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摘要
[目的] 研究自制的板蓝根多糖对鸡新城疫弱毒疫苗的免疫效果。[方法] 将120只健康AA 肉仔鸡随机分为板蓝根多糖组、黄芪多糖组以及生理盐水对照组，研究板蓝根多糖对鸡新城疫Lasota疫苗的免疫增强作用。[结果]板蓝根多糖组和黄芪多糖组鸡NDV血凝抑制抗体滴度差异不显著，而板蓝根多糖组和黄芪多糖组鸡的免疫器官指数都显著高于生理盐水对照组。[结论] 制备的板蓝根多糖可以用作鸡新城疫弱毒疫苗的免疫增强剂。
关键词板蓝根；多糖；新城疫；Lasota疫苗；免疫效果
中图分类号S853.7文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12920-02
Abstract[Objective] The research aimed to study the immune effects of selfprepared polysaccharide of Isatis root on the attenuated vaccine of chicken newcastle disease. [Method] 120 healthy AA broiler chicken were randomly divided into Isatis root polysaccharide group，Astragalus polysaccharide group and normal saline control group. The immuneenhancing effects of Isatis root polysaccharide on Lasota vaccine of chicken newcastle disease were studied. [Result] HI antibody titer of chicken NDV had no significant difference between Isatis root polysaccharide and Astragalus polysaccharide group. The immune organ index of broilers in Isatis root polysaccharide and Astragalus polysaccharide group was significantly higher than that of normal saline control group. [Conclusion] The prepared polysaccharide of Isatis root could be used as the immune enhancer of attenuated vaccine of chicken newcastle disease.
Key wordsIsatis root； Polysaccharide； Newcastle disease； Lasota vaccine； Immune effects
新城疫是由副黏病毒引起的鸡、火鸡、鸽等禽类的一种烈性传染病，给我国养禽业造成了巨大损失。虽然新城疫疫苗的应用有效地减少新城疫对养禽业的危害，但近年来由于病毒的变异以及疫苗或者抗生素的滥用常常导致养鸡场鸡新城疫的免疫失败。最新研究表明，免疫增强剂的应用可以有效减少免疫失败的发生。研究表明，许多种中药多糖都具有明显的免疫增强作用。基于此，笔者制备了板蓝根多糖，研究其对鸡新城疫弱毒疫苗免疫的效果。
1材料与方法
1.1材料与仪器
黄芪多糖，购于山西兆益生物有限公司；板蓝根多糖，自制；新城疫Lasota株弱毒疫苗，购自南京天邦生物科技有限公司；鸡新城疫HI测试抗原（由动物医学院微生物实验室提供）；离心机；微量移液器。
1.2试验动物
1日龄非免疫健康AA肉鸡120只，由江苏农牧科技职业学院实验动物房代购。
1.3试验方法
1.3.1药物提取与试剂制备。
