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[摘要] 目的：研究外源性给予茶多酚（TP）和ATP对兔心肌缺血再灌注损伤模型的保护作用，以及两者联合的保护程度比较。 方法：60只家兔随机均分成5组：假手术组、缺血再灌对照组、ATP组、茶多酚组、茶多酚与ATP联合组。记录茶多酚和ATP及两者联合作用对缺血再灌注后血流动力学参数指标：左心室的收缩与舒张的最大速率（±dp/dt max）；TBA法检测血浆中丙二醛（MDA）的含量；ELISA法检测血浆超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、心肌型肌酸激酶同工酶（CK-MB）的含量；DAB法检测心肌组织基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达水平。 结果：茶多酚组、ATP组、茶多酚与ATP联合组的左心室的收缩与舒张的最大速率明显好于缺血再灌对照组，心率明显好于缺血再灌对照组；对血浆中MDA、LDH及CK-MB含量升高具有明显抑制作用；而血浆中SOD含量明显高于缺血再灌对照组；心肌组织的基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达明显降低。 结论：ATP和茶多酚能够在心肌缺血再灌注损伤时对心肌的收缩及舒张功能，恢复稳定心率，有效增加SOD含量，抑制MDA、LDH及CK-MB的增加，减少MMP-2的增加。两者联合作用好于单一给药。
关键词：ATP；茶多酚；心肌缺血；再灌注损伤；MMP-2
1 引言
心肌缺血引发的疾病严重影响人们的健康和生活质量，尽早恢复灌注很有必要，但灌注的同时也会带来再灌注损伤。这种血液再灌注使缺血性心肌损伤进一步加重的现象称为：心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）。MIRI贯穿于众多心血管疾病的发生[1，2，3]。ATP作为能量合剂，直接参与组织细胞的生理代谢活动，为细胞供能。通过外源性给予ATP可以直接为缺血的心肌组织直接供能，缓解心肌细胞的能量缺乏，减少因无氧氧化致氧自由基增多，增强缺血心肌收缩力，缓解心肌缺血[4]。茶多酚（tea polyphenol）又称茶鞣质，是茶叶中多酚类物质的总称，也是茶叶中有药理和保健功能的主要成分之一。研究发现茶多酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗高血脂等药理和保健作用。本研究通过通过家兔缺血再灌注模型，观察ATP、茶多酚及联合作用对心肌缺血再灌注的保护作用做进一步的探讨。
2 材料与方法
2.1 实验动物
清洁级实验家兔60只，雌雄等只，体重2.0～2.5 kg，由泰山医学院动物室提供。
2.2 药物与试剂
ATP溶液、茶多酚、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、心肌型肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒购自合肥兰旭生物技术有限公司；基质金属蛋白酶-2（MMP-2）抗体及免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物公司。
2.3 方法
2.3.1 家兔心肌缺血再灌注模型的建立
家兔称重后，注射20%质量浓度的乌拉坦（5 mL·kg-1）进行全身麻醉，行气管插管，接入兔呼吸机（40～45 次·min-1，潮气量10 mg·kg-1）。连接BL420生物机能实验系统监测心电。分离左颈总动脉，行动脉插管；行颈外静脉插管，与输液泵相连。开胸，剪开心包，即可暴露心脏，用5-0号无创缝合针穿过左冠状动脉前降支下方的心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针，结扎备用。待呼吸，血压平稳15 min后，用一细小带凹槽乳胶管垫于血管与结扎线之间。结扎成功标准：结扎线远端心肌颜色发绀，心电图表现为QRS波群增高增宽，ST段抬高，出现梗死性Q波。再灌注成功标准：缺血部心肌颜色恢复，抬高的ST段下降50%以下。
2.3.2 实验分组
60只家兔随机均分成5组，每组12只。（1）假手术组：不结扎冠状动脉前降支，计时第25 min静泵20 ml·kg -1生理盐水，定时30 min，后耳缘静泵2 mL·kg-1 生理盐水，定时2 min。（2）缺血再灌对照组：结扎冠状动脉前降支30 min，再灌注60 min，仅在灌注前5 min静泵20 mL·kg-1 生理盐水，定时30 min，后静泵2 mL·kg-1 生理盐水， 定时2 min；（3）ATP组：方法同缺血再灌对照组，仅于灌注前5 min静泵20 mL·kg-1 ATP溶液， 定时30 min，后静泵2 mL·kg-1 生理盐水， 定时2 min；（4）茶多酚组： 方法同缺血再灌对照组，仅于灌注开始前5 min静泵2 mL·kg-1 茶多酚溶液， 定时2 min，后静泵20 mL·kg-1 生理盐水， 定时30 min；（5）联合组： 方法同缺血再灌对照组，仅于灌注开始前5 min开始静泵质量浓度为20 mL·kg-1 ATP溶液， 定时30 min，后静泵2 mL·kg-1 茶多酚溶液，定时2 min。
