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[摘要] 目的 探讨胃癌组织中DPC4蛋白的表达及其与临床病理特征的关系。 方法 采用免疫组化Envision二步法检测50例胃癌及20例癌旁正常组织中DPC4蛋白的表达，并探讨其与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织分化程度、浸润深度和淋巴结转移等临床病理特征的关系。 结果 50例胃癌组织中的DPC4表达阳性31例（62.0%）；20例癌旁正常组织中DPC4表达均为阳性（100.0%）。胃癌组织中DPC4表达的阳性率明显低于癌旁正常组织（χ2=10.43，P < 0.01）。胃癌组织中DPC4表达与性别和年龄无明显的统计学关系（P > 0.05）。肿瘤直径<2 cm胃癌DPC4阳性率明显高于肿瘤直径≥2 cm，高-中分化胃癌DPC4阳性率明显高于低-未分化，T1～2期胃癌DPC4阳性率明显高于T3～4期，无淋巴结转移胃癌DPC4阳性率明显高于有淋巴结转移，差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。 结论 DPC4基因参与胃癌的发生、发展、浸润和转移过程，其表达程度与胃癌的分化程度、浸润深度和淋巴结转移等临床病理特征密切相关，与胃癌细胞的异常增殖和恶性转化密切相关。
[关键词] 胃癌；DPC4；临床病理特征
[中图分类号] R735.34 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）14-0091-03
胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其发病过程是一个多步骤、有序和多基因共同参与的病理变化过程，不仅与癌细胞异常分化密切相关，而且与癌细胞的凋亡调节紊乱密切相关[1]。DPC4是一种新发现的抑癌基因，在癌细胞的分化调控中起负性调节作用。近年来研究发现DPC4的异常表达与肿瘤发生、发展、转移和转归等密切相关，但有关胃癌组织中DPC4基因表达及其与临床病理特征关系国内外报道不多[2，3]。本研究观察了胃癌组织中DPC4蛋白表达及其与患者临床病理特征的关系。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源
选择2008年1月～2012年12月在我院手术切除治疗的胃癌组织标本50例。所有的患者均有完整临床和病理学资料，术前均未进行任何方式的放化疗或免疫治疗。其中男32例，女18例。年龄37～89岁，平均（65.7±7.3）岁。另选择同期手术切除的20例癌旁正常组织作为对照组，其中男13例，女7例；年龄38～87岁，平均（65.3±7.0）岁。两组患者的性别构成和年龄分布相类似，比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
1.2 免疫组化染色
采用免疫组化Envision二步法测定组织中DPC4表达。标本中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规4 μm厚切片，二甲苯脱蜡和梯度酒精水化，3%双氧水室温下常规孵育10 min，采用柠檬酸抗原修复液进行微波抗原修复，滴加5%～10%正常山羊血清封闭10 min，倾去血清后滴加DPC4一抗工作液，常规4℃过夜，后滴加相应二抗工作液37°C孵育30 min。各步骤间用PBS冲洗5 min×3次。常规DAB显色、苏木精衬染、脱水、透明、封片和镜检。用已知阳性切片行阳性对照，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗行空白对照。用已知阳性的胃癌组织作阳性对照。DPC4单克隆抗体和免疫组化Envision二步法试剂盒均由北京中杉金桥生物公司提供，严格按试剂盒中说明书进行操作。
1.3 结果判定