1.3.1.1阿氏液配制。称取葡萄糖2.05 g、氯化钠0.42 g、柠檬酸钠0.80 g，放入装有850 ml三蒸水的烧杯中，用0.1%柠檬酸溶液，缓慢滴加，调节pH至7.2，用1 000 ml容量瓶定容至1 000 ml后用无菌滤膜过滤除菌，置于 4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.1.2鸡红细胞悬液的制备。采集鸡外周血5 ml，转移到20 ml阿氏液中，4 ℃下保存。使用前，先用生理盐水洗涤，然后2 000 r/min离心5 min，共洗涤3次后，用生理盐水配制成红细胞悬液浓度为1%。
1.3.1.3板蓝根多糖的制备。板蓝根饮片购自泰州芝林大药房。取板蓝根饮片200 g，加入2 000 ml三蒸水微沸煎煮2 h，过滤，滤渣加入2 000 ml三蒸水微沸煎煮1.5 h，趁热过滤。合并2次所得滤液浓缩至200 ml加入无水乙醇800 ml，调整醇浓度80%。静置过夜，弃去上清将所得沉淀溶于100 ml蒸馏水中，加入400 ml无水乙醇调整最终含醇量为80%，静置过夜，弃上清，将沉淀在60 ℃恒温干燥箱中烘干，称重。使用前，用三蒸水配制成10 mg/ml，高压灭菌，4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.2动物分组及处理。
健康AA 肉仔鸡120只，随机分为3组：板蓝根多糖组（Ⅱ）、黄芪多糖组（Ⅰ）以及生理盐水对照组（Ⅲ），每组40只。4日龄分别用10 mg/ml黄芪多糖、10 mg/ml板蓝根多糖、生理盐水注射液，以0.5 ml/羽的剂量进行肌肉注射，每天1次，连用3 d；7日龄用新城疫Ⅳ系弱毒苗点眼滴鼻免疫，21日龄用1羽份的新城疫Ⅳ弱毒苗二免，0.3 ml/羽（表1）。免疫后分别于7、14、21、28、35、42、49日龄随机选取5只鸡，通过翅静脉采血，待血液凝固后，分离血清，然后通过血凝抑制试验检测鸡新城疫血凝抑制抗体效价。分别于14、21、28、35及42日龄随机取6只鸡，放血致死后称重，分别摘取脾脏、胸腺、法氏囊并逐一称重，计算每只鸡的免疫器官指数。 表1试验分组与处理
组别7日龄21日龄
ⅠNDV弱毒疫苗+黄芪多糖NDV弱毒疫苗+黄芪多糖
ⅡNDV弱毒疫苗+板蓝根多糖NDV弱毒疫苗+板蓝根多糖
ⅢNDV弱毒疫苗+生理盐水NDV弱毒疫苗+生理盐水
1.3.3鸡血清新城疫血凝抑制抗体效价检测。
1.3.3.1NDV抗原效价的测定。
取96孔微量血凝板，第1排从左侧开始的第1～12孔按照50 μl/孔的剂量加入PBS溶液，第2排和第3排重复操作。向每排第1孔加入50 μl的新城疫病毒诊断抗原，反复吹吸3次后，吸取50 μl加入第2孔，同样操作依次向后进行2倍稀释，一直稀释到第11孔，然后将第11孔吸取50 μl弃去，第12孔不添加病毒抗原液。然后，取1%鸡红细胞悬液，轻轻摇动混匀后，按照50 μl/孔的剂量向每孔加入红细胞悬液，然后将微量板振动30 s，置于37 ℃温箱中作用30 min，观察结果。经测定该诊断液的抗原凝集价为26，由此确定4单位抗原的稀释度为24。
1.3.3.2血凝抑制试抗体效价的测定。
取96孔微量血凝板，从第1排从左到右的第1～11孔各加入50 μl 的磷酸盐缓冲溶液，再向第1排的第1孔加入50 μl待检血清，然后，依次向后进行2倍的倍比稀释，一直稀释到第10孔，第11孔加入阳性血清，第12孔加入阴性血清。第2排和第3排作重复。倍比稀释完成后向每孔加入配制好的4单位新城疫病毒抗原（将新城疫病毒诊断抗原进行16倍稀释）50 μl/孔，振荡混匀30 s，放入37 ℃温箱。 20 min后，取出向每孔加入1%鸡红细胞悬液50 μl/孔。振荡混匀，然后置于37 ℃恒温箱中作用30 min，观察结果。
2结果与分析
2.1新城疫血凝抑制抗体效价
从图1可以看出，7日龄板蓝根多糖组的新城疫HI抗体效价略高于生理盐水对照组（P>0.05）、黄芪多糖组的HI抗体效价略高于生理盐水对照组（P>0.05）。14日龄以后，板蓝根多糖组、黄芪多糖组HI抗体效价显著高于生理盐水对照组（P<0.05），黄芪多糖组抗体效价较板蓝根多糖组抗体效价稍高，但差异不显著。这种差异显著性在28、35、42日龄仍然持续（P<0.05），42日龄抗体效价达到最高峰，49日龄抗体效价开始下降。
3讨论
抗体是介导体液免疫的重要成分。抗体效价的高低直接反映着机体的体液免疫状态[1]。该试验结果表明板蓝根多糖能显著提高鸡的NDHI抗体滴度水平，而且在提高抗体效价方面与黄芪多糖的免疫增强效果差异不显著。
