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摘要
[目的]建立肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞的共培养体系。[方法]用10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX对北京油鸡肌肉SV细胞进行诱导后，通过油红染色法、细胞免疫学鉴定及关键基因的表达对诱导的SV细胞进行分析。[结果]油红O脂肪染色法鉴定结果表明，诱导后的细胞红色脂质密度较高，说明SV细胞经过诱导后含有更多的前体脂肪细胞。通过实时荧光PCR定量检测细胞发育的标志性基因，发现诱导与未诱导的肌肉SV细胞均会表达前体脂肪细胞标志性基因。[结论]肌肉SV细胞经过诱导后前体脂肪细胞的含量得到提高，有利于建立前体脂肪细胞和肌卫星细胞的体外培养体系。
关键词 北京油鸡；前体脂肪细胞；肌卫星细胞；共培养体系；诱导
中图分类号 S831.8+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-151-03
Study on the Adipogenic Differentiation of SV Cells in Skeletal Muscles of Beijing You Chicken
SONG Jiao1， YANG Ye1*， YU Xiaoqiong2 et al
（1. College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025； 2. State Key Laboratory of Animal Nutrition， Institute of Animal Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193）
Abstract [Objective] This research aimed to establish the cocultures system of muscle satellite cells and intramuscular preadipocytes. [Method] The SV cells in the muscles of Beijing You Chicken were induced with 10 μg/ml insulin （INS）， 1 μmol/L dexamethasone （DEX） and 115 ng/ml 3isobutyl1methyl xanthine （IBMX）. And the induced SV cells were identified by oil red O staining， cellular immunological identification and the expression of key genes involved in adipogenesis and myogenesis. [Result] The results of oil red O staining showed that the induced SV cells contained higherdensity red stained lipid， which indicated that the induced SV cells contained more preadipocytes. The key genes about the cell development were detected by realtime fluorescent quantitive PCR. The detection results showed that the key genes of preadipocytes could be expressed by induced and noninduced SV cells in the muscles. [Conclusion] The induced muscle SV cells contained more preadipocytes， which was be propitious to establish the coculture system in vitro of muscle satellite cells and preadipocytes.
Key words Beijing You Chicken； Preadipocyte； Muscle satellite cell； Coculture system； Induction
肌內前体脂肪是肌卫星细胞的重要组成部分之一，肌卫星细胞在特定的分子机制（如PPARs信号系统、WNT信号系统和肌肉分泌因子）作用下可以转变为脂肪细胞[1]。由于受到肌肉和脂肪内分泌素（myokines、adipokines）相互作用的影响，肌内脂肪细胞可能与脂肪组织里脂肪细胞具有不同的生物学代谢过程[2]。在共培养体系中，肌细胞和脂肪细胞的代谢都与单独培养时的代谢具有一定的差异[3]。因此，建立合适的共培养体系能更好地阐明细胞间相互联系的复杂性，是研究肌内脂肪沉积和肌肉发育的生物学基础。