2.3.3 血流动力学参数测定
心跳稳定后，记录心率（HR）、左心室内压的收缩与舒张的最大速率（±dp/dt max），在缺血前、缺血第20 min、再灌注第10 min、再灌注第30 min、再灌注第60 min分别测量，以停灌前工作心基础水平为100% 。
2.3.4 SOD的测定
在缺血前、缺血第20 min、再灌注第10 min、再灌注第30 min、再灌注第60 min分别于右侧颈总动脉取血5 mL，置于离心机中，3000 r·min-1，15 min取血清。采用SOD试剂盒测定，记录。计算SOD活力增加率（%）=（SOD给药组-SOD MIRI对照组）/SOD MIRI对照组×100 % 。
2.3.5 MDA、LDH的测定
在缺血前、缺血第20 min、再灌注第10 min、再灌注第30 min、再灌注第60 min分别于右侧颈总动脉取血5 mL，置于离心机中，3000 r·min-1，15 min取血清。分别采用MDA、LDH试剂盒测定，记录。计算MDA含量抑制率=（MDA含量MIRI对照组-MDA含量给药组）/（MDA含量MIRI对照组-MDA含量假手术对照组）×100% 。 2.3.6 CK-MB的测定
在缺血前、缺血第20 min、再灌注第10 min、再灌注第30 min、再灌注第60 min，分别于右侧颈总动脉取血5 mL，置于离心机中，3000 r·min-1，15 min取血清。分别采用CK-MB、LDH试剂盒测定，记录。
2.3.7 MMP-2蛋白表达水平测定测定
取待测心肌组织切片使用MMP-2抗体及免疫组织化学试剂盒。观察MMP-2的表达，镜下显示紧密排列的染色成棕黄色的小颗粒（MMP-2与其一抗特异表达后的产物），即为阳性。每张切片随机选取2个高倍视野，采用计算机医学图像分析仪处理，测定MMP-2蛋白阳性光密度值。
2.4 统计学处理
实验数据以均数±标准差（ ±s ）表示，运用SPSS 13.0统计软件，采用配对t检验，重复测量数据的方差分析，单因素方差分析及组间两两比较的SNK-q 检验等统计学方法对数据进行分析。选取α=0.05作为检验水准，P<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 血流动力学参数测定
茶多酚组、ATP组、联合组的左心室的收缩与舒张的最大速率明显好于缺血再灌注照组（P<0.05）；茶多酚组、ATP组、联合组心率明显好于缺血再灌注对照组（P<0.05），联合组在再灌第10 min时的心率明显好于ATP组和茶多酚组（P<0.05）。3.2 SOD的测定
茶多酚组、ATP组、联合组SOD含量明显高于缺血再灌对照组（P<0.05）；联合组有更好的保护作用。
3.3 MDA、LDH的测定
茶多酚组、ATP组、联合组的MDA含量明显低于缺血再灌对照组（P<0.05）；茶多酚组、ATP组、联合组的LDH含量明显高于缺血再灌对照组（P<0.05）。较茶多酚组、ATP组，联合组有更好的保护作用。
3.4 心肌损伤指标检测
茶多酚组、ATP组、联合组CK-MB含量明显低于缺血再灌注对照处理组（P<0.05）。
3.5 心肌MMP-2蛋白的表达
茶多酚组、ATP处理组、联合组MMP-2表达明显低于缺血再灌注对照处理组（P<.05）。较茶多酚处理组、ATP处理组，茶多酚和ATP联合作用处理组对心肌缺血再灌注损伤有更好的保护作用。
4 讨论
在本研究中可以看出，在再灌后给予ATP，具有心肌保护作用，且在再灌注的前几分钟作为干预的时间很重要。在再灌第10 min中后已经出现很明显的的差异（P<0.05）。外源性给予ATP能够减轻再灌注损伤，这种保护作用在一定程度上是由于抑制氧化物的生成及氧化物介导的组织细胞损伤，同时产生了增加SOD的心肌保护效应，减少脂质过氧化物MDA的产生及降低CK-MB和LDH的生成释放。ATP在体内代谢产物为ADP，AMP至最终产物腺苷。由此可以推断ATP产生保护作用即是为心肌组织细胞供能，又与腺苷激活腺苷受体有关[4]。
茶多酚是儿茶素类、黄酮及黄酮醇类等物质复合物的总称。在心肌缺血在灌注前，由于局部心肌长时间缺血，产生了过多的活性氧自由基（ROS）。外源性给予茶多酚能够减轻再灌注损伤，这种保护作用在一定程度上通过清除由于缺血及再灌注阶段产生的活性氧自由基，以减轻其对心肌组织细胞的细胞毒性损伤。抑制氧化物的生成及氧化物介导的组织细胞损伤，同时产生了增加超氧化物歧化酶的心肌保护效应，减少脂质过氧化物MDA的产生及降低CK-MB和LDH的生成释放[5]。
