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摘要：利用60Co-γ辐射结合自交及游离小孢子培养，培育耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系的后代群体。结果表明，随着辐射剂量的增加，自交结角率变化无显著规律，而结籽率则呈下降趋势；随着辐射剂量的增加，游离小孢子培养的胚状体诱导率和植株再生率显著下降，辐射剂量高于60 Gy时，胚状体诱导率为0。
关键词：大白菜；结球甘蓝；单体异附加系；耐抽薹；辐射诱变；游离小孢子；培养
中图分类号： S634.032 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0196-02
大白菜（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）是我国种植面积最大的蔬菜作物之一[1]。先期抽薹给大白菜的春季栽培带来很大困扰，影响了大白菜的周年均衡供应，而最好的解决方式是培育耐抽薹的品种[2]。结球甘蓝与大白菜同科同属，较大白菜具有耐寒、耐热性强、耐抽薹、富含硫代葡萄糖苷（简称硫苷，glucosinolate）等优良特性。笔者所在课题组已获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系，但单体异附加系遗传不稳定，且携有的非目的基因较多。
近年来，辐射诱变以其能提高植物基因水平上的突变频率，有利于打破性状连锁和促進基因重组[3]，而被广泛应用于新品种选育和种质资源创新工作中，成为常规育种的重要补充手段之一。辐射诱变最常用的是60Co-γ射线[4]。60Co-γ射线能显著影响组织或细胞的生长发育及生理生化过程，一定剂量的射线能造成染色体的断裂，伤害程度与辐射剂量呈显著正相关[5]。辐射剂量的选择是影响诱变效果的关键因素，过大或过小均可造成辐射无效或致死率太高[6]。辐射诱变在麦类[5]、棉花[7]等作物上研究较多，但在大白菜遗传育种上鲜有报道。本研究以耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系为材料，利用60Co-γ辐射结合自交及游离小孢子培养途径，创制该单体异附加系的后代群体，为获得遗传稳定的易位系提供必要的材料与方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系AC4。由河北农业大学蔬菜分子染色体工程与新品种选育团队提供。AC4为组培苗，诱导生根后于2012年1月移栽到温室营养钵中，冬季自然低温春化，3月22日定植到大棚，常规管理。
1.2 试验方法
1.2.1 辐射诱变后自交 雌配子未经辐射处理而雄配子经辐射处理后自交：取AC4的健壮花枝，水培于三角瓶中，进行60Co-γ射线辐射处理。辐射剂量率1 Gy/min，设0（对照）、30、45、60、75 Gy 5个剂量梯度。辐射后去除该花枝上已开花朵，套袋隔离，用以提供花粉。选取未辐射处理的AC4植株上适宜授粉的花蕾，去除雄蕊，分别授以经0、30、45、60、75 Gy辐射的新鲜花粉，套袋隔离，成熟后收获种子M1。
雌雄配子辐射处理后自交：取AC4初花期整棵植株进行60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量率1 Gy/min，辐射剂量分别为30、45 Gy。对辐射剂量为30 Gy的植株上适宜授粉的花蕾去雄，授以经30 Gy辐射的花粉，套袋隔离；对辐射剂量为45 Gy的植株上适宜授粉的花蕾去雄，分别授以经30、45、60、75 Gy辐射的新鲜花粉，套袋隔离，成熟后收获种子M1。