来源于肌肉的SV细胞具有类似于肌卫星细胞的增殖分化特性，同时也具有一些脂肪细胞的特性，是一种建立理想细胞共培养体系的细胞来源，但由于受到细胞贴壁时间的影响，在分离的肌肉SV细胞内含有的前体脂肪细胞很少[4]，同时受到肌细胞分泌素（myokines）的影响，前体脂肪细胞的分化会受到严重抑制[5]。基于此，笔者在前期分离肌肉SV细胞的基础上，使用一定的脂肪生成诱导剂对肌肉SV细胞的脂肪生成能力进行诱导，以使肌肉SV细胞中的前体脂肪细胞更好地分化表达，从而建立一种理想的细胞培养模型。
1 材料与方法 1.1 试剂
DMEM、DMEM/F12、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均为Gibco公司产品；Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、地塞米松（Dex）、胰岛素（Ins）、3异丁基1甲基黄嘌呤（IBMX）均为Sigma公司产品。Pax7鼠抗鸡一抗、Demsin鼠抗鸡一抗、FITC羊抗鼠二抗均为Abcam公司产品。
1.2 肌肉基质细胞的分离与培养
采用窒息法将4～7日龄北京油鸡杀死后，放入75%（v/v）酒精溶液中全身浸泡消毒30 s，于细胞室超菌台进行分离细胞工作。取胸大肌后迅速放入含有双抗的DHanks溶液中清洗3次，剪成肉糜状，移入10 ml离心管中，再加入2倍体积的0.1%Ⅰ型胶原蛋白酶，于37 ℃摇床中消化30～40 min，1 000 r/min离心8 min，弃上清。然后，再加2倍体积的0.25%的胰蛋白酶，37 ℃摇床中消化15～20 min；此后，加入2～3倍体积的DMEM培养基中止消化，用吸管反复吹打使组织分散，将细胞悬浮液依次滤过200、400和600目的不锈钢筛，收集滤液。将过滤液1 000 r/min离心5 min，弃上清，用2 ml含15%FBS的DMEM重悬细胞，接种于培养板在37 ℃、5%CO2培养箱中培养2 h后，将细胞悬浮液接种于其他培养板，获得肌肉SV细胞。
1.3 肌肉SV细胞成脂诱导后脂质含量的测定
分离细胞按1×105个/ml接种于6板96孔板，每孔接种100 μl，每板接种18孔，其中诱导和未诱导各9孔，诱导组在细胞贴壁后使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX的培养液诱导分化，在诱导24、48、72 h后进行细胞脂质含量。其中3板分别在诱导24、48、72 h后采用油红O染色法测定细胞内脂质含量，另外3板在上述时间采用MTT法测定细胞数量。以单位细胞数的OD值反映细胞内脂质含量。
1.4 肌肉SV细胞成脂诱导后细胞的鉴定
将分离的基质细胞按1×105个/ml接种于6孔板，每孔2 ml，当细胞生长至70%～80%汇合时，细胞分为未诱导组（对照组）和诱导组，诱导组使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/LDEX和115 ng/ml IBMX的培养液诱导分化，在诱导48 h后2个处理同时采用油红O染色法进行前体脂肪细胞的鉴定。
1.5 肌肉SV细胞成脂诱导后基因表达的测定
将分离到的基质细胞按1×105个/ml接种于6孔板，每孔2 ml，当细胞生长培养6 d后，将细胞分为未诱导组（对照组）和诱导组，诱导组使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX的培养液诱导分化，在诱导24、48 h后分别收集2组的细胞，提取细胞RNA，每个时间点提取6孔（6个重复），对肌卫星细胞特异性基因（Pax7、MyoD、Myogenin）和脂肪细胞发育特异性基因（C/EBPβ、SREBP2、PPARγ、LPL）的mRNA表达进行分析。基因引物及序列号见表1。通过2 -ΔΔCt 值来衡量诱导对基因相对表达量的影响[6]。
1.6 数据统计与分析
采用SAS 8.0统计软件中的ANOVA程序对不同诱导时间细胞的基因相对表达量的差异进行分析，差异显著者采用Duncan氏法进行多重比较。试验结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 肌肉SV细胞脂质含量 从图1可以看出，随着培养时间的增加，肌肉SV细胞脂质的含量逐渐增加，并且随着诱导时间的增加，脂质含量明显增加。
2.2 细胞的鉴定 前体脂肪细胞油红O染色结果表明，诱导组和未诱导组细胞都有红色脂质沉积，其中诱导后的细胞红色脂质密度较高（图2），说明诱导有助于前体脂肪细胞的分化。
2.3 细胞关键基因表达的分析
从图3可以看出，前体脂肪细胞在诱导24 h后C/EBPβ和LPL基因的表达水平显著
下降（P<0.05），而诱导48 h后又显著上升（P<0.05）；
3 讨论