基质金属蛋白酶（MMP）家族是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶。MMP活性改变对心肌缺血再灌损伤的存在影响。在心肌缺血再灌注损伤时，可以促进MMP-2的释放和活化。外源性给予ATP及茶多酚溶液可以减轻缺血再灌注对心肌的损伤，从而抑制MMP-2的释放[6]。可以通过检测MMP-2的表达来观察MIRI对心肌损伤程度。
5 结论
5.1 ATP和茶多酚能够保护因缺血再灌注而受损心肌的收缩及舒张功能，恢复稳定心率。两者联合作用好于单一给药。
5.2 外源性给予ATP及茶多酚能够有效增加因缺血再灌注的SOD活性，抑制MDA及LDH的增加。两者联合作用效果更明显。
5.3 ATP、茶多酚能够因其各自的保护作用使CK-MB值降低。两者联合有更好效果。
5.4 ATP和茶多酚能够通过减轻缺血再灌注损伤来减少MMP-2的增加。
参考文献（References）
[1] Biolo A， Fisch M， Balog J， etal. Episodes of actue heart failure syndrome are associated with increased levels of roponin and extracellular matrixmarks[J]. Circ Heart Fai，2010，3（1）：44-50.
[2] Zampini R， Arga?araz M， Miceli D， etal. Detection of the Matrix Metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2 in Llama （Lama glama） Oviduct[J]. Reprod Domest Anim，2014，4（19）：492-498.
[3] Liu M， Sun Q， Wang Q， etal. Effect of trapidil in myocardial schemia-reperfusion injury in rabbit[J]. Indian J Pharmacol，2014，3（46）：207-210.
[4] 刘方，廉哲勋，王永彬，等.缺血后处理ATP后处理减轻兔缺血再灌注损伤与腺苷受体激活有关[J].现代生物医学进展，2007，7（3）：353-355.
[5] 刘峰杰，成尚霖，马捷，等.茶多酚对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用[J].中国医疗前言，2012，5（7）：10-11.
[6] 贾俊海，周留正，陈素仙，等。RhoA-MMP-2信号通路在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注中的作用[J].中国现代医学杂志，2011，6（21）：2106-2110.
徐哲，1992年9月25日、男、学生、研究方向：心脑血管疾病
关键词：ATP；茶多酚；心肌缺血；再灌注损伤；MMP-2
1 引言
心肌缺血引发的疾病严重影响人们的健康和生活质量，尽早恢复灌注很有必要，但灌注的同时也会带来再灌注损伤。这种血液再灌注使缺血性心肌损伤进一步加重的现象称为：心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）。MIRI贯穿于众多心血管疾病的发生[1，2，3]。ATP作为能量合剂，直接参与组织细胞的生理代谢活动，为细胞供能。通过外源性给予ATP可以直接为缺血的心肌组织直接供能，缓解心肌细胞的能量缺乏，减少因无氧氧化致氧自由基增多，增强缺血心肌收缩力，缓解心肌缺血[4]。茶多酚（tea polyphenol）又称茶鞣质，是茶叶中多酚类物质的总称，也是茶叶中有药理和保健功能的主要成分之一。研究发现茶多酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗高血脂等药理和保健作用。本研究通过通过家兔缺血再灌注模型，观察ATP、茶多酚及联合作用对心肌缺血再灌注的保护作用做进一步的探讨。
2 材料与方法
2.1 实验动物
清洁级实验家兔60只，雌雄等只，体重2.0～2.5 kg，由泰山医学院动物室提供。
2.2 药物与试剂
ATP溶液、茶多酚、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、心肌型肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒购自合肥兰旭生物技术有限公司；基质金属蛋白酶-2（MMP-2）抗体及免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物公司。
