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【摘 要】自1882年德国细菌学家郭霍（Koch）发现结核分枝杆菌（MTB）以来，为促进结核杆菌生长，缩短培养时间，达到提前分离、鉴定的目的，人们对结核杆菌的营养、生理代谢及人工培养进行了一系列的研究，使得结核杆菌的检测技术从最初的涂片镜检、分离培养发展到现在的分子生物学及噬菌体裂解技术水平。由于分枝杆菌自身结构及遗传性的原因，决定了其营养要求高，生长缓慢的特性，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、操作复杂，需时间较长和影响因素较多，不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发展缓慢，不利于早期诊断和治疗，对结核分枝杆菌的快速诊断是应势而需！多种方法的联合应用使结核病诊断呈现出新的特点。
【关键词】结核分枝杆菌；病原学检查；分子生物学；噬菌体
【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）05-2787-01
1 结核分枝杆菌实验室诊断概况
1.1病原学诊断
1.1.1 染色镜检法
1.1.1.1 涂片抗酸染色镜检法 该法简便、快速、价廉；但敏感性低，特异性差：所有分枝杆菌均可着色，无法区别死菌与活菌，结果均为阳性。
1.1.1.2荧光染色法 在涂片法中阳性率较高，荧光显微镜下的抗酸杆菌阳性率可达50%；但假阳性率较高，保存时间短，不到4个月。
1.1.1.3液基夹层杯结核杆菌检验 该法操作方便，片中结核菌分布均匀，染色效果清晰；液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提高；消化，制片，烤片，采用结核专用消化液，可有效杀灭结核分枝杆菌，染色均在彭氏杯中完成，操作人员不直接接触标本，更好的提高了操作的安全性。
1.1.1.4液体培养+显微镜观察药敏试验 是2000年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技术。能在培养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，能显著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，同时具有较高的敏感性和特异性，痰标本直接药敏试验比常规方法提早6～8周，更具有快速诊断价值.
1.1.2培养法
1.1.2.1传统培养法 如改良罗氏培养法，该法准确，灵敏度略高于涂片法；可以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种鉴定和药敏试验；但诊断周期长，最快也需要6周，有一定的污染率。
1.1.2.2快速培养法：即BACTEC 技术。该法虽然灵敏度高于传统方法， 但应注意其特异性， 且存在同位素污染， 国外已淘汰。目前应用的是新一代 BACTEC 培养技术， 采用 BACTEC MGIT960仪测定， 解决了污染这个问题。但许多医院缺乏开展此技术的条件， 故还不能完全取代传统的结核分枝杆菌培养的方法。
1.2免疫血清学检测
包括ELISA、结明试验、免疫色谱技术、免疫胶体金标记技术、重氮乳凝法等。从70 年代建立了 ELISA 法后， 形成了很多以检测结核抗体为主的免疫血清学检测方法，为结核病的快速、准确诊断提供了广阔前景， 而寻找敏感性和特异性均高的单体蛋白作为血清学检测结核病的特异性抗原是血清学诊断的重要研究方向。
1.3分子生物学法
包括聚合酶链反应（PCR）及其衍生技术、DNA探针技术、DNA指纹技术、DNA芯片技术等，能够对临床早期疑似病人进行早期的快速诊断，而且灵敏度和特异性较高。但由于成本和实验室条件要求较高，使得其在临床上的普及受到了一定的制约。
1.4噬菌体生物扩增法
