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摘 要 回顾了国内外关于转基因的研究，对转基因动物获得的主要方法如显微原核注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法等常用的方法进行了综述；阐述了转基因动物的鉴定方法，最后对转基因动物在理论和实践方面的应用情况进行了综述。
关键词 转基因 转基因动物 转基因技术
转基因动物始于20世纪70年代末，是目前生物技术领域研究的热点之一，具有重大的科学意义和应用价值。转基因动物是通过向受精卵或早期胚胎中导入外源DNA，有目的地对生物的遗传物质基础进行修饰、改造，培育新的品系。若外源基因与动物本身的基因(染色体)整合在一起，外源基因就能随细胞的分裂而增殖，在体内得到表达，并能稳定地遗传给后代。转基因技术在农业、医学和生物制药等领域已经得到广泛的应用，如定向育种、建立人类疾病的病理模型、转基因生物反应器等。
1．转基因动物的研究概况
1.1转基因动物的国外研究
转基因动物的研究最早始于1980年，高登等用显微原核注射方法，将重组DNA导人小鼠受精卵，首次获得了带有外源基因的转基因小鼠。帕米特于1982年也获得了转基因小鼠，并通过实验证明融合基因可以在宿主体内得到有效正确地表达，表达产物可以在宿主动物内行使功能。哈姆尔等成功获得了转基因兔、绵羊和猪，这项工作被认为在转基因动物研究历程上具有重要意义。
1997年克隆羊“多莉”的诞生在转基因动物历史上具有划时代的意义，它突破了有性生殖的框架，表明了高等动物也可以通过无性生殖来繁殖。兹伯尔于1998年利用该法分别得到转基因克隆牛和用来治疗人血友病的转基因克隆绵羊。近年来利用转基因克隆技术又获得了克隆猪、体内含有外源基因的转基因猪、体内有2个基因被“关闭”了的转基因克隆猪和基本不含人体免疫排斥基因的“基因敲除”克隆猪等。
1.2转基因动物的国内研究概况
我国于1984年开始了转基因动物的相关研究，并获得了含入β－珠蛋白基因的转基因小鼠。随后获得了含人生长激素(MT-HGH)基因的转基因泥鳅和小鼠。1987年获得含有大肠杆菌galk和gpt基因的转基因小鼠。以后又相继获得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基因猪、含EPO基因和人乙型肝炎表面抗原基因(HbgAg)2种乳腺特异性表达的转基因山羊、含入凝血因子Ⅸ的转基因山羊、含人血清白蛋白基因的转基因奶牛、含“生物钢”蛋白基因的转基因老鼠等。
2．转基因的主要技术
2.1显微原核注射法
高登等首次建立的转基因方法，基本过程是：利用显微操作系统和显微注射技术将外源基因直接通过注射器注入实验动物的受精卵中，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体子宫内继续发育成转基因动物。实验的过程中大多数转基因动物能把整合的基因传给后代，以建立转基因动物体系。随后，葛瑞姆菲利用显微原核注射法成功获得了转基因牛。
2.2逆转录病毒感染法
杰内士利用逆转录病毒作为转基因载体，感染胚胎成功获得转基因动物：将目的基因重组到逆转录病毒RNA载体上，制成高滴度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，外源基因进入宿主细胞后，反转录为DNA，并在整合酶和其末端特殊核酸序列的作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和遗传得到转基因动物。
2.3胚胎干细胞介导法
胚胎干细胞(ES细胞)是早期胚胎的内细胞团(ICM)经体外培养建立起来的多功能细胞系，利用反转录病毒载体、电击法等将外源基因导入ES细胞内，外源基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到胚胎干细胞的基因组中，然后把转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，参与各种嵌合体的形成。将来出生的动物的生殖系统就有可能整合有外源基因，通过杂交繁育得到含纯合目的基因的个体，即为转基因动物。