肌肉SV细胞中含有丰富的前体脂肪细胞和肌卫星细胞，是建立前体脂肪细胞和肌卫星细胞共培养体系理想的细胞来源[4]。由于这2种细胞贴壁时间的不同，从肌肉SV细胞分离到的肌卫星细胞中含有的前体脂肪细胞数量很少，肌卫星细胞在数量上占有绝对优势，但肌卫星细胞作为具有多种自我更新的异质干细胞群，同时也具有肌卫星细胞具有转化为脂肪细胞的潜力，在特定细胞因子的作用下（如PPARs、WNT生长因子、myokines等），肌卫星细胞可以转化为脂肪细胞并沉积脂肪，同时伴随着脂肪细胞特异性基因（如PPARγ）的表达[1]。
在多细胞培养体系中，DEX（地塞米松）和胰岛素（INS）一般都用于促进脂肪细胞的分化和脂肪的形成[7]。前体脂肪细胞在激素（胰岛素和类固醇激素）的作用下启动C/EBPβ和C/EBPδ的表达，从而促进一系列脂肪形成转录因子的表达[8]。C/EBPβ和C/EBPδ是脂肪形成早期表达的主要转录因子，通过C/EBPβ和C/EBPδ的协同作用可以促进PPARγ的表达[9]。甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）是前体脂肪细胞向脂肪细胞分化的标志，SREBP在体内通过PPARγ途径调节许多与脂肪生成有关的基因的表达，如LPL和FAS等。PPARγ是脂肪开始生成转录的标志性蛋白，是脂肪形成所必需的转录因子[8]。SV细胞在激素诱导下，PPARγ、C/EBPβ和SREBP的表達量都会增加，说明SV细胞
中前体脂肪细胞的数量发生了变化，并随着诱导时间的增
加，基因的表达会有所增加。
肌肉内脂肪的代谢途径是肌内脂肪细胞和肌细胞相互作用的结果，肌内脂肪与肌肉的比例不仅是评价动物肉品质非常重要的指标，也是影响动物健康的重要因素[1]。因此，建立合适的肌细胞和肌内脂肪细胞共培养的模型，不仅可以 研究肌內脂肪的沉积和肌细胞发育机制，从而改善动物肌肉
品质，更重要的是可以研究二者的相互调控对动物健康的影响，促进动物福利的改善。该研究只提供了这2种细胞共培养的初步模型，今后还需要对这2种细胞的精确调控发育进行进一步研究。
参考文献
[1] VETTOR R，MILAN G，FRANZIN C，et al.The origin of intermuscular adipose tissue and its pathophysiological implications[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，297：987-998.
[2] SELL H，DIETZESCHROEDER D，ECKEL J.The adipocytemyocyte axis in insulin resistance[J].TRENDS in Endocrinology and Metabolism，2006，17（10）：416-422.
[3] VU V，KIM W，FANG X，et al.Coculture with primary visceral rat adipocytes from control but not streptozotocininduced diabetic animals increases glucose uptake in rat skeletal muscle cells：Role of adiponectin[J].Endocrinology，2007，148：4411-4419.
[4] HAUSMAN G J，POULOS S P.A method to establish cocultures of myotubes and preadipocytes from collagenase digested neonatal pig semitendinosus muscles[J].J Anim Sci，2005，83：1010-1016.
[5] QUINN L S，ANDERSON B G，STRAITBODEY L，et al.Oversecretion of interleukin15 from skeletal muscle reduces adiposity[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，296：191-202.
[6] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2 -ΔΔCT method[J].Methods，2001，25：402-408.
[7] POULOS S P，DODSON M V，HOUSMAN G J.Cell line models for differentiation：preadipocytes and adipocytes[J].Experimental Biology and Medicine，2010，235：1185-1193.
[8] TONTONOZ1 P，SPIEGELMAN B M.Fat and beyond：The diverse biology of PPARγ[J].Annu Rev Biochem，2008，77：289-312.
[9] LEFTEROVA M I，LAZAR MA.New developments in adipogenesis[J].Trends Endocrinol Metab，2009，20：107-114.