1.2.2 辐射诱变后游离小孢子培养 晴朗的上午，温度 18～20 ℃，取AC4主枝、一级侧枝上适宜花蕾进行游离小孢子培养。以未经辐射诱变花蕾小孢子培养为对照，待辐射处理24 h后，分别取辐射剂量为30、45、60、75 Gy花枝上适宜的花蕾，进行游离小孢子培养。培养方法及胚状体植株再生方法参照申书兴等的方法[13-14]。
2 结果与分析
2.1 AC4辐射诱变后的结角率和结籽率
随着辐射剂量的增加，结角率没有明显的变化规律，而结籽率明显变化（表1）。对于父本接受辐射、母本未辐射的杂交组合，除授粉组合Ⅱ（父本辐射剂量为30 Gy，母本未辐射）的结籽率为46%，稍高于授粉组合Ⅰ（父母本均未接受辐射）的结籽率外，其他组合的结籽率均呈现随辐射剂量的增加而下降的趋势；父本母本均接受辐射的组合，除组合Ⅷ（父、母本辐射剂量均为45 Gy）外，母本辐射剂量相同时，结籽率随父本接受剂量的增加而下降。父本辐射剂量相同时，母本接受的辐射剂量越大，结籽率也越低。即父、母本接受的辐射剂量均影响结籽率。以上辐照处理，共计获得耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系AC4自交种子2 962粒。
2.2 AC4花蕾辐射诱变后游离小孢子培养的胚状体诱导率及植株再生率
AC4不经辐射的适宜新鲜花蕾进行游离小孢子培养（图1-A），其胚状体诱导率为7.2个/蕾、植株再生率为48.8%（表2），共208个胚状体发育成植株。辐射诱变后的游离小孢子培养，随着辐射剂量的增加，胚状体诱导率和植株再生率显著下降。辐射剂量为30 Gy时（图1-B），胚状体诱导率、植株再生率分别为2.71个/蕾和36.4%，16个胚状体发育成植株；辐射剂量达到45 Gy时（图1-C），胚状体诱导率、植株再生率分别降低至0.11个/蕾和27.7%，2个胚状体发育成植株；辐射剂量增至60 Gy时，胚状体诱导率降低至0。结果表明，花蕾辐射剂量显著影响游离小孢子培养的胚状体诱导率和植株再生率。
辐射剂量为30、45 Gy 的花蕾进行游离小孢子培养，33 ℃ 高温预处理24 h后，25 ℃暗培养7～11 d形成肉眼可见的球形胚，18～21 d形成成熟的子叶形胚（图1），转入MS培养基（图2-A），2～3 d后胚状体转绿（图2-B）。在胚状体植株再生（图2-C）过程中，存在胚状体褐化死亡的现象（图2-D）。
3 讨论
任正隆等采用常规杂交选育方法，以单体异附加系为试材，获得了小麦-黑麦小片段染色体易位系[8]。李瑞芬等以单体异附加系花药培养诱导染色体易位[9]。本研究以耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系为材料，利用60Co-γ辐射结合自交及游离小孢子培养途径，获得了3 188个该单体异附加系的后代，为进一步筛选易位系提供了必要材料。辐射可使染色体断裂，从而实现外源染色体片段向受体亲本基因组的转移[10]，以提高易位系的合成频率。同时以游离小孢子培养替代花药培养，排除了培养过程中花药壁等体细胞的干扰[11]和易出现嵌合体的现象。 本研究中随着辐射剂量的增加，结籽率呈下降趋势，游离小孢子培养的胚状体诱导率和植株再生率呈显著下降趋势，表明60Co-γ射线辐射降低了花粉、游离小孢子的活力，且降低程度与辐射剂量呈正相关。在棉花上也报道了60Co-γ射线破坏花粉活力，降低结籽率[12]。成熟的雌雄配子体对 60Co-γ具有较强的耐受性；而游离小孢子的活力下降与辐射剂量呈显著正相关，推测是在雄配子形成早期的小孢子阶段对辐射诱变的耐受性较差引起的。在本研究中自交结籽率下降幅度小，这可能是由于白菜中含有丰富的抗辐射物质硫代葡萄糖苷[13]。
李桂英等在研究辐射花粉对小麦×黑麦杂种结实率的影响时发现，低剂量射线辐射黑麦花粉时，结实率比对照略有提高[14]，表现出低剂量辐射的刺激效应。本试验中辐射剂量為30 Gy的花粉做父本时，授粉的结籽率稍高于对照，也表现出了低剂量的刺激效应。
参考文献：
[1]张淑江，李 菲，章时蕃，等. “十一五”我国大白菜遗传育种研究进展[J]. 中国蔬菜.2011（6）：1-8.