2.4精子载体法
精子载体法分为体外受精法和胞质内显微注射法。布兰克首先利用体外受精法成功获得了转基因动物：将成熟的精子与外源DNA进行预培养，精子核后帽区结合DNA后，与卵子受精形成的受精卵带有外源DNA。安斯内利用胞质内显微注射法制作转基因小鼠：预先将小鼠精子进行破膜处理，与编码绿色荧光蛋白质或编码β－半乳糖苷的Lacz基因的外源DNA短时间共孵育，然后用显微注射法注入MII期的卵母细胞质中，得到的转基因胚胎转移到假孕母鼠的子宫中进行整合，从而得到转基因小鼠。
2.5体细胞核移植转基因法
士内克等用体细胞核移植转基因法制作了世界上首例转基因羊：将外源基因导入到动物成年体细胞或胎体成纤维细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植，将重组胚进行培养，或者植入同步化假孕动物的输卵管，从而得到转基因动物。
3．转基因动物的鉴定
3.1 DNA水平的检测
在DNA水平上对转基因动物进行检测鉴定，有Southern blotting和PCR等可以用于转基因动物的检测。Southern blotting检测时提取待检动物的组织样(如鼠尾巴)或血液中的基因组DNA，一般选择导入基因中的单一限制性核酸内切酶位点，消化后电泳，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影获得结果，该方法的检测结果明确可靠，但过程复杂，工作量大。
PCR检测时可以利用三引物法进行转基因的检测：在导入基因的调控序列上合成一条引物，在目的基因上合成第二条引物，在内源基因上合成第三条引物。利用这3条引物同时进行PCR扩增，阳性扩增出现2条DNA条带，而阴性扩增只出现l条特定的内源性DNA带。这样既可以减少筛选中的假阳性，同时还可以提高检测的准确性。
3.2 RNA水平的检测
Northern blotting和RT-PCR可以在RNA水平上对转基因的整合表达进行检测。此类实验检测的关键在于特异性探针设计。
RT-PCR技术与Northern blotting一样，可用来检测外源基因转移整合至受体动物基因序列中后的表达情况，它们都能对特定的mRNA进行定量检测不同的是，RT-PCT具有更高的敏感性，能检测含量稀少的mRNA。所以对于转基因表达活性低的这一状况，它具有较强的适用性。
3.3 目的蛋白的检测
目的蛋白的主要检测方法主要有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、酶联免疫吸附分析(ELISA)和Western blotting分析法。
4．转基因动物的应用
4.1 转基因动物在基础理论方面的应用
外源动物基因可在转基因动物细胞中整合、表达受整体制约、基因组遗传背景的调控，所以可把转基 因当作一个理想的功能标记。而且可把分子、细胞、和整体动物水平的研究统一起来，从时间和空间的角度进行综合地考虑，其结果更能反映活体内情况。因此转基因动物可以用于研究基因的表达调控、结构和功能的关系，以及细胞发育的潜能性、细胞核和细胞质的相互关系、胚胎发育调控、肿瘤和神经发育等。
4.2转基因动物在临床医学领域中的应用
4.2.1 疾病的动物模型
转基因动物的成功为人类疾病的模型的构建提供了良好的基础。人类可以通过精确地使某些基因失活或增强某些基因的表达来建立离体的实验动物体系，不但能从动物整体水平和组织器官水平进行研究，还可深入到细胞水平和分子水平。由于模型在活体动物中构建，因此可以按照人们的愿望进行设计和培育，又因为这样可保证类似体内的各种背景因素仍然存在，所以研究的结果通常具有较高的真实性。目前人们已建立起的疾病的动物模型的遗传病有格式镰刀状细胞贫血、地中海贫血、高血压、人类来西一尼南综合征(Losh-Nynansyndrome,LNS)、自身免疫病、老年痴呆症和淋巴系统病等。