临床上给鸡群接种新城疫疫苗后，许多因素都可以导致免疫失败，其中最重要的因素是疫苗保护率低和某些免疫抑制因素所致[2]。筛选和开发免疫增强剂势在必行，目前用于免疫增强剂包括：细胞因子（如白介素2）、中药成分（如黄芪多糖多糖、香菇多糖等）可以增强机体的免疫应答过程，提高免疫效果[3]，增强了动物机体的抗病能力[4]。研究表明，板
蓝根多糖能增强机体免疫功能，增强巨噬细胞的吞噬活性，
诱导生成干扰素，是较好的免疫刺激剂[5]。该试验结果表明板蓝根多糖能够促进免疫器官（如脾脏、法氏囊）的发育，从而促进B淋巴细胞的生长。作为新型的免疫增强剂，板蓝根多糖在提高动物机体的免疫功能和预防畜禽疾病方面有重要作用，为减少畜禽产品中的化学药物残留，保障人民的食品安全方面发挥更为重要的作用。
参考文献
[1] 郭新华，邱妍，严桂芹，等.板蓝根多糖对鸡新城疫抗体滴度和免疫器官指数的影响[J].饲料工业，2007（28）：50-52.
[2] 魏国，钟肖.地塞米松对ND免疫鸡主要免疫器官及抗体滴度的影响[J].畜禽业，2009（8）：14-17.
[3] 卢宇，张金秋，邓碧华，等.补中益气汤对雏鸡免疫功能的影响[J].中兽医学杂志，2011（6）：6-9.
[4] 张殿新.芪蓝四君子汤对新城疫疫苗免疫效果的影响[D].保定：河北农业大学，2010.
[5] 郑铁锁.复方中药的增强免疫作用和对雏鸡的安全性测定[D].南京：南京农业大学，2009.
[目的] 研究自制的板蓝根多糖对鸡新城疫弱毒疫苗的免疫效果。[方法] 将120只健康AA 肉仔鸡随机分为板蓝根多糖组、黄芪多糖组以及生理盐水对照组，研究板蓝根多糖对鸡新城疫Lasota疫苗的免疫增强作用。[结果]板蓝根多糖组和黄芪多糖组鸡NDV血凝抑制抗体滴度差异不显著，而板蓝根多糖组和黄芪多糖组鸡的免疫器官指数都显著高于生理盐水对照组。[结论] 制备的板蓝根多糖可以用作鸡新城疫弱毒疫苗的免疫增强剂。
关键词板蓝根；多糖；新城疫；Lasota疫苗；免疫效果
中图分类号S853.7文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12920-02
Abstract[Objective] The research aimed to study the immune effects of selfprepared polysaccharide of Isatis root on the attenuated vaccine of chicken newcastle disease. [Method] 120 healthy AA broiler chicken were randomly divided into Isatis root polysaccharide group，Astragalus polysaccharide group and normal saline control group. The immuneenhancing effects of Isatis root polysaccharide on Lasota vaccine of chicken newcastle disease were studied. [Result] HI antibody titer of chicken NDV had no significant difference between Isatis root polysaccharide and Astragalus polysaccharide group. The immune organ index of broilers in Isatis root polysaccharide and Astragalus polysaccharide group was significantly higher than that of normal saline control group. [Conclusion] The prepared polysaccharide of Isatis root could be used as the immune enhancer of attenuated vaccine of chicken newcastle disease.
