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【摘要】 目的 探讨术中自体血液回收是否增加回收血中激活血小板、黏附白细胞的含量及是否有并发症发生。方法 30例骨科患者,40～65岁,ASAⅠ～Ⅲ级预计术中失血量800～1000 ml,利用流式细胞仪对回收血和体内血中血小板表面的α颗粒膜蛋白140(GMP-140、P-选择素)进行检测,比较两者的血小板激活程度、激活的血小板表面黏附的白细胞含量。术中观察患者的血压,术野的出血情况有无异常,有无血红蛋白尿发生。术后随访患者有无相关的并发症发生。结果 回收血中激活血小板的含量,与血小板相黏附的白细胞量,均明显高于体内血;术中和术后患者均未出现低血压,弥散性出血,呼吸功能不全的表现。结论 血液回收的过程可激活血小板和白细胞,且洗涤过程并不能去除所有的血小板和白细胞,但术中、术后未发现自体血回收相关并发症。
【关键词】 自体血液回收;血小板;白细胞
中山大学第二附属医院麻醉科(李艳萍 魏菁)
术中出血不可避免,异体输血有许多并发症且受到血源的限制,自体血不必做血型交叉配血实验而省时,为抢救失血性休克患者赢得宝贵时间起到积极作用,同时可部分解决临床血源供给不足的问题,还可避免同种免疫及接触传染病病原体的危险。但随着血液回收技术的广泛应用,出现了一系列可能与回收血中的血小板激活有关的并发症。本研究探讨术中自体血液回收是否增加回收血中激活血小板、黏附白细胞的含量及是否有并发症发生,为自体血回收的临床应用提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 病例选择 选择2007年8月至2009年12月我院骨科患者30例,其中男21例,女9例:平均年龄52岁。26例行椎管减压+USS内固定+椎体融合手术,3例行全髋置换手术,1例行全髋返修手术。平均体重59 kg。ASAⅡ~Ⅲ级,无血液系统疾病,无冠心病,无脑血管病病史,非恶性肿瘤,术中血液无污染,估计出血量在800~1000 ml。
1.2 主要仪器及试剂 北京京精自体3000 P型血液回收机、美国B-D公司Facscalibur型流式细胞仪、美国pharmingen公司产抗人CD41aFITC 、 CD62pPE 、 CD45perp抗体 、鼠抗人IgG1抗体。
1.3 研究方法
1.3.1 麻醉方法 入选患者均采用气管内全麻。诱导:咪唑安定0.05 mg/kg, 舒芬太尼0.4μg/kg, 异丙酚1~1.5 mg/kg,阿曲库铵0.6 mg/kg。插管后行右侧颈内静脉穿刺置管。麻醉维持:气管内吸入异氟醚(维持在1.0 MAC),静脉泵注瑞芬太尼200~400 μg/h,静脉泵注异丙酚150~250 mg/h,间断推注阿曲库铵0.03 mg/kg。
1.3.2 术前备好血液回收机,调节吸引器使吸力在80~120 mm Hg之间,最大不超过150 mm Hg以免血液细胞的破坏,并用肝素盐水约80 ml(肝素12 500 U加入生理盐水500 ml)预冲双腔管和滤过器。当储血罐内回收血达800 ml时采用标准的回收模式对回收血进行处理即fill 250 ml/minwash200 ml/min(洗涤程度以排出液为无色为准,通常需生理盐水800~1000 ml完成一次洗涤)。
1.3.3 标本采集 回收后立即抽取回收血液2 ml于柠檬酸钠抗凝的试管(s试管)中,然后从中心静脉内抽血2 ml(最初5 ml血丢弃)于柠檬酸钠抗凝的试管(p试管)中,标本在15 min内送检并固定,以防时间过长,血小板的自发性激活。
1.3.4 标本处理 从s、p试管中分别取0.5 ml抗凝血加入0.5 ml 2%的多聚甲醛中轻轻摇匀(即S’试管,P’试管),然后室温下固定45 min。从每个固定液试管(即S’试管,P’试管)中取固定的抗凝血的标本两份各5 μl,其中一份加入鼠抗人的IgG1抗体各10μl作阴性对照,另一份加入美国pharmingen公司产抗人CD41aFITCCD62pPECD45perp抗体各10 μl。 轻轻摇匀标本,室温(22℃~24℃)下避光作用20 min。每个试管中加缓冲液(PBS)至0.5 ml。然后取标本液上机分析。