4.2.2人类异种器官的移植
同种器官的移植中存在2个问题：(1)供移植用的器官来源不足；(2)人类移人的器官多发生免疫排斥现象，这使得人们不得不重视异种器官移植，利用转基因动物是解决器官移植短缺的最有效途径之一。经过实验证明目前最为理想的转基因动物是猪。
4.3转基因动物在医药产业中的应用
转基因动物制药具有设备简单、不耗能、无污染、品种多、产量高、质量好、生产周期短、生产成本低等优点，而且可以通过血液、尿液和乳腺收集转基因蛋白。
乳腺是外源基因在转基因动物体内最理想的表达场所。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的代谢反应，而且动物乳腺具有很强的摄取、合成以及分泌蛋白质的功能，并能对重组蛋白进行多种翻译后加工，具有稳定的生物反应，且易提纯，所以被称为转基因动物乳腺反应器。
4.4转基因动物在畜牧兽医上的应用
转基因动物技术可以改善动物本身的基因组，从而改变动物的遗传本质。操作中利用重组DNA技术构造出各种优良的载体，通过转基因技术，植入动物的卵细胞，培育出新品种。
转基因动物技术还可以提高动物的产毛性能。1995年，布拉克把类胰岛素生长因子－I(IGF-I)的基因转入受体羊的原核胚中，使转基因羊的产毛率得到了极大的提高。
克尔姆兹等将Visna病毒的衣壳蛋白基因转入绵羊体内，获得了抗病能力明显提高的转基因绵羊，培育出了动物抗病新品种。
目前，转基因动物的应用主要在医药方面，而在食品工业中的应用尚受到较大的制约，其根本原因是转基因动物的开发投入很大，而转基因的技术瓶颈也使转基因成功率比较低。尽管如此，它还是显示出了在工业、农业及医学等行业中的巨大应用潜力和发展前景，给人类带来了巨大的经济效益，推动了社会向前发展。相关法规的出台，无疑会加速和正确引导基因工程产品的研究和开发。相信在不久的将来，转基因动物生产将会成为生产行业中的一种新兴产业。因此充分利用转基因动物技术的潜在价值，实现转基因动物技术的实用化、商业化、产业化，是新世纪生物科学工作者的努力目标。
关键词 转基因 转基因动物 转基因技术
转基因动物始于20世纪70年代末，是目前生物技术领域研究的热点之一，具有重大的科学意义和应用价值。转基因动物是通过向受精卵或早期胚胎中导入外源DNA，有目的地对生物的遗传物质基础进行修饰、改造，培育新的品系。若外源基因与动物本身的基因(染色体)整合在一起，外源基因就能随细胞的分裂而增殖，在体内得到表达，并能稳定地遗传给后代。转基因技术在农业、医学和生物制药等领域已经得到广泛的应用，如定向育种、建立人类疾病的病理模型、转基因生物反应器等。
1．转基因动物的研究概况
1.1转基因动物的国外研究
转基因动物的研究最早始于1980年，高登等用显微原核注射方法，将重组DNA导人小鼠受精卵，首次获得了带有外源基因的转基因小鼠。帕米特于1982年也获得了转基因小鼠，并通过实验证明融合基因可以在宿主体内得到有效正确地表达，表达产物可以在宿主动物内行使功能。哈姆尔等成功获得了转基因兔、绵羊和猪，这项工作被认为在转基因动物研究历程上具有重要意义。
1997年克隆羊“多莉”的诞生在转基因动物历史上具有划时代的意义，它突破了有性生殖的框架，表明了高等动物也可以通过无性生殖来繁殖。兹伯尔于1998年利用该法分别得到转基因克隆牛和用来治疗人血友病的转基因克隆绵羊。近年来利用转基因克隆技术又获得了克隆猪、体内含有外源基因的转基因猪、体内有2个基因被“关闭”了的转基因克隆猪和基本不含人体免疫排斥基因的“基因敲除”克隆猪等。
1.2转基因动物的国内研究概况