Key wordsIsatis root； Polysaccharide； Newcastle disease； Lasota vaccine； Immune effects
新城疫是由副黏病毒引起的鸡、火鸡、鸽等禽类的一种烈性传染病，给我国养禽业造成了巨大损失。虽然新城疫疫苗的应用有效地减少新城疫对养禽业的危害，但近年来由于病毒的变异以及疫苗或者抗生素的滥用常常导致养鸡场鸡新城疫的免疫失败。最新研究表明，免疫增强剂的应用可以有效减少免疫失败的发生。研究表明，许多种中药多糖都具有明显的免疫增强作用。基于此，笔者制备了板蓝根多糖，研究其对鸡新城疫弱毒疫苗免疫的效果。
1材料与方法
1.1材料与仪器
黄芪多糖，购于山西兆益生物有限公司；板蓝根多糖，自制；新城疫Lasota株弱毒疫苗，购自南京天邦生物科技有限公司；鸡新城疫HI测试抗原（由动物医学院微生物实验室提供）；离心机；微量移液器。
1.2试验动物
1日龄非免疫健康AA肉鸡120只，由江苏农牧科技职业学院实验动物房代购。
1.3试验方法
1.3.1药物提取与试剂制备。
1.3.1.1阿氏液配制。称取葡萄糖2.05 g、氯化钠0.42 g、柠檬酸钠0.80 g，放入装有850 ml三蒸水的烧杯中，用0.1%柠檬酸溶液，缓慢滴加，调节pH至7.2，用1 000 ml容量瓶定容至1 000 ml后用无菌滤膜过滤除菌，置于 4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.1.2鸡红细胞悬液的制备。采集鸡外周血5 ml，转移到20 ml阿氏液中，4 ℃下保存。使用前，先用生理盐水洗涤，然后2 000 r/min离心5 min，共洗涤3次后，用生理盐水配制成红细胞悬液浓度为1%。
1.3.1.3板蓝根多糖的制备。板蓝根饮片购自泰州芝林大药房。取板蓝根饮片200 g，加入2 000 ml三蒸水微沸煎煮2 h，过滤，滤渣加入2 000 ml三蒸水微沸煎煮1.5 h，趁热过滤。合并2次所得滤液浓缩至200 ml加入无水乙醇800 ml，调整醇浓度80%。静置过夜，弃去上清将所得沉淀溶于100 ml蒸馏水中，加入400 ml无水乙醇调整最终含醇量为80%，静置过夜，弃上清，将沉淀在60 ℃恒温干燥箱中烘干，称重。使用前，用三蒸水配制成10 mg/ml，高压灭菌，4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.2动物分组及处理。
健康AA 肉仔鸡120只，随机分为3组：板蓝根多糖组（Ⅱ）、黄芪多糖组（Ⅰ）以及生理盐水对照组（Ⅲ），每组40只。4日龄分别用10 mg/ml黄芪多糖、10 mg/ml板蓝根多糖、生理盐水注射液，以0.5 ml/羽的剂量进行肌肉注射，每天1次，连用3 d；7日龄用新城疫Ⅳ系弱毒苗点眼滴鼻免疫，21日龄用1羽份的新城疫Ⅳ弱毒苗二免，0.3 ml/羽（表1）。免疫后分别于7、14、21、28、35、42、49日龄随机选取5只鸡，通过翅静脉采血，待血液凝固后，分离血清，然后通过血凝抑制试验检测鸡新城疫血凝抑制抗体效价。分别于14、21、28、35及42日龄随机取6只鸡，放血致死后称重，分别摘取脾脏、胸腺、法氏囊并逐一称重，计算每只鸡的免疫器官指数。 表1试验分组与处理
组别7日龄21日龄
ⅠNDV弱毒疫苗+黄芪多糖NDV弱毒疫苗+黄芪多糖
ⅡNDV弱毒疫苗+板蓝根多糖NDV弱毒疫苗+板蓝根多糖
ⅢNDV弱毒疫苗+生理盐水NDV弱毒疫苗+生理盐水
1.3.3鸡血清新城疫血凝抑制抗体效价检测。
