为27.01%和11.62%，壶菌门的相对丰度为0.26%，也相对高于S2中壶菌门的相对丰度（0.02%）。接合菌门和担子菌门的大多数种类为腐生性，有些与植物共生形成菌根，少数可引起植物病害（谢联辉，2006）;壶菌门为水生真菌，大多数种类为腐生性，可降解甲壳素和角蛋白等难降解材料（Wikipedia，2018b），少数寄生植物引起病害。两个样品的囊球菌门相对丰度相当（S2为0.20%，S3为0.23%），已知的囊球菌门与超过80%的植物种类共生形成菌根，协助植物从土壤中吸收水分和矿质元素（Wikipedia，2018c）。
与S2相比，在S3中以营腐生生活为主的接合菌门和担子菌门的相对丰度比S2高11.95和8.13倍，其原因可能是稻鸭共育模式土壤中有机质含量更高，诱发具有腐生性真菌的繁殖并降解大分子有机质，尤其是壶菌门相对丰度比水稻常规管理模式土壤高13.00倍，是由于稻田中鸭毛的角蛋白大量存在而诱发可降解角蛋白等难降解材料的壶菌门一些种类的繁殖。 在S2中，相对丰度最高的属是黑盘孢属（6.66%），远大于S3的黑盘孢属（0.26%）;相对丰度居第2位的属是Minutisphaera（1.57%），S3中Minutisphaera的相对丰度为0.22%。黑盘孢属多数种类是木本阔叶植物衰老枝条的寄生菌（Voglmayr et al.，2012;Senanayake et al.，2017），Minutisphaera是淡水子囊菌的一个属，在淡水中的木质碎片上腐生（Ferrer et al.，2011;Raja et al.，2013）。这2个属在S2中的相对丰度均较高，其可能原因是：采集样品的水稻田位于大明山脚，自山上流下的带有木本植物枝条的流水到达水稻田后，水稻常规管理模式土壤中由于施用化肥、农药等化学物质使腐生性真菌種群减少，树枝腐烂慢，因而土壤中保留较多的寄生或腐生在树木枝条及其碎片上的黑盘孢属和Minutisphaera的真菌。
在S3中，相对丰度最高的属是毛壳菌属（2.63%），其相丰度大于S2（0.26%）;相对丰度居第2位的属是嗜热真菌属（2.21%），而S2中嗜热真菌属的相对丰度为0.05%。毛壳菌属和嗜热真菌属均隶属毛壳菌科粪壳菌目真菌，毛壳菌科多数为腐生菌，能产生纤维素酶、木聚糖酶和漆酶等，具有在常温条件和极端条件下分解纤维素和木质素的能力，在自然界的物质循环中起重要作用，有些种类可产生抗生素物质或其他代谢物质，而促进植物生长和提高抗病力（谭悠久，2005），但在一定条件下可导致木本植物病害或人类的皮肤病害（郭云忠，2012）;嗜热真菌属中的Mycothermus thermophilus（Syn. Scytalidium thermo-philum/Humicola insolens）在人工培养条件下可产生高浓度的纤维素酶和半纤维素酶，可降解稻草产生可发酵糖（Basotra et al.，2016）。稻鸭共育模式土壤中的嗜热真菌属可能在鸭粪发酵过程中产生的高温条件下产纤维素酶和半纤维素酶，使稻草降解成为土壤微生物或植物可直接利用的低分子化合物。
在S3中，相对丰度较高的还有2个属，分别是翅孢壳属（1.24%）和腥黑粉菌属（1.18%），在S2中翅孢壳属的相对丰度仅为0.09%，比S3少13.78倍，未发现腥黑粉菌属。据报道，翅孢壳属具有生物降解黄曲霉素的活性（Wang et al.，2018a），腥黑粉菌属中的狼尾草腥黑粉菌（Tilletiabarclayana）是稻粒黑粉病的病原菌（戴雷等，2011）。调查发现，在稻鸭共育模式中，由于没有施用化学农药，稻曲病（Ustilaginoidea virens）发生较严重。稻曲病的发生导致的谷粒受害是否易诱发黄曲霉菌，进而产生的黄曲霉素诱导能降解黄曲霉素的翅孢壳属真菌的繁殖、稻曲病菌可产生稻曲菌素（Ustiloxins）和黑粉菌素（Ustilaginoidins）（吕仕琼等，2010），翅孢壳属是否也能产生降解该两种毒素的物质等问题有待进一步探讨;田间是否在发生稻曲病的同时也发生稻粒黑粉病尚需进一步调研;如何有效控制有机稻种植的稻曲病问题，亦是需要攻关的难题。
