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摘 要 以冷榨澳洲坚果粕为原料，通过碱提酸沉得到澳洲坚果蛋白，采用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽。以水解度为指标，利用单因素试验与正交试验考察各因素对澳洲坚果蛋白水解度的影响，同时采用ABTS自由基清除能力来评价制备的澳洲坚果蛋白肽的抗氧化活性。结果表明：各因素对澳洲坚果蛋白水解度影响次序为：酶解时间>加酶量>酶解温度>酶解液pH值，其最佳酶解条件为：酶解时间4.0 h、酶解液pH值9.0、加酶量200 mg/mL、酶解温度60 ℃，在此条件下澳洲坚果蛋白的水解度为64.01 %，其清除ABTS自由基的能力达96.58 %，说明木瓜蛋白酶制备的澳洲坚果蛋白肽具有较强的抗氧化活性。
关键词 澳洲坚果 ；蛋白肽 ；抗氧化活性
中图分类号 F307.5
Abstract With macadamia pulp as raw material， the protein of macadamia nut through alkali extraction and acid precipitation， study on the technology of macadamia nut peptide prepared by papain. The effects of four processing conditions on the degree of hydrolysis were explored by single factor and orthogonal array design methods in order to optimize these conditions. Meanwhile，the antioxidant activity of macadamia nut peptide was evaluated by ABTS scavenging activity. Results showed that the order of the factors was as follows：hydrolysis duration>enzyme dosage>hydrolysis temperature>pH，the optimized macadamia nut peptide hydrolysis parameters was：hydrolysis at 60 ℃ for 4.0 h with enzyme dosage 200 mg/mL， hydrolysis buffer pH 9.0. The hydrolysis degree of macadamia nut protein was 64.01%，with 96.58% of the ABTS scavenging activity，it had strong antioxidant activity.
Key words macadamia nut ；peptides ；antioxidant activity
澳洲坚果（Macadamia ternifolia F. Muell.）别名澳洲核桃、夏威夷果等，属山龙眼科澳洲坚果属多年生常绿乔木[1-3]。澳洲坚果营养丰富，不含胆固醇，果仁含油量高（脂肪含量高达78 %以上），酥脆可口，是世界上品质上乘的可食木本坚果[4-5]，于20世纪60-70年代开始引入中国[3]，目前在中国广东、广西、云南及贵州等地均有种植[6]。随着澳洲坚果果树的大量栽种，资源越来越丰富，澳洲坚果产业已具备一定规模，但目前澳洲坚果的深加工产业发展比较滞后，主要用于榨油，榨油后会产生大量的澳洲坚果饼粕，其蛋白质含量较高（32.25 %），且含有17种氨基酸，总含量为25.05 %[7]。目前，澳洲坚果粕主要用于饲料加工，造成极大的浪费，因此，为了提高澳洲坚果粕蛋白的附加值，通过生物酶法技术制备蛋白肽是最有效的途径之一。
蛋白肽是由二个或二个以上氨基酸通过肽键连接而形成的化合物，因其组成和排列不同而形成了种类不同的蛋白肽，它是源于蛋白质的多功能化合物[8]。蛋白肽除具有易被消化吸收的特性外，还具有抗氧化、降血压、免疫调节等多种生理功能[9-10]。生物酶法技术制备蛋白肽与化学方法相比，具有产品安全性和营养价值高、反应条件温和等特点[11-12]。目前，已有少数学者利用碱性蛋白和中性蛋白酶来制备澳洲坚果蛋白肽[1，7]，但采用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白来制备蛋白肽还未见报道。
本试验以澳洲坚果粕为原料，通过碱提酸沉得到澳洲坚果蛋白，以水解度为指标，研究木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白的工艺优化条件，同时，采用ABTS自由基清除能力来评价澳洲坚果蛋白肽的抗氧化活性，以期为澳洲坚果粕的高值化利用提供一条途径，同时也为澳洲坚果蛋白肽的应用提供科学的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂
澳洲坚果饼粕由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所休闲加工厂提供；木瓜蛋白酶（活力≥4 000 U/mg）、丝氨酸（99.99 %）、ABTS（≥97 %）（阿拉丁化学试剂有限公司）；十水四硼酸钠、十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、氢氧化钠、盐酸、过硫酸钾、无水乙醇均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。