1.3.5 回收血回输后,观察患者的血压,术野的出血情况有无异常,有无血红蛋白尿发生。术后随访患者有无相关的并发症发生。
1.4 观察项目指标 ①分析结果以激活血小板占所数血小板总数的百分比表示,以血小板黏附的白细胞占所数白细胞数的百分比表示;
②回收血回输后,观察患者的血压,肺顺应性,术野的出血情况有无异常,及是否有尿、有无血红蛋白尿发生。术后随访患者观察有无相关的并发症。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示,本试验为配对设计,试验结果采用配对t检验。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 回收血激活血小板占所数血小板总数的百分比、血小板黏附的白细胞占所数白细胞数的百分比和体内血比较明显增多,有显著性差异(P<0.05),见表1。
2.2 自体血回输后患者血压稳定,术野无异常出血,无血红蛋白尿发生。术后随访患者未发现相关并发症发生。3 讨论
全血是一种生物混合物,其不同成分具有不同的密度,具有高密度的成分(红细胞)通常位于离心碗的最外侧,而低密度成份如血小板和白细胞则位于红细胞层的内侧,血浆则位于最内上侧。在离心的过程中位于内上侧的血浆被除去,由于血小板和白细胞溶解在血浆中,所以回收血的主要成分是红细胞,通常使用的Haemonetics型回收机回收的红细胞压积为45%-65%[1]。由于细胞层包括位于中层的血小板和白细胞,因此回收血液中也有一定量的血小板和白细胞。红细胞在回收洗涤过程中有一定的破坏及功能异常[2]。
流式细胞术(FCM)是一种自动分析细胞的高技术,可快速、大量地测定细胞的一系列重要的物理特性和生化特性。流式细胞仪检测GMP-140可检测出激活的血小板亚群,由于使用了血小板鉴别抗体,检测的仅是血小板,而不会受其他种类细胞和碎片的干扰,保证了检测的特异性。
血小板激活是指血小板在刺激物(诱导剂)作用下发生的各种改变,如变形(圆盘形改变为球形,表面伸展,形成伪足)、黏附(黏着在非血小板表面)、聚集(血小板之间的粘着)和释放(颗粒内容物释放到细胞周围环境,又称为分泌)反应。这些改变可以先后出现,或以不同组合出现,或单独出现[3]。血小板与白细胞之间的相互作用比较复杂,现已证明激活的血小板可导致白细胞的激活。如外周中性粒细胞和单核细胞与血小板共同孵育,可产生超氧阴离子(O-2),当用凝血酶激活血小板时,O-2产生可增加2~5倍。另一方面血栓中产生的凝血酶、血小板活化因子(PAF)等多种因子也能激活中性粒细胞。激活的中性粒细胞又可上调其他增加黏附事件的黏附分子,并通过上述O-2生成增多和产生组织蛋白酶G和PAF等进一步激活血小板[3]。
在血液回收过程中,血小板的激活可能也是多途径的。BULL等人认为血液在回收过程中血小板和白细胞的激活是由于离心碗的机械化作用,其中血小板的作用尤其重要,因为在试验过程中从未见白细胞直接黏附在碗壁上,在离心碗和白细胞之间总存在着血小板[4]。血小板糖蛋白-140(GMP-140 P-选择素)是血小板α颗粒膜上分子量为140Kda的糖蛋白,在血小板被激活时,其可以释放至血浆,也可以与血小板开放管道系统的膜融合而整合至血小板膜表面。有试验证明作为血小板激活标记物的GMP-140以很高的浓度出现在离心碗壁上激活的血小板表面,激活血小板可以诱发DIC和ARDS已通过动物实验得到了证明[5]。GMP-140可介导激活血小板与血管内皮细胞、中性粒细胞、单核细胞相互作用[6,7]。有报道临床上患者在回输了回收血后出现凝血障碍、全身性水肿、肺顺应性下降、带状核细胞增多的临床表现 [4]。本研究术中、术后患者并未出现任何其他学者所提出的回收血并发症,可能与回收血中血小板和白细胞的含量少,从而使回收血中激活的血小板、激活的白细胞及其所释放的细胞因子绝对数少不足以引起临床症状有关。
本研究已证实自体血中激活的血小板和白细胞含量明显高于体内,如何减轻或防止自体血回收中血小板、白细胞的激活是有意义的课题。胡序凯等[8]研究认为自体血回收后患者的凝血功能、血液流变学及血小板活化标志物(CD单抗CD62P、PAC-1和CD63)变化差异无显著性。出现不同结果可能是因监测指标不同及实验条件控制不一致导致。