DPC4染色判断[4]：以光镜下细胞膜和/或细胞浆内出现浅黄、棕黄或棕褐色颗粒反应判定为阳性细胞。分别于5个不同高倍视野相同范围下计数500个细胞及染色阳性细胞数。根据高倍镜视野下计数细胞的染色强度进行计分，其中无着色计0分、浅黄色计1分、棕黄色计2分，棕褐色计3分；同时再根据染色阳性细胞所占的总的细胞比例进行阳性细胞比例计分，其中阴性计0分，阳性细胞的比例≤10%计1分，阳性细胞的比例11%～50%计2分，阳性细胞的比例51%～75%计3分，阳性细胞的比例>75%计4分。根据染色强度计分和阳性细胞比例计分的乘积≥2分即为DPC4表达（ ），否则DPC4表达（-）。
1.4 统计学处理
采用SPSS 17.0统计学软件。计数资料结果以率表示，采用χ2检验。
2 结果
2.1 胃癌及癌旁正常组织中DPC4阳性率比较
50例胃癌组织中的DPC4表达阳性31例（62.0%）；20例癌旁正常组织中DPC4表达均为阳性（100.0%）。胃癌组织中DPC4表达阳性率明显低于癌旁正常组织（χ2=10.43，P < 0.01）。见图1。
2.2 胃癌组织中DPC4表达与临床病理特征关系
胃癌组织中DPC4表达与性别和年龄无明显的统计学关系（P > 0.05）。肿瘤直径<2 cm胃癌DPC4阳性率明显高于肿瘤直径≥2 cm，高-中分化胃癌DPC4阳性率明显高于低-未分化，T1-2期胃癌DPC4阳性率明显高于T3-4期，无淋巴结转移胃癌DPC4阳性率明显高于有淋巴结转移，均具有明显统计学差异（均P < 0.05）。见表1。
3 讨论
胃癌的发生和发展是一个错综复杂的由环境污染、饮食不良和基因结构缺陷等因素共同作用的病理过程，其中抑癌基因失活在其中起重要作用[5]。DPC4定位于人体染色体18q21.1，含11个外显子和10个内含子，编码552个氨基酸残基组成的DPC4蛋白[6]。目前已证实DPC4基因是TGFβ基因信号传导的中介。如DPC基因发生突变或缺失，对TGFβ基因的抑制作用减弱，从而增加其抗凋亡功能使细胞永生化形成肿瘤，且DPC4基因突变或缺失可使得与DPC4蛋白结合细胞的DNA活性明显降低，引起TGFβ通路基因转录发生失活，造成细胞永生化形成肿瘤[7]。DPC4基因在多种人类肿瘤的病因及发病机制中的重要作用而备受临床研究的重视[8]。 近年来随着对抑癌基因DPC4基因研究深入，研究发现DPC4基因与胃癌发病过程及临床病理特征的关系密切。邵云霞等[9]研究发现胃癌组织中DPC4蛋白表达的阳性率高达75%，而20例癌周正常黏膜组织DPC4蛋白均呈强阳性表达。统计学分析示胃癌组织DPC4蛋白的表达阳性率明显低于癌周正常黏膜组织，且胃癌组织中DPC4蛋白的表达与患者的年龄和发生部位无明显的相关性，而与胃癌的临床分期、淋巴结转移、病理分级和肿物大小密切相关，DPC4蛋白的阳性表达与胃癌组织的发生发展密切相关，对化疗疗效的判断和预后评估判断具有较好的参考价值。曲洪滨等[10]研究发现正常大肠组织DPC4蛋白阳性表达率高达100%，而大肠癌组织中DPC4蛋白大多表达呈（-）～（ ），统计分析示大肠癌组织DPC4 蛋白表达程度明显低于正常大肠组织。表明DPC4蛋白的表达与大肠癌发生和发展关系密切，有望成为大肠癌基因诊断和治疗的生物学标记物。本研究结果显示胃癌组织中DPC4表达的阳性率明显低于癌旁正常组织，提示DPC4基因与胃癌细胞的异常增殖和恶性转化密切相关，参与胃癌的发生、发展、浸润和转移的过程。同时研究还发现胃癌组织中DPC4表达与性别和年龄无明显的统计学关系。肿瘤直径<2 cm胃癌DPC4阳性率明显高于肿瘤直径≥2 cm，高-中分化胃癌DPC4阳性率明显高于低-未分化，T1-2期胃癌DPC4阳性率明显高于T3-4期，无淋巴结转移胃癌DPC4阳性率明显高于有淋巴结转移，均具有明显的统计学差异。提示胃癌中DPC4表达与癌组织的分化程度呈负正相关，与胃癌的浸润深度和淋巴转移呈负相关，推测DPC4表达减少或缺失可进一步参与胃癌的恶性演进过程，且胃癌恶性程度和预后密切相关。我们推测DPC4表达减少或缺失，使DPC4基因对TGFβ基因的抑制功能下降，同时增加其抗凋亡功能使细胞永生化形成肿瘤，并可使 DPC4蛋白结合的DNA活性明显下降或丧失，引起TGFβ通路基因转录发生失活，造成细胞永生化形成肿瘤[11，12]。
总之，DPC4基因参与胃癌的发生、发展、浸润和转移过程，其表达程度与胃癌的分化程度、浸润深度和淋巴结转移等临床病理特征密切相关，与胃癌细胞的异常增殖和恶性转化密切相关。
[参考文献]
[1] 李国庆，丰义宽，周海波，等. 食管癌、胃癌和结直肠癌DPC4基因的失活与突变[J]. 中华消化杂志，2002，22（4）：253-254.