我国于1984年开始了转基因动物的相关研究，并获得了含入β－珠蛋白基因的转基因小鼠。随后获得了含人生长激素(MT-HGH)基因的转基因泥鳅和小鼠。1987年获得含有大肠杆菌galk和gpt基因的转基因小鼠。以后又相继获得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基因猪、含EPO基因和人乙型肝炎表面抗原基因(HbgAg)2种乳腺特异性表达的转基因山羊、含入凝血因子Ⅸ的转基因山羊、含人血清白蛋白基因的转基因奶牛、含“生物钢”蛋白基因的转基因老鼠等。
2．转基因的主要技术
2.1显微原核注射法
高登等首次建立的转基因方法，基本过程是：利用显微操作系统和显微注射技术将外源基因直接通过注射器注入实验动物的受精卵中，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体子宫内继续发育成转基因动物。实验的过程中大多数转基因动物能把整合的基因传给后代，以建立转基因动物体系。随后，葛瑞姆菲利用显微原核注射法成功获得了转基因牛。
2.2逆转录病毒感染法
杰内士利用逆转录病毒作为转基因载体，感染胚胎成功获得转基因动物：将目的基因重组到逆转录病毒RNA载体上，制成高滴度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，外源基因进入宿主细胞后，反转录为DNA，并在整合酶和其末端特殊核酸序列的作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和遗传得到转基因动物。
2.3胚胎干细胞介导法
胚胎干细胞(ES细胞)是早期胚胎的内细胞团(ICM)经体外培养建立起来的多功能细胞系，利用反转录病毒载体、电击法等将外源基因导入ES细胞内，外源基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到胚胎干细胞的基因组中，然后把转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，参与各种嵌合体的形成。将来出生的动物的生殖系统就有可能整合有外源基因，通过杂交繁育得到含纯合目的基因的个体，即为转基因动物。
2.4精子载体法
精子载体法分为体外受精法和胞质内显微注射法。布兰克首先利用体外受精法成功获得了转基因动物：将成熟的精子与外源DNA进行预培养，精子核后帽区结合DNA后，与卵子受精形成的受精卵带有外源DNA。安斯内利用胞质内显微注射法制作转基因小鼠：预先将小鼠精子进行破膜处理，与编码绿色荧光蛋白质或编码β－半乳糖苷的Lacz基因的外源DNA短时间共孵育，然后用显微注射法注入MII期的卵母细胞质中，得到的转基因胚胎转移到假孕母鼠的子宫中进行整合，从而得到转基因小鼠。
2.5体细胞核移植转基因法
士内克等用体细胞核移植转基因法制作了世界上首例转基因羊：将外源基因导入到动物成年体细胞或胎体成纤维细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植，将重组胚进行培养，或者植入同步化假孕动物的输卵管，从而得到转基因动物。
3．转基因动物的鉴定
3.1 DNA水平的检测
在DNA水平上对转基因动物进行检测鉴定，有Southern blotting和PCR等可以用于转基因动物的检测。Southern blotting检测时提取待检动物的组织样(如鼠尾巴)或血液中的基因组DNA，一般选择导入基因中的单一限制性核酸内切酶位点，消化后电泳，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影获得结果，该方法的检测结果明确可靠，但过程复杂，工作量大。
PCR检测时可以利用三引物法进行转基因的检测：在导入基因的调控序列上合成一条引物，在目的基因上合成第二条引物，在内源基因上合成第三条引物。利用这3条引物同时进行PCR扩增，阳性扩增出现2条DNA条带，而阴性扩增只出现l条特定的内源性DNA带。这样既可以减少筛选中的假阳性，同时还可以提高检测的准确性。
3.2 RNA水平的检测