该法1997建立，并用于结核分枝杆菌耐药性测定。近年来进展很快。适用范围可检测痰液、胸水、腹水、脑脊液、尿、骨髓等多种标本，用于结核病的实验诊断，抗痨治疗效果的评价，尤其是初诊病人的鉴别诊断。从1947年Gardner首次分离出分枝杆菌噬菌体，至今已分离出了250余种，噬菌体作为一项新的研究工具逐渐被开发和利用。
2现代结核病诊断的新特点
2.1多种方法联合应用诊断， 优势互补， 提高检出率
王国斌等学者探討了使用痰聚合酶链反应（ PCR） 检测TB-DNA的方法[1]，使用酶联免疫吸附实验检测血清结核分支杆菌胞壁糖脂免疫球蛋白（ LAM-IgG）、卡介苗免疫球蛋白G（ PPD- IgG）、结合特异性免疫复合物（ SCIC）及PPD皮试5 种方法联合用于菌阴肺结核的诊断结果显示， 联合检测阳性率明显增加，而特异性仅稍降低，对于菌阴肺结核，为探讨敏感性和特异性均高的方法，联合检测已成为人们探索的新领域。
2.2对原有方法的改进、拓宽
2.2.1寻找特异性， 敏感性高的包被抗原 特异的抗原是提高免疫学检测敏感性的重要环节。近年来， 利用基因工程技术克隆表达了多种结核分支杆菌分泌性抗原， 如 PMT63， ESAT- 6，MPT64，38kDa 等。研究表明， 这些分泌蛋白参与结核病的免疫反应。因此， MPT63等抗原作为血清学诊断的新型Ag 正在被研究。
2.2.2免疫检测指标的丰富 传统免疫学方法主要检测结核抗体、抗原。随着分子免疫学的深入发展，检测内容丰富化，如： 对活动性结核标志物（ ATM） 的检测； 全血IFN-r检测等。董德琼等人的研究也表明， 血清TGF-β1的检测可作为反映结核病人免疫功能判断病情[2]。
2.3结合其它学科技术的发展
如传统的免疫学检查与放射学检查结合，与计算机的结合，基因芯片技术与压电传感器技术形成的电基因传感器芯片就是一类新兴检测技术。
随着科学技术的进步，结核分枝杆菌实验室检测技术的改进和发展，实验方法的联合应用及互补，使得结核病的诊断渐趋于快速、准确、客观。现阶段对噬菌体裂解法的改进与发展为结核病的快速诊断提供了一个新的平台及发展方向。
参考文献
[1] 王国斌，叶德普， 彭义利.5种方法联合检测对菌阴性肺结核诊断价值的研究[J].中华结核和呼吸杂志，2000，23（1）：47-49.
[2] 董德琼，姚红梅， 杨渝浩等.结核病患者转化生长因子的监测及临床意义[J].中华结核和呼吸杂志， 2001，24（5）：314-315.
【关键词】结核分枝杆菌；病原学检查；分子生物学；噬菌体
【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）05-2787-01
1 结核分枝杆菌实验室诊断概况
1.1病原学诊断
1.1.1 染色镜检法
1.1.1.1 涂片抗酸染色镜检法 该法简便、快速、价廉；但敏感性低，特异性差：所有分枝杆菌均可着色，无法区别死菌与活菌，结果均为阳性。
1.1.1.2荧光染色法 在涂片法中阳性率较高，荧光显微镜下的抗酸杆菌阳性率可达50%；但假阳性率较高，保存时间短，不到4个月。
1.1.1.3液基夹层杯结核杆菌检验 该法操作方便，片中结核菌分布均匀，染色效果清晰；液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提高；消化，制片，烤片，采用结核专用消化液，可有效杀灭结核分枝杆菌，染色均在彭氏杯中完成，操作人员不直接接触标本，更好的提高了操作的安全性。
1.1.1.4液体培养+显微镜观察药敏试验 是2000年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技术。能在培养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，能显著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，同时具有较高的敏感性和特异性，痰标本直接药敏试验比常规方法提早6～8周，更具有快速诊断价值.