[2] 谢忠士，谭岩，宋燕. DPC4基因转染对结肠癌SW480细胞的影响[J]. 中国实验诊断学，2012，16（8）：1358-1360.
[3] 陕光，唐甜. 抑癌基因DPC4和TGF-β1在膀胱尿路上皮癌中的表达和意义[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志，2011，20（5）：491-495.
[4] 崔巍，王立辉，王贺，等. 胃癌细胞中DPC4基因失活与启动子区的突变[J]. 肿瘤防治研究， 2009，36（3）：199-202.
[5] Yam am ot o E，Ito T，Abe A，et al. Ikar os is expressed in human extravillous trophoblasts and involved in their migration and invasion[J]. Mol Hum Reprod，2005，11（11）：825-831.
[6] Schutte M，H ruban RH，Hedrick L，et al. DPC4 gene in various tumor types[J]. Cancer Res，1996，56（11）：2527-2530.
[7] Malmot CN，Mild G，Reuter J，et al. Infrequent mutation of the tumor-suppressor gene SMAD4 in early-stage colorect al cancer[J]. Br J Cancer，2003，88（3）：420-423.
[8] Olitaki N，Yamaguchi A，Goi T，et al. Spmat calterations of the DPC4 and Mad2 genes in colorectal cancers and rel ationship to metastasis[J]. Int J Oncogene，2002，18（2）：265-270.
[9] 邵云霞，曲延刚，朱文娣. 抑癌基因 DPC4在胃癌蛋白的表达及临床意义[J]. 河北医学，2006，12（2）：111-113.
[10] 曲洪滨，付晓光，高志安，等. 大肠癌组织中抑癌基因DPC4和PTEN蛋白表达意义的研究[J]. 锦州医学院学报，2006，27（1）： 1-4.
[11] 张东伟，杨维良，孙东升. 抑癌基因DPC4在大肠癌组织中的表达及其临床意义[J]. 中华实验外科杂志，2004，21（5）：617-619.
[12] Maitra A，Molberg K，Albores-Saavedra J，et al. Loss of DPC4 expression in colonic aden carcinomas correlates with the presence of metstatic disease[J]. Am J Pathology，2000，157（4）：1105-1108.
（收稿日期：2013-02-20）
[关键词] 胃癌；DPC4；临床病理特征
[中图分类号] R735.34 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）14-0091-03
胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其发病过程是一个多步骤、有序和多基因共同参与的病理变化过程，不仅与癌细胞异常分化密切相关，而且与癌细胞的凋亡调节紊乱密切相关[1]。DPC4是一种新发现的抑癌基因，在癌细胞的分化调控中起负性调节作用。近年来研究发现DPC4的异常表达与肿瘤发生、发展、转移和转归等密切相关，但有关胃癌组织中DPC4基因表达及其与临床病理特征关系国内外报道不多[2，3]。本研究观察了胃癌组织中DPC4蛋白表达及其与患者临床病理特征的关系。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 标本来源
选择2008年1月～2012年12月在我院手术切除治疗的胃癌组织标本50例。所有的患者均有完整临床和病理学资料，术前均未进行任何方式的放化疗或免疫治疗。其中男32例，女18例。年龄37～89岁，平均（65.7±7.3）岁。另选择同期手术切除的20例癌旁正常组织作为对照组，其中男13例，女7例；年龄38～87岁，平均（65.3±7.0）岁。两组患者的性别构成和年龄分布相类似，比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