1.1.2 儀器与设备
AR224CN型分析天平（奥康斯仪器有限公司）；LXJ-IIB型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；BCD-539WT冰箱（青岛海尔股份有限公司）；HH-4型恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；DHG-9013A鼓风干燥箱（嘉兴市中新医疗仪器有限公司）；100-1000 μL移液枪（德国Eppendorf公司）；BSXT-06型索氏提取器（上海比朗仪器制造有限公司）；ST40高速冷冻离心机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；UV2700型紫外-可见分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司]；S210 Seven Compact pH计（梅特勒-托利多国际股份有限公司）；玻璃仪器。 1.2 方法
1.2.1 蛋白质样品的制备
采用碱提酸沉法，工艺流程为：称取100 g澳洲坚果饼粕放入滤纸包中，用沸点为30-60 ℃的石油醚进行索氏提取6 h；取出晾干，按1：50（W：V）的比例加入蒸馏水，用1.0 mol/L NaOH调pH至9.0；于45 ℃水浴磁力搅拌2 h，以4 800 r/min离心過滤10 min，将上清液pH调至4.5，于4 ℃冰箱冷藏过夜；离心，水洗3次，冷冻干燥48 h，得到澳洲坚果粗蛋白，通过测定可知，其蛋白质含量为84.6 %。
1.2.2 澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽含量的测定
澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽的含量参照Pedroche等[13]和Nielsen等[14]报道的o-邻苯二甲醛法（OPA）进行测定。
标准曲线的绘制：准确称取0.100 0 g丝氨酸标准品，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg/mL的丝氨酸标准溶液；采用逐级稀释法来配置浓度分别为400、300、200、100、50、20、10 μg/mL的丝氨酸标准使用液；取100 μL丝氨酸标准使用液，加入4.00 mL OPA试剂（称取3.81 g十水四硼酸钠、100 mg SDS、8 mg OPA、88 mg二硫苏糖醇，用蒸馏水溶解并定容至100 mL），充分混匀，在室温下放置5 min，在340 nm下测定吸光值。
澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽的测定：取澳洲坚果蛋白酶解液100 μL，按上述操作测定。对照组：澳洲坚果蛋白用强酸充分水解后[8]，用上述操作测定其蛋白肽含量。澳洲坚果蛋白水解度按下列公式计算：
式中：DH—澳洲坚果蛋白水解度，%；A—澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽含量，μg/g；B—充分水解的澳洲坚果蛋白中蛋白肽含量，μg/g。
1.2.3 澳洲坚果蛋白酶解制备蛋白肽单因素试验
（1）酶解时间对澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取3.000 g澳洲坚果蛋白，将其溶解于100 mL蒸馏水中，用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH值为8.0，加入100 mg/mL木瓜蛋白酶，在50 ℃条件下恒温酶解不同时间，测定不同酶解时间（0、10、30、60、120、240、300 min）对澳洲坚果蛋白水解度的影响。
（2）酶解温度对澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取3.000 g澳洲坚果蛋白，将其溶解到100 mL蒸馏水中，用1.0 moL/L NaOH调节溶液pH值为8.0，加入100 mg/mL木瓜蛋白酶，在不同酶解温度条件下恒温酶解120 min，测定不同酶解温度（40、45、50、55、60、65、70、80 ℃）对澳洲坚果蛋白水解度的影响。
（3）加酶量对澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取3.000 g澳洲坚果蛋白，将其溶解到100 mL蒸馏水中，用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH值为8.0，加入不等量的木瓜蛋白酶，在50 ℃酶解温度条件下恒温酶解120 min，测定不等木瓜蛋白酶添加量（10、20、50、100、150、200、300 mg/mL）对澳洲坚果蛋白水解度的影响。
（4）酶解液pH值对澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取3.000 g澳洲坚果蛋白溶解到100 mL蒸馏水中，用1.0 moL/L NaOH分别调节溶液pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入100 mg/mL木瓜蛋白酶，在50 ℃酶解温度条件下恒温酶解120 min，测定不同pH值对澳洲坚果蛋白水解度的影响。
1.2.4 澳洲坚果蛋白酶解制备蛋白肽正交试验