总之,自体血回收对倡导节约用血、减少输注异体血引发的各种并发症、减少医疗费用等方面具有积极的社会意义。自体血回收过程中由于自体血和管道的接触、吸引器的吸引力作用、洗涤、离心等机械作用,红细胞的破坏在所难免,同时血小板被激活。本研究没有发现这些并发症对患者造成危害但不容忽视,在越来越注重医疗质量的今天,如何降低自体血液回收过程对红细胞的破坏、抑制对血小板的激活仍然值得进一步研究。
参考文献
[1] Willamson KR, Taswell HF. Intraoperative blood salvage: a review. Transfusion, 1991,31(7):662-675 .
[2] 王卓强,陈绪贵,刘军.自体血液回收技术对红细胞膜ATP酶的影响.临床麻醉学杂志,2003,19:537-538.[3] 汪钟,郑植荃.现代血栓病学.北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社,1997,3.
[4] BULL BS,BULL MH. The salvaged blood syndrome: a sequel to mechanochemical activation of platelets and leukocytes?Blood Cells,1990,16:5-23.
[5] Brian S.BULL,Maureen H.BULL. Hypothesis:Dissenminated intravascular inflammation as the inflammatory counterpart to disseminated intravascular coagulation. Proc.Natl. Acad. Sci. USA,1994,91:8190-8194.
[6] Diacovo TG, Puri KD,Warnock RA, et al. Platelet-mediated lymphocyte delivery to high endothelial venules. Science,1996,273:252-255.
[7] Hamburger SA, McEver RP. GMP-140 mediates adhesion of stimulated platelets to neutrophils.Blood,1990, 75:550-554.
[8] 胡序凯,吴国容,陈骏萍,等.术中自体血回收对血小板活化的影响.现代实用医学,2007,19(11):913-914.
【关键词】 自体血液回收;血小板;白细胞
中山大学第二附属医院麻醉科(李艳萍 魏菁)
术中出血不可避免,异体输血有许多并发症且受到血源的限制,自体血不必做血型交叉配血实验而省时,为抢救失血性休克患者赢得宝贵时间起到积极作用,同时可部分解决临床血源供给不足的问题,还可避免同种免疫及接触传染病病原体的危险。但随着血液回收技术的广泛应用,出现了一系列可能与回收血中的血小板激活有关的并发症。本研究探讨术中自体血液回收是否增加回收血中激活血小板、黏附白细胞的含量及是否有并发症发生,为自体血回收的临床应用提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 病例选择 选择2007年8月至2009年12月我院骨科患者30例,其中男21例,女9例:平均年龄52岁。26例行椎管减压+USS内固定+椎体融合手术,3例行全髋置换手术,1例行全髋返修手术。平均体重59 kg。ASAⅡ~Ⅲ级,无血液系统疾病,无冠心病,无脑血管病病史,非恶性肿瘤,术中血液无污染,估计出血量在800~1000 ml。
1.2 主要仪器及试剂 北京京精自体3000 P型血液回收机、美国B-D公司Facscalibur型流式细胞仪、美国pharmingen公司产抗人CD41aFITC 、 CD62pPE 、 CD45perp抗体 、鼠抗人IgG1抗体。
1.3 研究方法
1.3.1 麻醉方法 入选患者均采用气管内全麻。诱导:咪唑安定0.05 mg/kg, 舒芬太尼0.4μg/kg, 异丙酚1~1.5 mg/kg,阿曲库铵0.6 mg/kg。插管后行右侧颈内静脉穿刺置管。麻醉维持:气管内吸入异氟醚(维持在1.0 MAC),静脉泵注瑞芬太尼200~400 μg/h,静脉泵注异丙酚150~250 mg/h,间断推注阿曲库铵0.03 mg/kg。