[2]余阳俊，张凤兰，赵岫云，等. 大白菜晚抽薹性快速评价方法[J]. 中国蔬菜，2004（6）：16-18.
[3]刘丽强，刘军丽，张 杰，等. 60Co-γ辐射对观赏海棠组培苗的诱变效应[J]. 中国农业科学，2010，43（20）：4255-4264.
[4]陈秋芳，王 敏，何美美，等. 果树辐射诱变育种研究进展[J]. 中国农学通报，2007，23（1）：240-243.
[5]李明杰，张建伟，台国琴，等. 60Co-γ-射线对黑麦的诱变效应研究[J]. 河南农业大学学报，2010，44（4）：370-374.
[6]叶力勤，杨世宏. γ射线辐射诱变中应注意的几个问题[J]. 宁夏农林科技，2002（5）：49-50.
[7]胡保民，张天真. 陆地棉单体的诱发及鉴定[J]. 棉花学报，1996，8（1）：14-17.
[8]Ren Z L，Zhang H Q. Induction of small-segment-translocation between wheat and rye chromosomes[J]. Science in China（Series C Sciences），1997，40（3）：323-331.
[9]李瑞芬，赵茂林，张敬原，等. 单体异附加系花药培养创制小麦-中间偃麦草纯合易位系[J]. 西北植物学报，2006，26（1）：28-32.
[10]Hasterok R，Wolny E，Kulak S，et al. Molecular cytogenetic analysis of Brassica rapa-Brassica oleracea var. alboglabra monosomic addition lines[J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，111（2）：196-205.
[11]徐艳辉，张 凯. 大白菜游离小孢子培养研究的回顾与展望[J]. 辽宁农业科学，2000（6）：30-34.
[12]Yue J Y，Tang C M. Effects on agronomic traits of M1 by pollen of upland cotton irradiated by 60Co-γ ray[J]. Agricultural Science
关键词：大白菜；结球甘蓝；单体异附加系；耐抽薹；辐射诱变；游离小孢子；培养
中图分类号： S634.032 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0196-02
大白菜（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）是我国种植面积最大的蔬菜作物之一[1]。先期抽薹给大白菜的春季栽培带来很大困扰，影响了大白菜的周年均衡供应，而最好的解决方式是培育耐抽薹的品种[2]。结球甘蓝与大白菜同科同属，较大白菜具有耐寒、耐热性强、耐抽薹、富含硫代葡萄糖苷（简称硫苷，glucosinolate）等优良特性。笔者所在课题组已获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系，但单体异附加系遗传不稳定，且携有的非目的基因较多。
近年来，辐射诱变以其能提高植物基因水平上的突变频率，有利于打破性状连锁和促進基因重组[3]，而被广泛应用于新品种选育和种质资源创新工作中，成为常规育种的重要补充手段之一。辐射诱变最常用的是60Co-γ射线[4]。60Co-γ射线能显著影响组织或细胞的生长发育及生理生化过程，一定剂量的射线能造成染色体的断裂，伤害程度与辐射剂量呈显著正相关[5]。辐射剂量的选择是影响诱变效果的关键因素，过大或过小均可造成辐射无效或致死率太高[6]。辐射诱变在麦类[5]、棉花[7]等作物上研究较多，但在大白菜遗传育种上鲜有报道。本研究以耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系为材料，利用60Co-γ辐射结合自交及游离小孢子培养途径，创制该单体异附加系的后代群体，为获得遗传稳定的易位系提供必要的材料与方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系AC4。由河北农业大学蔬菜分子染色体工程与新品种选育团队提供。AC4为组培苗，诱导生根后于2012年1月移栽到温室营养钵中，冬季自然低温春化，3月22日定植到大棚，常规管理。