[目的]建立肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞的共培养体系。[方法]用10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX对北京油鸡肌肉SV细胞进行诱导后，通过油红染色法、细胞免疫学鉴定及关键基因的表达对诱导的SV细胞进行分析。[结果]油红O脂肪染色法鉴定结果表明，诱导后的细胞红色脂质密度较高，说明SV细胞经过诱导后含有更多的前体脂肪细胞。通过实时荧光PCR定量检测细胞发育的标志性基因，发现诱导与未诱导的肌肉SV细胞均会表达前体脂肪细胞标志性基因。[结论]肌肉SV细胞经过诱导后前体脂肪细胞的含量得到提高，有利于建立前体脂肪细胞和肌卫星细胞的体外培养体系。
关键词 北京油鸡；前体脂肪细胞；肌卫星细胞；共培养体系；诱导
中图分类号 S831.8+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-151-03
Study on the Adipogenic Differentiation of SV Cells in Skeletal Muscles of Beijing You Chicken
SONG Jiao1， YANG Ye1*， YU Xiaoqiong2 et al
（1. College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025； 2. State Key Laboratory of Animal Nutrition， Institute of Animal Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193）
Abstract [Objective] This research aimed to establish the cocultures system of muscle satellite cells and intramuscular preadipocytes. [Method] The SV cells in the muscles of Beijing You Chicken were induced with 10 μg/ml insulin （INS）， 1 μmol/L dexamethasone （DEX） and 115 ng/ml 3isobutyl1methyl xanthine （IBMX）. And the induced SV cells were identified by oil red O staining， cellular immunological identification and the expression of key genes involved in adipogenesis and myogenesis. [Result] The results of oil red O staining showed that the induced SV cells contained higherdensity red stained lipid， which indicated that the induced SV cells contained more preadipocytes. The key genes about the cell development were detected by realtime fluorescent quantitive PCR. The detection results showed that the key genes of preadipocytes could be expressed by induced and noninduced SV cells in the muscles. [Conclusion] The induced muscle SV cells contained more preadipocytes， which was be propitious to establish the coculture system in vitro of muscle satellite cells and preadipocytes.
Key words Beijing You Chicken； Preadipocyte； Muscle satellite cell； Coculture system； Induction
肌內前体脂肪是肌卫星细胞的重要组成部分之一，肌卫星细胞在特定的分子机制（如PPARs信号系统、WNT信号系统和肌肉分泌因子）作用下可以转变为脂肪细胞[1]。由于受到肌肉和脂肪内分泌素（myokines、adipokines）相互作用的影响，肌内脂肪细胞可能与脂肪组织里脂肪细胞具有不同的生物学代谢过程[2]。在共培养体系中，肌细胞和脂肪细胞的代谢都与单独培养时的代谢具有一定的差异[3]。因此，建立合适的共培养体系能更好地阐明细胞间相互联系的复杂性，是研究肌内脂肪沉积和肌肉发育的生物学基础。