1.3.2 术前备好血液回收机,调节吸引器使吸力在80~120 mm Hg之间,最大不超过150 mm Hg以免血液细胞的破坏,并用肝素盐水约80 ml(肝素12 500 U加入生理盐水500 ml)预冲双腔管和滤过器。当储血罐内回收血达800 ml时采用标准的回收模式对回收血进行处理即fill 250 ml/minwash200 ml/min(洗涤程度以排出液为无色为准,通常需生理盐水800~1000 ml完成一次洗涤)。
1.3.3 标本采集 回收后立即抽取回收血液2 ml于柠檬酸钠抗凝的试管(s试管)中,然后从中心静脉内抽血2 ml(最初5 ml血丢弃)于柠檬酸钠抗凝的试管(p试管)中,标本在15 min内送检并固定,以防时间过长,血小板的自发性激活。
1.3.4 标本处理 从s、p试管中分别取0.5 ml抗凝血加入0.5 ml 2%的多聚甲醛中轻轻摇匀(即S’试管,P’试管),然后室温下固定45 min。从每个固定液试管(即S’试管,P’试管)中取固定的抗凝血的标本两份各5 μl,其中一份加入鼠抗人的IgG1抗体各10μl作阴性对照,另一份加入美国pharmingen公司产抗人CD41aFITCCD62pPECD45perp抗体各10 μl。 轻轻摇匀标本,室温(22℃~24℃)下避光作用20 min。每个试管中加缓冲液(PBS)至0.5 ml。然后取标本液上机分析。
1.3.5 回收血回输后,观察患者的血压,术野的出血情况有无异常,有无血红蛋白尿发生。术后随访患者有无相关的并发症发生。
1.4 观察项目指标 ①分析结果以激活血小板占所数血小板总数的百分比表示,以血小板黏附的白细胞占所数白细胞数的百分比表示;
②回收血回输后,观察患者的血压,肺顺应性,术野的出血情况有无异常,及是否有尿、有无血红蛋白尿发生。术后随访患者观察有无相关的并发症。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示,本试验为配对设计,试验结果采用配对t检验。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 回收血激活血小板占所数血小板总数的百分比、血小板黏附的白细胞占所数白细胞数的百分比和体内血比较明显增多,有显著性差异(P<0.05),见表1。
2.2 自体血回输后患者血压稳定,术野无异常出血,无血红蛋白尿发生。术后随访患者未发现相关并发症发生。3 讨论
全血是一种生物混合物,其不同成分具有不同的密度,具有高密度的成分(红细胞)通常位于离心碗的最外侧,而低密度成份如血小板和白细胞则位于红细胞层的内侧,血浆则位于最内上侧。在离心的过程中位于内上侧的血浆被除去,由于血小板和白细胞溶解在血浆中,所以回收血的主要成分是红细胞,通常使用的Haemonetics型回收机回收的红细胞压积为45%-65%[1]。由于细胞层包括位于中层的血小板和白细胞,因此回收血液中也有一定量的血小板和白细胞。红细胞在回收洗涤过程中有一定的破坏及功能异常[2]。
流式细胞术(FCM)是一种自动分析细胞的高技术,可快速、大量地测定细胞的一系列重要的物理特性和生化特性。流式细胞仪检测GMP-140可检测出激活的血小板亚群,由于使用了血小板鉴别抗体,检测的仅是血小板,而不会受其他种类细胞和碎片的干扰,保证了检测的特异性。
血小板激活是指血小板在刺激物(诱导剂)作用下发生的各种改变,如变形(圆盘形改变为球形,表面伸展,形成伪足)、黏附(黏着在非血小板表面)、聚集(血小板之间的粘着)和释放(颗粒内容物释放到细胞周围环境,又称为分泌)反应。这些改变可以先后出现,或以不同组合出现,或单独出现[3]。血小板与白细胞之间的相互作用比较复杂,现已证明激活的血小板可导致白细胞的激活。如外周中性粒细胞和单核细胞与血小板共同孵育,可产生超氧阴离子(O-2),当用凝血酶激活血小板时,O-2产生可增加2~5倍。另一方面血栓中产生的凝血酶、血小板活化因子(PAF)等多种因子也能激活中性粒细胞。激活的中性粒细胞又可上调其他增加黏附事件的黏附分子,并通过上述O-2生成增多和产生组织蛋白酶G和PAF等进一步激活血小板[3]。