1.3.3.1NDV抗原效价的测定。
取96孔微量血凝板，第1排从左侧开始的第1～12孔按照50 μl/孔的剂量加入PBS溶液，第2排和第3排重复操作。向每排第1孔加入50 μl的新城疫病毒诊断抗原，反复吹吸3次后，吸取50 μl加入第2孔，同样操作依次向后进行2倍稀释，一直稀释到第11孔，然后将第11孔吸取50 μl弃去，第12孔不添加病毒抗原液。然后，取1%鸡红细胞悬液，轻轻摇动混匀后，按照50 μl/孔的剂量向每孔加入红细胞悬液，然后将微量板振动30 s，置于37 ℃温箱中作用30 min，观察结果。经测定该诊断液的抗原凝集价为26，由此确定4单位抗原的稀释度为24。
1.3.3.2血凝抑制试抗体效价的测定。
取96孔微量血凝板，从第1排从左到右的第1～11孔各加入50 μl 的磷酸盐缓冲溶液，再向第1排的第1孔加入50 μl待检血清，然后，依次向后进行2倍的倍比稀释，一直稀释到第10孔，第11孔加入阳性血清，第12孔加入阴性血清。第2排和第3排作重复。倍比稀释完成后向每孔加入配制好的4单位新城疫病毒抗原（将新城疫病毒诊断抗原进行16倍稀释）50 μl/孔，振荡混匀30 s，放入37 ℃温箱。 20 min后，取出向每孔加入1%鸡红细胞悬液50 μl/孔。振荡混匀，然后置于37 ℃恒温箱中作用30 min，观察结果。
2结果与分析
2.1新城疫血凝抑制抗体效价
从图1可以看出，7日龄板蓝根多糖组的新城疫HI抗体效价略高于生理盐水对照组（P>0.05）、黄芪多糖组的HI抗体效价略高于生理盐水对照组（P>0.05）。14日龄以后，板蓝根多糖组、黄芪多糖组HI抗体效价显著高于生理盐水对照组（P<0.05），黄芪多糖组抗体效价较板蓝根多糖组抗体效价稍高，但差异不显著。这种差异显著性在28、35、42日龄仍然持续（P<0.05），42日龄抗体效价达到最高峰，49日龄抗体效价开始下降。
3讨论
抗体是介导体液免疫的重要成分。抗体效价的高低直接反映着机体的体液免疫状态[1]。该试验结果表明板蓝根多糖能显著提高鸡的NDHI抗体滴度水平，而且在提高抗体效价方面与黄芪多糖的免疫增强效果差异不显著。
临床上给鸡群接种新城疫疫苗后，许多因素都可以导致免疫失败，其中最重要的因素是疫苗保护率低和某些免疫抑制因素所致[2]。筛选和开发免疫增强剂势在必行，目前用于免疫增强剂包括：细胞因子（如白介素2）、中药成分（如黄芪多糖多糖、香菇多糖等）可以增强机体的免疫应答过程，提高免疫效果[3]，增强了动物机体的抗病能力[4]。研究表明，板
蓝根多糖能增强机体免疫功能，增强巨噬细胞的吞噬活性，
诱导生成干扰素，是较好的免疫刺激剂[5]。该试验结果表明板蓝根多糖能够促进免疫器官（如脾脏、法氏囊）的发育，从而促进B淋巴细胞的生长。作为新型的免疫增强剂，板蓝根多糖在提高动物机体的免疫功能和预防畜禽疾病方面有重要作用，为减少畜禽产品中的化学药物残留，保障人民的食品安全方面发挥更为重要的作用。
参考文献
[1] 郭新华，邱妍，严桂芹，等.板蓝根多糖对鸡新城疫抗体滴度和免疫器官指数的影响[J].饲料工业，2007（28）：50-52.
[2] 魏国，钟肖.地塞米松对ND免疫鸡主要免疫器官及抗体滴度的影响[J].畜禽业，2009（8）：14-17.
[3] 卢宇，张金秋，邓碧华，等.补中益气汤对雏鸡免疫功能的影响[J].中兽医学杂志，2011（6）：6-9.
[4] 张殿新.芪蓝四君子汤对新城疫疫苗免疫效果的影响[D].保定：河北农业大学，2010.
[5] 郑铁锁.复方中药的增强免疫作用和对雏鸡的安全性测定[D].南京：南京农业大学，2009.