在用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽单因素试验的基础上，分别选用酶解时间（A）、酶解液pH值（B）、加酶量（C）、酶解温度（D）共4个因素，每个因素选择3个水平，以水解度为指标，选用L9（34）进行正交设计来优化最佳酶解工艺条件。
1.2.5 澳洲坚果蛋白酶解液抗氧化活性的测定
ABTS自由基溶液的配制和抗氧化活性测定参照李瑞等[15]的方法，并作略微修改。
样品测定：取0.20 mL澳洲坚果蛋白酶解液，加入4.00 mL ABTS自由基工作液，室温下静置反应30 min，在734 nm下测定其吸光值，用无水乙醇调零，以蒸馏水作为空白对照。按下列公式计算其清除率：
式中：SA—ABTS自由基清除率，%；A—澳洲坚果酶解液清除ABTS自由基的吸光值；A0—对照组清除ABTS自由基的吸光值。
1.3 统计分析
采用SPSS 17.0软件对实验数据进行分析，结果均表示为均值±标准偏差；实验数据采用origin 8.0软件作图，所有结果均进行3次重复试验。
2 结果与分析
2.1 酶解时间对澳洲坚果蛋白水解度的影响
通过丝氨酸标准曲线的绘制，得出其线性回归方程为y=0.001 3 x+0.004 5[x为丝氨酸含量（μg/mL），y为吸光度，R2=0.999 8]。由图1可知，随着酶解时间的增加，澳洲坚果蛋白的水解度逐渐增加，在240 min达到最大值，之后趋于平缓，这可能是因为酶解前240 min内，木瓜蛋白酶活性高，酶解产物的抑制作用小，而4 h后随着酶解时间的增加，酶解液中蛋白肽和游离氨基酸含量逐渐增加，其产生的抑制作用增大，木瓜蛋白酶的活性因受到抑制而降低，水解度增加的幅度趋于平缓[16]，这与范方宇等[1]和郭刚军等[7]研究碱性蛋白酶和中性蛋白酶对澳洲坚果蛋白酶解的影响中，水解度随酶解时间的变化极其相似。综合各方面因素考虑，木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白的适宜时间为4 h左右，在此条件下澳洲坚果蛋白的水解度为56.46 %。
2.2 酶解温度对澳洲坚果蛋白水解度的影响 由图2可知，酶解温度在35-60 ℃时，澳洲坚果蛋白水解度随着温度的升高而增加，当酶解温度超过60 ℃后，水解度随着温度的升高而降低，这可能是由于在一定的温度范围内，随着温度的升高，木瓜蛋白酶的催化活性增加，酶解能力增强，所以水解度逐渐增加，产生的澳洲坚果蛋白肽也增加；当超过最适酶解温度后，酶的催化活性因受到抑制而减弱，甚至有可能导致酶失活[17]。因此，木瓜蛋白酶酶解澳洲堅果蛋白的最适酶解温度为60 ℃左右，在此条件下水解度达到55.78 %。
2.3 酶解液pH值对澳洲坚果蛋白水解度的影响
由图3可知，随着酶解液pH值的增加，澳洲坚果蛋白的水解度逐渐增加，这可能是由于澳洲坚果蛋白在pH 4.0时溶解度较低，底物与酶接触不充分，而且过高或过低的pH值均会导致酶的空间结构破坏，使酶活性降低，甚至失活。在pH 8.0、pH 9.0时，澳洲坚果蛋白的溶解度较大，底物与酶接触比较充分，水解度增加。因此，木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白的适宜pH值为9.0左右，在此条件下水解度达到54.58 %。
2.4 加酶量对澳洲坚果蛋白水解度的影响
由图4可知，随着木瓜蛋白酶加酶量的增加，澳洲坚果蛋白的水解度逐渐增加，但水解度的增加幅度逐渐减弱，这可能是由于随着木瓜蛋白酶添加量的增加，增大了底物与酶的接触面积，从而促进了酶催化反应速率，所以水解度增加较快，但木瓜蛋白酶添加量超过最适加酶量后，没有足够的底物与过量的酶作用，导致蛋白水解度增加较缓[7]。因此，木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白的最适加酶量为200 mg/mL左右，在此条件下水解度达到57.67 %。
2.5 木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽正交试验分析
根据以上单因素实验，以水解度为指标，选择酶解时间（A）、酶解液pH值（B）、加酶量（C）和酶解温度（D）共4个因素进行L9（34）正交优化设计，确定木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽的最优工艺条件。正交试验设计见表1，正交试验结果见表2。
由表2可知，木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽的工艺中各因素对蛋白水解度的影响为：酶解时间>加酶量>酶解温度>酶解液pH值，其中酶解时间影响最为显著，其最优的工艺条件为A3B3C2D2，即酶解时间4.0 h、酶解液pH值9.0、加酶量200 mg/mL、酶解温度60 ℃。在此条件下进行了3组平行验证试验，其水解度平均值为64.01 %，优于正交试验的结果。张兴灿[18]采用木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白来制备多肽，其水解度为14.67 %，并且本研究结果较范方宇等[1]利用碱性蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备多肽的水解度（52.50 %）高，说明利用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽更为适宜。
2.6 木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备的蛋白肽抗氧化活性分析