有关细菌的种群多样性，高通量测序结果表明，S2和S3中的优势细菌门相同，S3中的变形菌门相对丰度为40.90%，高于S2（29.45%），但S3中的酸杆菌门相对丰度（18.90%）低于S2（27.84%）。据报道，变形菌门属于嗜营养菌，在含碳量丰富的环境中快速生长，而酸杆菌门是贫营养菌群，其丰度受土壤酸碱度调节，与土壤有机碳含量呈反比关系（逄好胜，2016）。S2的pH 5.34，有机质19.84 g/kg，S3的pH 5.10，有机质23.91 g/kg，说明S3的有机质含量稍高，变形菌门相对丰度也稍高;S2和S3的pH均为酸性，但S2的有机质含量稍低，因此，酸杆菌门的相对丰度稍高，与逄好胜（2016）的报道相吻合。
相对丰度排名前10位的细菌属中有3个属隶属酸杆菌门、7个属隶属变形菌门，变形菌门的7个属分别归于2个目，即粘细菌目和根瘤菌目。粘细菌目的细菌因能形成对温度、干旱、辐射、盐胁迫均具有抗性的粘孢子而具有较高的环境适应力，广泛分布于全球各地的土壤中;此外，草食动物粪便、腐败植物表面、树皮、树叶表面甚至水体中也发现粘细菌的存在;粘细菌为有机化能自养型，能降解利用较多的生物大分子（周秀文，2013）。根瘤菌目的多数种类可与豆科植物根系共生形成根瘤并具有固氮作用。本研究注释到的慢生根瘤菌属的很多种类可与豆科植物共生形成根瘤，并具有固氮作用，有些种类是森林土壤微生物群落的主要组分，不能形成根瘤，也没有固氮能力，与典型的固氮菌相比生长更慢。本研究采集土壤样品的田块位于山谷之中，慢生根瘤菌属有可能随水流进入稻田。在多篇涉及高通量测序土壤微生物种群的文献中均可见到Rhizomicrobium的报道（逄好胜，2016;Ishaq et al.， 2017;Wang et al.， 2018b），但未查阅到Rhizomicrobium相关特性的报道。红微菌属是一种需微氧至厌氧的紫色光合细菌，具有菌绿素A和B，可进行光合作用（Wikipedia，2018d）;紫色光合细菌具有极其多样的碳源代谢能力，可代谢几乎所有的发酵产物，包括CO2、小分子有机酸和CH4等，同时是一种自生固氮菌，具有固氮能力，可为稻田提供氮素，进而提高土壤肥力（俎千惠等，2016）。有机质含量偏低的S2中，红微菌属的相对丰度为0.53%，而有机质含量较高的S3为1.18%。可见，红微菌属的相对丰度与土壤有机质含量呈正相关。
虽然两种水稻管理模式土壤中均以腐生菌为主，但稻鸭共育模式中微生物种群更丰富。土壤微生物可降解土壤中的各种有机物，包括植物、动物及微生物的残体（宋勇春等，2001;王满等，2017），为水稻提供更丰富的可吸收的营养物质;同时，土壤微生物可转化和释放水稻生长必需的营养元素，如自生固氮微生物可将大气中的氮气合成氨后被水稻吸收利用（沈仁芳和赵学强，2015;潘彦硕等，2018），解磷、解钾微生物可释放土壤中的磷、钾及其他矿质营养元素等（金崇伟等，2005;党雯等，2014;乔志伟，2017），满足和促进水稻的健康生长。因此，土壤微生物种群多样性丰富，是土壤健康、活力旺盛的表现，在健康的土壤中种植水稻也相应地表现出更强的生长势和抗逆性。 张薇，魏海雷，高洪文，胡跃高. 2005. 土壤微生物多样性及其环境影响因子研究进展[J]. 生态学杂志，24（1）： 48-52. [Zhang W，Wei H L，Gao H W，Hu Y G. 2005. Advan-ces of studies on soil microbial diversity and environmental impact factors[J]. Chinese Journal of Ecology，24（1）：48-52.]
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Wikipedia. 2018c. Glomeromycota[EB/OL]. https：//en.wikipedia.org/wiki/Glomeromycota.
Wikipedia. 2018d. Rhodomicrobium[EB/OL]. https：//en.wikipedia.org/wiki/Rhodomicrobium.
（責任编辑 麻小燕）