来源于肌肉的SV细胞具有类似于肌卫星细胞的增殖分化特性，同时也具有一些脂肪细胞的特性，是一种建立理想细胞共培养体系的细胞来源，但由于受到细胞贴壁时间的影响，在分离的肌肉SV细胞内含有的前体脂肪细胞很少[4]，同时受到肌细胞分泌素（myokines）的影响，前体脂肪细胞的分化会受到严重抑制[5]。基于此，笔者在前期分离肌肉SV细胞的基础上，使用一定的脂肪生成诱导剂对肌肉SV细胞的脂肪生成能力进行诱导，以使肌肉SV细胞中的前体脂肪细胞更好地分化表达，从而建立一种理想的细胞培养模型。
1 材料与方法 1.1 试剂
DMEM、DMEM/F12、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均为Gibco公司产品；Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、地塞米松（Dex）、胰岛素（Ins）、3异丁基1甲基黄嘌呤（IBMX）均为Sigma公司产品。Pax7鼠抗鸡一抗、Demsin鼠抗鸡一抗、FITC羊抗鼠二抗均为Abcam公司产品。
1.2 肌肉基质细胞的分离与培养
采用窒息法将4～7日龄北京油鸡杀死后，放入75%（v/v）酒精溶液中全身浸泡消毒30 s，于细胞室超菌台进行分离细胞工作。取胸大肌后迅速放入含有双抗的DHanks溶液中清洗3次，剪成肉糜状，移入10 ml离心管中，再加入2倍体积的0.1%Ⅰ型胶原蛋白酶，于37 ℃摇床中消化30～40 min，1 000 r/min离心8 min，弃上清。然后，再加2倍体积的0.25%的胰蛋白酶，37 ℃摇床中消化15～20 min；此后，加入2～3倍体积的DMEM培养基中止消化，用吸管反复吹打使组织分散，将细胞悬浮液依次滤过200、400和600目的不锈钢筛，收集滤液。将过滤液1 000 r/min离心5 min，弃上清，用2 ml含15%FBS的DMEM重悬细胞，接种于培养板在37 ℃、5%CO2培养箱中培养2 h后，将细胞悬浮液接种于其他培养板，获得肌肉SV细胞。
1.3 肌肉SV细胞成脂诱导后脂质含量的测定
分离细胞按1×105个/ml接种于6板96孔板，每孔接种100 μl，每板接种18孔，其中诱导和未诱导各9孔，诱导组在细胞贴壁后使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX的培养液诱导分化，在诱导24、48、72 h后进行细胞脂质含量。其中3板分别在诱导24、48、72 h后采用油红O染色法测定细胞内脂质含量，另外3板在上述时间采用MTT法测定细胞数量。以单位细胞数的OD值反映细胞内脂质含量。
1.4 肌肉SV细胞成脂诱导后细胞的鉴定
将分离的基质细胞按1×105个/ml接种于6孔板，每孔2 ml，当细胞生长至70%～80%汇合时，细胞分为未诱导组（对照组）和诱导组，诱导组使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/LDEX和115 ng/ml IBMX的培养液诱导分化，在诱导48 h后2个处理同时采用油红O染色法进行前体脂肪细胞的鉴定。
1.5 肌肉SV细胞成脂诱导后基因表达的测定
将分离到的基质细胞按1×105个/ml接种于6孔板，每孔2 ml，当细胞生长培养6 d后，将细胞分为未诱导组（对照组）和诱导组，诱导组使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX的培养液诱导分化，在诱导24、48 h后分别收集2组的细胞，提取细胞RNA，每个时间点提取6孔（6个重复），对肌卫星细胞特异性基因（Pax7、MyoD、Myogenin）和脂肪细胞发育特异性基因（C/EBPβ、SREBP2、PPARγ、LPL）的mRNA表达进行分析。基因引物及序列号见表1。通过2 -ΔΔCt 值来衡量诱导对基因相对表达量的影响[6]。
1.6 数据统计与分析
采用SAS 8.0统计软件中的ANOVA程序对不同诱导时间细胞的基因相对表达量的差异进行分析，差异显著者采用Duncan氏法进行多重比较。试验结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 肌肉SV细胞脂质含量 从图1可以看出，随着培养时间的增加，肌肉SV细胞脂质的含量逐渐增加，并且随着诱导时间的增加，脂质含量明显增加。
2.2 细胞的鉴定 前体脂肪细胞油红O染色结果表明，诱导组和未诱导组细胞都有红色脂质沉积，其中诱导后的细胞红色脂质密度较高（图2），说明诱导有助于前体脂肪细胞的分化。
2.3 细胞关键基因表达的分析
从图3可以看出，前体脂肪细胞在诱导24 h后C/EBPβ和LPL基因的表达水平显著
下降（P<0.05），而诱导48 h后又显著上升（P<0.05）；
3 讨论