1.2 试验方法
1.2.1 辐射诱变后自交 雌配子未经辐射处理而雄配子经辐射处理后自交：取AC4的健壮花枝，水培于三角瓶中，进行60Co-γ射线辐射处理。辐射剂量率1 Gy/min，设0（对照）、30、45、60、75 Gy 5个剂量梯度。辐射后去除该花枝上已开花朵，套袋隔离，用以提供花粉。选取未辐射处理的AC4植株上适宜授粉的花蕾，去除雄蕊，分别授以经0、30、45、60、75 Gy辐射的新鲜花粉，套袋隔离，成熟后收获种子M1。
雌雄配子辐射处理后自交：取AC4初花期整棵植株进行60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量率1 Gy/min，辐射剂量分别为30、45 Gy。对辐射剂量为30 Gy的植株上适宜授粉的花蕾去雄，授以经30 Gy辐射的花粉，套袋隔离；对辐射剂量为45 Gy的植株上适宜授粉的花蕾去雄，分别授以经30、45、60、75 Gy辐射的新鲜花粉，套袋隔离，成熟后收获种子M1。
1.2.2 辐射诱变后游离小孢子培养 晴朗的上午，温度 18～20 ℃，取AC4主枝、一级侧枝上适宜花蕾进行游离小孢子培养。以未经辐射诱变花蕾小孢子培养为对照，待辐射处理24 h后，分别取辐射剂量为30、45、60、75 Gy花枝上适宜的花蕾，进行游离小孢子培养。培养方法及胚状体植株再生方法参照申书兴等的方法[13-14]。
2 结果与分析
2.1 AC4辐射诱变后的结角率和结籽率
随着辐射剂量的增加，结角率没有明显的变化规律，而结籽率明显变化（表1）。对于父本接受辐射、母本未辐射的杂交组合，除授粉组合Ⅱ（父本辐射剂量为30 Gy，母本未辐射）的结籽率为46%，稍高于授粉组合Ⅰ（父母本均未接受辐射）的结籽率外，其他组合的结籽率均呈现随辐射剂量的增加而下降的趋势；父本母本均接受辐射的组合，除组合Ⅷ（父、母本辐射剂量均为45 Gy）外，母本辐射剂量相同时，结籽率随父本接受剂量的增加而下降。父本辐射剂量相同时，母本接受的辐射剂量越大，结籽率也越低。即父、母本接受的辐射剂量均影响结籽率。以上辐照处理，共计获得耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系AC4自交种子2 962粒。
2.2 AC4花蕾辐射诱变后游离小孢子培养的胚状体诱导率及植株再生率
AC4不经辐射的适宜新鲜花蕾进行游离小孢子培养（图1-A），其胚状体诱导率为7.2个/蕾、植株再生率为48.8%（表2），共208个胚状体发育成植株。辐射诱变后的游离小孢子培养，随着辐射剂量的增加，胚状体诱导率和植株再生率显著下降。辐射剂量为30 Gy时（图1-B），胚状体诱导率、植株再生率分别为2.71个/蕾和36.4%，16个胚状体发育成植株；辐射剂量达到45 Gy时（图1-C），胚状体诱导率、植株再生率分别降低至0.11个/蕾和27.7%，2个胚状体发育成植株；辐射剂量增至60 Gy时，胚状体诱导率降低至0。结果表明，花蕾辐射剂量显著影响游离小孢子培养的胚状体诱导率和植株再生率。
辐射剂量为30、45 Gy 的花蕾进行游离小孢子培养，33 ℃ 高温预处理24 h后，25 ℃暗培养7～11 d形成肉眼可见的球形胚，18～21 d形成成熟的子叶形胚（图1），转入MS培养基（图2-A），2～3 d后胚状体转绿（图2-B）。在胚状体植株再生（图2-C）过程中，存在胚状体褐化死亡的现象（图2-D）。
3 讨论