2.3 方法
2.3.1 家兔心肌缺血再灌注模型的建立
家兔称重后，注射20%质量浓度的乌拉坦（5 mL·kg-1）进行全身麻醉，行气管插管，接入兔呼吸机（40～45 次·min-1，潮气量10 mg·kg-1）。连接BL420生物机能实验系统监测心电。分离左颈总动脉，行动脉插管；行颈外静脉插管，与输液泵相连。开胸，剪开心包，即可暴露心脏，用5-0号无创缝合针穿过左冠状动脉前降支下方的心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针，结扎备用。待呼吸，血压平稳15 min后，用一细小带凹槽乳胶管垫于血管与结扎线之间。结扎成功标准：结扎线远端心肌颜色发绀，心电图表现为QRS波群增高增宽，ST段抬高，出现梗死性Q波。再灌注成功标准：缺血部心肌颜色恢复，抬高的ST段下降50%以下。
2.3.2 实验分组
60只家兔随机均分成5组，每组12只。（1）假手术组：不结扎冠状动脉前降支，计时第25 min静泵20 ml·kg -1生理盐水，定时30 min，后耳缘静泵2 mL·kg-1 生理盐水，定时2 min。（2）缺血再灌对照组：结扎冠状动脉前降支30 min，再灌注60 min，仅在灌注前5 min静泵20 mL·kg-1 生理盐水，定时30 min，后静泵2 mL·kg-1 生理盐水， 定时2 min；（3）ATP组：方法同缺血再灌对照组，仅于灌注前5 min静泵20 mL·kg-1 ATP溶液， 定时30 min，后静泵2 mL·kg-1 生理盐水， 定时2 min；（4）茶多酚组： 方法同缺血再灌对照组，仅于灌注开始前5 min静泵2 mL·kg-1 茶多酚溶液， 定时2 min，后静泵20 mL·kg-1 生理盐水， 定时30 min；（5）联合组： 方法同缺血再灌对照组，仅于灌注开始前5 min开始静泵质量浓度为20 mL·kg-1 ATP溶液， 定时30 min，后静泵2 mL·kg-1 茶多酚溶液，定时2 min。
2.3.3 血流动力学参数测定
心跳稳定后，记录心率（HR）、左心室内压的收缩与舒张的最大速率（±dp/dt max），在缺血前、缺血第20 min、再灌注第10 min、再灌注第30 min、再灌注第60 min分别测量，以停灌前工作心基础水平为100% 。
2.3.4 SOD的测定
在缺血前、缺血第20 min、再灌注第10 min、再灌注第30 min、再灌注第60 min分别于右侧颈总动脉取血5 mL，置于离心机中，3000 r·min-1，15 min取血清。采用SOD试剂盒测定，记录。计算SOD活力增加率（%）=（SOD给药组-SOD MIRI对照组）/SOD MIRI对照组×100 % 。
2.3.5 MDA、LDH的测定
在缺血前、缺血第20 min、再灌注第10 min、再灌注第30 min、再灌注第60 min分别于右侧颈总动脉取血5 mL，置于离心机中，3000 r·min-1，15 min取血清。分别采用MDA、LDH试剂盒测定，记录。计算MDA含量抑制率=（MDA含量MIRI对照组-MDA含量给药组）/（MDA含量MIRI对照组-MDA含量假手术对照组）×100% 。 2.3.6 CK-MB的测定
在缺血前、缺血第20 min、再灌注第10 min、再灌注第30 min、再灌注第60 min，分别于右侧颈总动脉取血5 mL，置于离心机中，3000 r·min-1，15 min取血清。分别采用CK-MB、LDH试剂盒测定，记录。
2.3.7 MMP-2蛋白表达水平测定测定
取待测心肌组织切片使用MMP-2抗体及免疫组织化学试剂盒。观察MMP-2的表达，镜下显示紧密排列的染色成棕黄色的小颗粒（MMP-2与其一抗特异表达后的产物），即为阳性。每张切片随机选取2个高倍视野，采用计算机医学图像分析仪处理，测定MMP-2蛋白阳性光密度值。
2.4 统计学处理
实验数据以均数±标准差（ ±s ）表示，运用SPSS 13.0统计软件，采用配对t检验，重复测量数据的方差分析，单因素方差分析及组间两两比较的SNK-q 检验等统计学方法对数据进行分析。选取α=0.05作为检验水准，P<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 血流动力学参数测定
茶多酚组、ATP组、联合组的左心室的收缩与舒张的最大速率明显好于缺血再灌注照组（P<0.05）；茶多酚组、ATP组、联合组心率明显好于缺血再灌注对照组（P<0.05），联合组在再灌第10 min时的心率明显好于ATP组和茶多酚组（P<0.05）。3.2 SOD的测定
茶多酚组、ATP组、联合组SOD含量明显高于缺血再灌对照组（P<0.05）；联合组有更好的保护作用。