肌肉SV细胞中含有丰富的前体脂肪细胞和肌卫星细胞，是建立前体脂肪细胞和肌卫星细胞共培养体系理想的细胞来源[4]。由于这2种细胞贴壁时间的不同，从肌肉SV细胞分离到的肌卫星细胞中含有的前体脂肪细胞数量很少，肌卫星细胞在数量上占有绝对优势，但肌卫星细胞作为具有多种自我更新的异质干细胞群，同时也具有肌卫星细胞具有转化为脂肪细胞的潜力，在特定细胞因子的作用下（如PPARs、WNT生长因子、myokines等），肌卫星细胞可以转化为脂肪细胞并沉积脂肪，同时伴随着脂肪细胞特异性基因（如PPARγ）的表达[1]。
在多细胞培养体系中，DEX（地塞米松）和胰岛素（INS）一般都用于促进脂肪细胞的分化和脂肪的形成[7]。前体脂肪细胞在激素（胰岛素和类固醇激素）的作用下启动C/EBPβ和C/EBPδ的表达，从而促进一系列脂肪形成转录因子的表达[8]。C/EBPβ和C/EBPδ是脂肪形成早期表达的主要转录因子，通过C/EBPβ和C/EBPδ的协同作用可以促进PPARγ的表达[9]。甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）是前体脂肪细胞向脂肪细胞分化的标志，SREBP在体内通过PPARγ途径调节许多与脂肪生成有关的基因的表达，如LPL和FAS等。PPARγ是脂肪开始生成转录的标志性蛋白，是脂肪形成所必需的转录因子[8]。SV细胞在激素诱导下，PPARγ、C/EBPβ和SREBP的表達量都会增加，说明SV细胞
中前体脂肪细胞的数量发生了变化，并随着诱导时间的增
加，基因的表达会有所增加。
肌肉内脂肪的代谢途径是肌内脂肪细胞和肌细胞相互作用的结果，肌内脂肪与肌肉的比例不仅是评价动物肉品质非常重要的指标，也是影响动物健康的重要因素[1]。因此，建立合适的肌细胞和肌内脂肪细胞共培养的模型，不仅可以 研究肌內脂肪的沉积和肌细胞发育机制，从而改善动物肌肉
品质，更重要的是可以研究二者的相互调控对动物健康的影响，促进动物福利的改善。该研究只提供了这2种细胞共培养的初步模型，今后还需要对这2种细胞的精确调控发育进行进一步研究。
参考文献
[1] VETTOR R，MILAN G，FRANZIN C，et al.The origin of intermuscular adipose tissue and its pathophysiological implications[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，297：987-998.
[2] SELL H，DIETZESCHROEDER D，ECKEL J.The adipocytemyocyte axis in insulin resistance[J].TRENDS in Endocrinology and Metabolism，2006，17（10）：416-422.
[3] VU V，KIM W，FANG X，et al.Coculture with primary visceral rat adipocytes from control but not streptozotocininduced diabetic animals increases glucose uptake in rat skeletal muscle cells：Role of adiponectin[J].Endocrinology，2007，148：4411-4419.
[4] HAUSMAN G J，POULOS S P.A method to establish cocultures of myotubes and preadipocytes from collagenase digested neonatal pig semitendinosus muscles[J].J Anim Sci，2005，83：1010-1016.
[5] QUINN L S，ANDERSON B G，STRAITBODEY L，et al.Oversecretion of interleukin15 from skeletal muscle reduces adiposity[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，296：191-202.
[6] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2 -ΔΔCT method[J].Methods，2001，25：402-408.
[7] POULOS S P，DODSON M V，HOUSMAN G J.Cell line models for differentiation：preadipocytes and adipocytes[J].Experimental Biology and Medicine，2010，235：1185-1193.
[8] TONTONOZ1 P，SPIEGELMAN B M.Fat and beyond：The diverse biology of PPARγ[J].Annu Rev Biochem，2008，77：289-312.
[9] LEFTEROVA M I，LAZAR MA.New developments in adipogenesis[J].Trends Endocrinol Metab，2009，20：107-114.