任正隆等采用常规杂交选育方法，以单体异附加系为试材，获得了小麦-黑麦小片段染色体易位系[8]。李瑞芬等以单体异附加系花药培养诱导染色体易位[9]。本研究以耐抽薹大白菜-结球甘蓝单体异附加系为材料，利用60Co-γ辐射结合自交及游离小孢子培养途径，获得了3 188个该单体异附加系的后代，为进一步筛选易位系提供了必要材料。辐射可使染色体断裂，从而实现外源染色体片段向受体亲本基因组的转移[10]，以提高易位系的合成频率。同时以游离小孢子培养替代花药培养，排除了培养过程中花药壁等体细胞的干扰[11]和易出现嵌合体的现象。 本研究中随着辐射剂量的增加，结籽率呈下降趋势，游离小孢子培养的胚状体诱导率和植株再生率呈显著下降趋势，表明60Co-γ射线辐射降低了花粉、游离小孢子的活力，且降低程度与辐射剂量呈正相关。在棉花上也报道了60Co-γ射线破坏花粉活力，降低结籽率[12]。成熟的雌雄配子体对 60Co-γ具有较强的耐受性；而游离小孢子的活力下降与辐射剂量呈显著正相关，推测是在雄配子形成早期的小孢子阶段对辐射诱变的耐受性较差引起的。在本研究中自交结籽率下降幅度小，这可能是由于白菜中含有丰富的抗辐射物质硫代葡萄糖苷[13]。
李桂英等在研究辐射花粉对小麦×黑麦杂种结实率的影响时发现，低剂量射线辐射黑麦花粉时，结实率比对照略有提高[14]，表现出低剂量辐射的刺激效应。本试验中辐射剂量為30 Gy的花粉做父本时，授粉的结籽率稍高于对照，也表现出了低剂量的刺激效应。
参考文献：
[1]张淑江，李 菲，章时蕃，等. “十一五”我国大白菜遗传育种研究进展[J]. 中国蔬菜.2011（6）：1-8.
[2]余阳俊，张凤兰，赵岫云，等. 大白菜晚抽薹性快速评价方法[J]. 中国蔬菜，2004（6）：16-18.
[3]刘丽强，刘军丽，张 杰，等. 60Co-γ辐射对观赏海棠组培苗的诱变效应[J]. 中国农业科学，2010，43（20）：4255-4264.
[4]陈秋芳，王 敏，何美美，等. 果树辐射诱变育种研究进展[J]. 中国农学通报，2007，23（1）：240-243.
[5]李明杰，张建伟，台国琴，等. 60Co-γ-射线对黑麦的诱变效应研究[J]. 河南农业大学学报，2010，44（4）：370-374.
[6]叶力勤，杨世宏. γ射线辐射诱变中应注意的几个问题[J]. 宁夏农林科技，2002（5）：49-50.
[7]胡保民，张天真. 陆地棉单体的诱发及鉴定[J]. 棉花学报，1996，8（1）：14-17.
[8]Ren Z L，Zhang H Q. Induction of small-segment-translocation between wheat and rye chromosomes[J]. Science in China（Series C Sciences），1997，40（3）：323-331.
[9]李瑞芬，赵茂林，张敬原，等. 单体异附加系花药培养创制小麦-中间偃麦草纯合易位系[J]. 西北植物学报，2006，26（1）：28-32.
[10]Hasterok R，Wolny E，Kulak S，et al. Molecular cytogenetic analysis of Brassica rapa-Brassica oleracea var. alboglabra monosomic addition lines[J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，111（2）：196-205.
[11]徐艳辉，张 凯. 大白菜游离小孢子培养研究的回顾与展望[J]. 辽宁农业科学，2000（6）：30-34.
[12]Yue J Y，Tang C M. Effects on agronomic traits of M1 by pollen of upland cotton irradiated by 60Co-γ ray[J]. Agricultural Science