1.1.2培养法
1.1.2.1传统培养法 如改良罗氏培养法，该法准确，灵敏度略高于涂片法；可以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种鉴定和药敏试验；但诊断周期长，最快也需要6周，有一定的污染率。
1.1.2.2快速培养法：即BACTEC 技术。该法虽然灵敏度高于传统方法， 但应注意其特异性， 且存在同位素污染， 国外已淘汰。目前应用的是新一代 BACTEC 培养技术， 采用 BACTEC MGIT960仪测定， 解决了污染这个问题。但许多医院缺乏开展此技术的条件， 故还不能完全取代传统的结核分枝杆菌培养的方法。
1.2免疫血清学检测
包括ELISA、结明试验、免疫色谱技术、免疫胶体金标记技术、重氮乳凝法等。从70 年代建立了 ELISA 法后， 形成了很多以检测结核抗体为主的免疫血清学检测方法，为结核病的快速、准确诊断提供了广阔前景， 而寻找敏感性和特异性均高的单体蛋白作为血清学检测结核病的特异性抗原是血清学诊断的重要研究方向。
1.3分子生物学法
包括聚合酶链反应（PCR）及其衍生技术、DNA探针技术、DNA指纹技术、DNA芯片技术等，能够对临床早期疑似病人进行早期的快速诊断，而且灵敏度和特异性较高。但由于成本和实验室条件要求较高，使得其在临床上的普及受到了一定的制约。
1.4噬菌体生物扩增法
该法1997建立，并用于结核分枝杆菌耐药性测定。近年来进展很快。适用范围可检测痰液、胸水、腹水、脑脊液、尿、骨髓等多种标本，用于结核病的实验诊断，抗痨治疗效果的评价，尤其是初诊病人的鉴别诊断。从1947年Gardner首次分离出分枝杆菌噬菌体，至今已分离出了250余种，噬菌体作为一项新的研究工具逐渐被开发和利用。
2现代结核病诊断的新特点
2.1多种方法联合应用诊断， 优势互补， 提高检出率
王国斌等学者探討了使用痰聚合酶链反应（ PCR） 检测TB-DNA的方法[1]，使用酶联免疫吸附实验检测血清结核分支杆菌胞壁糖脂免疫球蛋白（ LAM-IgG）、卡介苗免疫球蛋白G（ PPD- IgG）、结合特异性免疫复合物（ SCIC）及PPD皮试5 种方法联合用于菌阴肺结核的诊断结果显示， 联合检测阳性率明显增加，而特异性仅稍降低，对于菌阴肺结核，为探讨敏感性和特异性均高的方法，联合检测已成为人们探索的新领域。
2.2对原有方法的改进、拓宽
2.2.1寻找特异性， 敏感性高的包被抗原 特异的抗原是提高免疫学检测敏感性的重要环节。近年来， 利用基因工程技术克隆表达了多种结核分支杆菌分泌性抗原， 如 PMT63， ESAT- 6，MPT64，38kDa 等。研究表明， 这些分泌蛋白参与结核病的免疫反应。因此， MPT63等抗原作为血清学诊断的新型Ag 正在被研究。
2.2.2免疫检测指标的丰富 传统免疫学方法主要检测结核抗体、抗原。随着分子免疫学的深入发展，检测内容丰富化，如： 对活动性结核标志物（ ATM） 的检测； 全血IFN-r检测等。董德琼等人的研究也表明， 血清TGF-β1的检测可作为反映结核病人免疫功能判断病情[2]。
2.3结合其它学科技术的发展
如传统的免疫学检查与放射学检查结合，与计算机的结合，基因芯片技术与压电传感器技术形成的电基因传感器芯片就是一类新兴检测技术。
随着科学技术的进步，结核分枝杆菌实验室检测技术的改进和发展，实验方法的联合应用及互补，使得结核病的诊断渐趋于快速、准确、客观。现阶段对噬菌体裂解法的改进与发展为结核病的快速诊断提供了一个新的平台及发展方向。
参考文献
[1] 王国斌，叶德普， 彭义利.5种方法联合检测对菌阴性肺结核诊断价值的研究[J].中华结核和呼吸杂志，2000，23（1）：47-49.
[2] 董德琼，姚红梅， 杨渝浩等.结核病患者转化生长因子的监测及临床意义[J].中华结核和呼吸杂志， 2001，24（5）：314-315.