Northern blotting和RT-PCR可以在RNA水平上对转基因的整合表达进行检测。此类实验检测的关键在于特异性探针设计。
RT-PCR技术与Northern blotting一样，可用来检测外源基因转移整合至受体动物基因序列中后的表达情况，它们都能对特定的mRNA进行定量检测不同的是，RT-PCT具有更高的敏感性，能检测含量稀少的mRNA。所以对于转基因表达活性低的这一状况，它具有较强的适用性。
3.3 目的蛋白的检测
目的蛋白的主要检测方法主要有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、酶联免疫吸附分析(ELISA)和Western blotting分析法。
4．转基因动物的应用
4.1 转基因动物在基础理论方面的应用
外源动物基因可在转基因动物细胞中整合、表达受整体制约、基因组遗传背景的调控，所以可把转基 因当作一个理想的功能标记。而且可把分子、细胞、和整体动物水平的研究统一起来，从时间和空间的角度进行综合地考虑，其结果更能反映活体内情况。因此转基因动物可以用于研究基因的表达调控、结构和功能的关系，以及细胞发育的潜能性、细胞核和细胞质的相互关系、胚胎发育调控、肿瘤和神经发育等。
4.2转基因动物在临床医学领域中的应用
4.2.1 疾病的动物模型
转基因动物的成功为人类疾病的模型的构建提供了良好的基础。人类可以通过精确地使某些基因失活或增强某些基因的表达来建立离体的实验动物体系，不但能从动物整体水平和组织器官水平进行研究，还可深入到细胞水平和分子水平。由于模型在活体动物中构建，因此可以按照人们的愿望进行设计和培育，又因为这样可保证类似体内的各种背景因素仍然存在，所以研究的结果通常具有较高的真实性。目前人们已建立起的疾病的动物模型的遗传病有格式镰刀状细胞贫血、地中海贫血、高血压、人类来西一尼南综合征(Losh-Nynansyndrome,LNS)、自身免疫病、老年痴呆症和淋巴系统病等。
4.2.2人类异种器官的移植
同种器官的移植中存在2个问题：(1)供移植用的器官来源不足；(2)人类移人的器官多发生免疫排斥现象，这使得人们不得不重视异种器官移植，利用转基因动物是解决器官移植短缺的最有效途径之一。经过实验证明目前最为理想的转基因动物是猪。
4.3转基因动物在医药产业中的应用
转基因动物制药具有设备简单、不耗能、无污染、品种多、产量高、质量好、生产周期短、生产成本低等优点，而且可以通过血液、尿液和乳腺收集转基因蛋白。
乳腺是外源基因在转基因动物体内最理想的表达场所。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的代谢反应，而且动物乳腺具有很强的摄取、合成以及分泌蛋白质的功能，并能对重组蛋白进行多种翻译后加工，具有稳定的生物反应，且易提纯，所以被称为转基因动物乳腺反应器。
4.4转基因动物在畜牧兽医上的应用
转基因动物技术可以改善动物本身的基因组，从而改变动物的遗传本质。操作中利用重组DNA技术构造出各种优良的载体，通过转基因技术，植入动物的卵细胞，培育出新品种。
转基因动物技术还可以提高动物的产毛性能。1995年，布拉克把类胰岛素生长因子－I(IGF-I)的基因转入受体羊的原核胚中，使转基因羊的产毛率得到了极大的提高。
克尔姆兹等将Visna病毒的衣壳蛋白基因转入绵羊体内，获得了抗病能力明显提高的转基因绵羊，培育出了动物抗病新品种。
目前，转基因动物的应用主要在医药方面，而在食品工业中的应用尚受到较大的制约，其根本原因是转基因动物的开发投入很大，而转基因的技术瓶颈也使转基因成功率比较低。尽管如此，它还是显示出了在工业、农业及医学等行业中的巨大应用潜力和发展前景，给人类带来了巨大的经济效益，推动了社会向前发展。相关法规的出台，无疑会加速和正确引导基因工程产品的研究和开发。相信在不久的将来，转基因动物生产将会成为生产行业中的一种新兴产业。因此充分利用转基因动物技术的潜在价值，实现转基因动物技术的实用化、商业化、产业化，是新世纪生物科学工作者的努力目标。