3.3 MDA、LDH的测定
茶多酚组、ATP组、联合组的MDA含量明显低于缺血再灌对照组（P<0.05）；茶多酚组、ATP组、联合组的LDH含量明显高于缺血再灌对照组（P<0.05）。较茶多酚组、ATP组，联合组有更好的保护作用。
3.4 心肌损伤指标检测
茶多酚组、ATP组、联合组CK-MB含量明显低于缺血再灌注对照处理组（P<0.05）。
3.5 心肌MMP-2蛋白的表达
茶多酚组、ATP处理组、联合组MMP-2表达明显低于缺血再灌注对照处理组（P<.05）。较茶多酚处理组、ATP处理组，茶多酚和ATP联合作用处理组对心肌缺血再灌注损伤有更好的保护作用。
4 讨论
在本研究中可以看出，在再灌后给予ATP，具有心肌保护作用，且在再灌注的前几分钟作为干预的时间很重要。在再灌第10 min中后已经出现很明显的的差异（P<0.05）。外源性给予ATP能够减轻再灌注损伤，这种保护作用在一定程度上是由于抑制氧化物的生成及氧化物介导的组织细胞损伤，同时产生了增加SOD的心肌保护效应，减少脂质过氧化物MDA的产生及降低CK-MB和LDH的生成释放。ATP在体内代谢产物为ADP，AMP至最终产物腺苷。由此可以推断ATP产生保护作用即是为心肌组织细胞供能，又与腺苷激活腺苷受体有关[4]。
茶多酚是儿茶素类、黄酮及黄酮醇类等物质复合物的总称。在心肌缺血在灌注前，由于局部心肌长时间缺血，产生了过多的活性氧自由基（ROS）。外源性给予茶多酚能够减轻再灌注损伤，这种保护作用在一定程度上通过清除由于缺血及再灌注阶段产生的活性氧自由基，以减轻其对心肌组织细胞的细胞毒性损伤。抑制氧化物的生成及氧化物介导的组织细胞损伤，同时产生了增加超氧化物歧化酶的心肌保护效应，减少脂质过氧化物MDA的产生及降低CK-MB和LDH的生成释放[5]。
基质金属蛋白酶（MMP）家族是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶。MMP活性改变对心肌缺血再灌损伤的存在影响。在心肌缺血再灌注损伤时，可以促进MMP-2的释放和活化。外源性给予ATP及茶多酚溶液可以减轻缺血再灌注对心肌的损伤，从而抑制MMP-2的释放[6]。可以通过检测MMP-2的表达来观察MIRI对心肌损伤程度。
5 结论
5.1 ATP和茶多酚能够保护因缺血再灌注而受损心肌的收缩及舒张功能，恢复稳定心率。两者联合作用好于单一给药。
5.2 外源性给予ATP及茶多酚能够有效增加因缺血再灌注的SOD活性，抑制MDA及LDH的增加。两者联合作用效果更明显。
5.3 ATP、茶多酚能够因其各自的保护作用使CK-MB值降低。两者联合有更好效果。
5.4 ATP和茶多酚能够通过减轻缺血再灌注损伤来减少MMP-2的增加。
参考文献（References）
[1] Biolo A， Fisch M， Balog J， etal. Episodes of actue heart failure syndrome are associated with increased levels of roponin and extracellular matrixmarks[J]. Circ Heart Fai，2010，3（1）：44-50.
[2] Zampini R， Arga?araz M， Miceli D， etal. Detection of the Matrix Metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2 in Llama （Lama glama） Oviduct[J]. Reprod Domest Anim，2014，4（19）：492-498.
[3] Liu M， Sun Q， Wang Q， etal. Effect of trapidil in myocardial schemia-reperfusion injury in rabbit[J]. Indian J Pharmacol，2014，3（46）：207-210.
[4] 刘方，廉哲勋，王永彬，等.缺血后处理ATP后处理减轻兔缺血再灌注损伤与腺苷受体激活有关[J].现代生物医学进展，2007，7（3）：353-355.
[5] 刘峰杰，成尚霖，马捷，等.茶多酚对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用[J].中国医疗前言，2012，5（7）：10-11.
[6] 贾俊海，周留正，陈素仙，等。RhoA-MMP-2信号通路在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注中的作用[J].中国现代医学杂志，2011，6（21）：2106-2110.
徐哲，1992年9月25日、男、学生、研究方向：心脑血管疾病