在血液回收过程中,血小板的激活可能也是多途径的。BULL等人认为血液在回收过程中血小板和白细胞的激活是由于离心碗的机械化作用,其中血小板的作用尤其重要,因为在试验过程中从未见白细胞直接黏附在碗壁上,在离心碗和白细胞之间总存在着血小板[4]。血小板糖蛋白-140(GMP-140 P-选择素)是血小板α颗粒膜上分子量为140Kda的糖蛋白,在血小板被激活时,其可以释放至血浆,也可以与血小板开放管道系统的膜融合而整合至血小板膜表面。有试验证明作为血小板激活标记物的GMP-140以很高的浓度出现在离心碗壁上激活的血小板表面,激活血小板可以诱发DIC和ARDS已通过动物实验得到了证明[5]。GMP-140可介导激活血小板与血管内皮细胞、中性粒细胞、单核细胞相互作用[6,7]。有报道临床上患者在回输了回收血后出现凝血障碍、全身性水肿、肺顺应性下降、带状核细胞增多的临床表现 [4]。本研究术中、术后患者并未出现任何其他学者所提出的回收血并发症,可能与回收血中血小板和白细胞的含量少,从而使回收血中激活的血小板、激活的白细胞及其所释放的细胞因子绝对数少不足以引起临床症状有关。
本研究已证实自体血中激活的血小板和白细胞含量明显高于体内,如何减轻或防止自体血回收中血小板、白细胞的激活是有意义的课题。胡序凯等[8]研究认为自体血回收后患者的凝血功能、血液流变学及血小板活化标志物(CD单抗CD62P、PAC-1和CD63)变化差异无显著性。出现不同结果可能是因监测指标不同及实验条件控制不一致导致。
总之,自体血回收对倡导节约用血、减少输注异体血引发的各种并发症、减少医疗费用等方面具有积极的社会意义。自体血回收过程中由于自体血和管道的接触、吸引器的吸引力作用、洗涤、离心等机械作用,红细胞的破坏在所难免,同时血小板被激活。本研究没有发现这些并发症对患者造成危害但不容忽视,在越来越注重医疗质量的今天,如何降低自体血液回收过程对红细胞的破坏、抑制对血小板的激活仍然值得进一步研究。
参考文献
[1] Willamson KR, Taswell HF. Intraoperative blood salvage: a review. Transfusion, 1991,31(7):662-675 .
[2] 王卓强,陈绪贵,刘军.自体血液回收技术对红细胞膜ATP酶的影响.临床麻醉学杂志,2003,19:537-538.[3] 汪钟,郑植荃.现代血栓病学.北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社,1997,3.
[4] BULL BS,BULL MH. The salvaged blood syndrome: a sequel to mechanochemical activation of platelets and leukocytes?Blood Cells,1990,16:5-23.
[5] Brian S.BULL,Maureen H.BULL. Hypothesis:Dissenminated intravascular inflammation as the inflammatory counterpart to disseminated intravascular coagulation. Proc.Natl. Acad. Sci. USA,1994,91:8190-8194.
[6] Diacovo TG, Puri KD,Warnock RA, et al. Platelet-mediated lymphocyte delivery to high endothelial venules. Science,1996,273:252-255.
[7] Hamburger SA, McEver RP. GMP-140 mediates adhesion of stimulated platelets to neutrophils.Blood,1990, 75:550-554.
[8] 胡序凯,吴国容,陈骏萍,等.术中自体血回收对血小板活化的影响.现代实用医学,2007,19(11):913-914.