1.2 免疫组化染色
采用免疫组化Envision二步法测定组织中DPC4表达。标本中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规4 μm厚切片，二甲苯脱蜡和梯度酒精水化，3%双氧水室温下常规孵育10 min，采用柠檬酸抗原修复液进行微波抗原修复，滴加5%～10%正常山羊血清封闭10 min，倾去血清后滴加DPC4一抗工作液，常规4℃过夜，后滴加相应二抗工作液37°C孵育30 min。各步骤间用PBS冲洗5 min×3次。常规DAB显色、苏木精衬染、脱水、透明、封片和镜检。用已知阳性切片行阳性对照，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗行空白对照。用已知阳性的胃癌组织作阳性对照。DPC4单克隆抗体和免疫组化Envision二步法试剂盒均由北京中杉金桥生物公司提供，严格按试剂盒中说明书进行操作。
1.3 结果判定
DPC4染色判断[4]：以光镜下细胞膜和/或细胞浆内出现浅黄、棕黄或棕褐色颗粒反应判定为阳性细胞。分别于5个不同高倍视野相同范围下计数500个细胞及染色阳性细胞数。根据高倍镜视野下计数细胞的染色强度进行计分，其中无着色计0分、浅黄色计1分、棕黄色计2分，棕褐色计3分；同时再根据染色阳性细胞所占的总的细胞比例进行阳性细胞比例计分，其中阴性计0分，阳性细胞的比例≤10%计1分，阳性细胞的比例11%～50%计2分，阳性细胞的比例51%～75%计3分，阳性细胞的比例>75%计4分。根据染色强度计分和阳性细胞比例计分的乘积≥2分即为DPC4表达（ ），否则DPC4表达（-）。
1.4 统计学处理
采用SPSS 17.0统计学软件。计数资料结果以率表示，采用χ2检验。
2 结果
2.1 胃癌及癌旁正常组织中DPC4阳性率比较
50例胃癌组织中的DPC4表达阳性31例（62.0%）；20例癌旁正常组织中DPC4表达均为阳性（100.0%）。胃癌组织中DPC4表达阳性率明显低于癌旁正常组织（χ2=10.43，P < 0.01）。见图1。
2.2 胃癌组织中DPC4表达与临床病理特征关系
胃癌组织中DPC4表达与性别和年龄无明显的统计学关系（P > 0.05）。肿瘤直径<2 cm胃癌DPC4阳性率明显高于肿瘤直径≥2 cm，高-中分化胃癌DPC4阳性率明显高于低-未分化，T1-2期胃癌DPC4阳性率明显高于T3-4期，无淋巴结转移胃癌DPC4阳性率明显高于有淋巴结转移，均具有明显统计学差异（均P < 0.05）。见表1。
3 讨论
胃癌的发生和发展是一个错综复杂的由环境污染、饮食不良和基因结构缺陷等因素共同作用的病理过程，其中抑癌基因失活在其中起重要作用[5]。DPC4定位于人体染色体18q21.1，含11个外显子和10个内含子，编码552个氨基酸残基组成的DPC4蛋白[6]。目前已证实DPC4基因是TGFβ基因信号传导的中介。如DPC基因发生突变或缺失，对TGFβ基因的抑制作用减弱，从而增加其抗凋亡功能使细胞永生化形成肿瘤，且DPC4基因突变或缺失可使得与DPC4蛋白结合细胞的DNA活性明显降低，引起TGFβ通路基因转录发生失活，造成细胞永生化形成肿瘤[7]。DPC4基因在多种人类肿瘤的病因及发病机制中的重要作用而备受临床研究的重视[8]。 近年来随着对抑癌基因DPC4基因研究深入，研究发现DPC4基因与胃癌发病过程及临床病理特征的关系密切。邵云霞等[9]研究发现胃癌组织中DPC4蛋白表达的阳性率高达75%，而20例癌周正常黏膜组织DPC4蛋白均呈强阳性表达。统计学分析示胃癌组织DPC4蛋白的表达阳性率明显低于癌周正常黏膜组织，且胃癌组织中DPC4蛋白的表达与患者的年龄和发生部位无明显的相关性，而与胃癌的临床分期、淋巴结转移、病理分级和肿物大小密切相关，DPC4蛋白的阳性表达与胃癌组织的发生发展密切相关，对化疗疗效的判断和预后评估判断具有较好的参考价值。曲洪滨等[10]研究发现正常大肠组织DPC4蛋白阳性表达率高达100%，而大肠癌组织中DPC4蛋白大多表达呈（-）～（ ），统计分析示大肠癌组织DPC4 蛋白表达程度明显低于正常大肠组织。表明DPC4蛋白的表达与大肠癌发生和发展关系密切，有望成为大肠癌基因诊断和治疗的生物学标记物。本研究结果显示胃癌组织中DPC4表达的阳性率明显低于癌旁正常组织，提示DPC4基因与胃癌细胞的异常增殖和恶性转化密切相关，参与胃癌的发生、发展、浸润和转移的过程。同时研究还发现胃癌组织中DPC4表达与性别和年龄无明显的统计学关系。肿瘤直径<2 cm胃癌DPC4阳性率明显高于肿瘤直径≥2 cm，高-中分化胃癌DPC4阳性率明显高于低-未分化，T1-2期胃癌DPC4阳性率明显高于T3-4期，无淋巴结转移胃癌DPC4阳性率明显高于有淋巴结转移，均具有明显的统计学差异。提示胃癌中DPC4表达与癌组织的分化程度呈负正相关，与胃癌的浸润深度和淋巴转移呈负相关，推测DPC4表达减少或缺失可进一步参与胃癌的恶性演进过程，且胃癌恶性程度和预后密切相关。我们推测DPC4表达减少或缺失，使DPC4基因对TGFβ基因的抑制功能下降，同时增加其抗凋亡功能使细胞永生化形成肿瘤，并可使 DPC4蛋白结合的DNA活性明显下降或丧失，引起TGFβ通路基因转录发生失活，造成细胞永生化形成肿瘤[11，12]。
总之，DPC4基因参与胃癌的发生、发展、浸润和转移过程，其表达程度与胃癌的分化程度、浸润深度和淋巴结转移等临床病理特征密切相关，与胃癌细胞的异常增殖和恶性转化密切相关。
[参考文献]
[1] 李国庆，丰义宽，周海波，等. 食管癌、胃癌和结直肠癌DPC4基因的失活与突变[J]. 中华消化杂志，2002，22（4）：253-254.
[2] 谢忠士，谭岩，宋燕. DPC4基因转染对结肠癌SW480细胞的影响[J]. 中国实验诊断学，2012，16（8）：1358-1360.
[3] 陕光，唐甜. 抑癌基因DPC4和TGF-β1在膀胱尿路上皮癌中的表达和意义[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志，2011，20（5）：491-495.
[4] 崔巍，王立辉，王贺，等. 胃癌细胞中DPC4基因失活与启动子区的突变[J]. 肿瘤防治研究， 2009，36（3）：199-202.
[5] Yam am ot o E，Ito T，Abe A，et al. Ikar os is expressed in human extravillous trophoblasts and involved in their migration and invasion[J]. Mol Hum Reprod，2005，11（11）：825-831.
[6] Schutte M，H ruban RH，Hedrick L，et al. DPC4 gene in various tumor types[J]. Cancer Res，1996，56（11）：2527-2530.
[7] Malmot CN，Mild G，Reuter J，et al. Infrequent mutation of the tumor-suppressor gene SMAD4 in early-stage colorect al cancer[J]. Br J Cancer，2003，88（3）：420-423.
[8] Olitaki N，Yamaguchi A，Goi T，et al. Spmat calterations of the DPC4 and Mad2 genes in colorectal cancers and rel ationship to metastasis[J]. Int J Oncogene，2002，18（2）：265-270.
[9] 邵云霞，曲延刚，朱文娣. 抑癌基因 DPC4在胃癌蛋白的表达及临床意义[J]. 河北医学，2006，12（2）：111-113.
[10] 曲洪滨，付晓光，高志安，等. 大肠癌组织中抑癌基因DPC4和PTEN蛋白表达意义的研究[J]. 锦州医学院学报，2006，27（1）： 1-4.
[11] 张东伟，杨维良，孙东升. 抑癌基因DPC4在大肠癌组织中的表达及其临床意义[J]. 中华实验外科杂志，2004，21（5）：617-619.
[12] Maitra A，Molberg K，Albores-Saavedra J，et al. Loss of DPC4 expression in colonic aden carcinomas correlates with the presence of metstatic disease[J]. Am J Pathology，2000，157（4）：1105-1108.
（收稿日期：2013-02-20）