ABTS自由基清除能力可用来评价物质抗氧化活性的强弱，ABTS自由基与物质反应后可使其溶液褪色，褪色越明显说明其抗氧化能力越强[19]。图5显示了木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备的蛋白肽以及不同浓度Vc和BHT对ABTS自由基的清除能力。由图5可知，澳洲坚果蛋白肽对ABTS自由基都有很强的清除能力，5.0 %的澳洲坚果蛋白酶酶解液对ABTS自由基的清除能力为54.73 %，且随着澳洲坚果蛋白酶酶解液浓度的增加，其清除能力也增强，100 %澳洲坚果蛋白酶酶解液对ABTS自由基的清除能力达到96.58 %，而100 μg/mL Vc和100 μg/mL BHT对ABTS自由基的清除能力分别为67.59 %和66.12 %。卢晓会[20]研究发现，菜籽肽及其分离组分对ABTS自由基清除效果较好，且其组分的相对分子质量越小，其清除能力越强；范方宇等[1]研究利用碱性蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白所得酶解液的抗氧化活性，发现其清除羟基自由基和超氧自由基的能力都较强。说明利用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备的蛋白肽可用来开发一种高活性抗氧化肽。
3 结论
本研究采用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽，并对其抗氧化活性进行评价。通过正交和验证试验发现其最优酶解条件为：酶解时间4.0 h、酶解液pH值9.0、加酶量200 mg/mL、酶解温度60 ℃，且各因素对澳洲坚果蛋白水解度影响次序为：酶解时间>加酶量>酶解温度>酶解液pH值，在此条件下澳洲坚果蛋白的水解度为64.01 %，其清除ABTS自由基的能力为96.58 %。本研究结果出现木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白所得酶解液具有较强的抗氧化活性，但对于酶解液中的蛋白肽含量、氨基酸组成、蛋白肽分子结构及构效关系等未进行研究，后续将主要针对这些方面进行深入研究。
参考文献
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关键词 澳洲坚果 ；蛋白肽 ；抗氧化活性
中图分类号 F307.5
Abstract With macadamia pulp as raw material， the protein of macadamia nut through alkali extraction and acid precipitation， study on the technology of macadamia nut peptide prepared by papain. The effects of four processing conditions on the degree of hydrolysis were explored by single factor and orthogonal array design methods in order to optimize these conditions. Meanwhile，the antioxidant activity of macadamia nut peptide was evaluated by ABTS scavenging activity. Results showed that the order of the factors was as follows：hydrolysis duration>enzyme dosage>hydrolysis temperature>pH，the optimized macadamia nut peptide hydrolysis parameters was：hydrolysis at 60 ℃ for 4.0 h with enzyme dosage 200 mg/mL， hydrolysis buffer pH 9.0. The hydrolysis degree of macadamia nut protein was 64.01%，with 96.58% of the ABTS scavenging activity，it had strong antioxidant activity.
Key words macadamia nut ；peptides ；antioxidant activity
澳洲坚果（Macadamia ternifolia F. Muell.）别名澳洲核桃、夏威夷果等，属山龙眼科澳洲坚果属多年生常绿乔木[1-3]。澳洲坚果营养丰富，不含胆固醇，果仁含油量高（脂肪含量高达78 %以上），酥脆可口，是世界上品质上乘的可食木本坚果[4-5]，于20世纪60-70年代开始引入中国[3]，目前在中国广东、广西、云南及贵州等地均有种植[6]。随着澳洲坚果果树的大量栽种，资源越来越丰富，澳洲坚果产业已具备一定规模，但目前澳洲坚果的深加工产业发展比较滞后，主要用于榨油，榨油后会产生大量的澳洲坚果饼粕，其蛋白质含量较高（32.25 %），且含有17种氨基酸，总含量为25.05 %[7]。目前，澳洲坚果粕主要用于饲料加工，造成极大的浪费，因此，为了提高澳洲坚果粕蛋白的附加值，通过生物酶法技术制备蛋白肽是最有效的途径之一。
蛋白肽是由二个或二个以上氨基酸通过肽键连接而形成的化合物，因其组成和排列不同而形成了种类不同的蛋白肽，它是源于蛋白质的多功能化合物[8]。蛋白肽除具有易被消化吸收的特性外，还具有抗氧化、降血压、免疫调节等多种生理功能[9-10]。生物酶法技术制备蛋白肽与化学方法相比，具有产品安全性和营养价值高、反应条件温和等特点[11-12]。目前，已有少数学者利用碱性蛋白和中性蛋白酶来制备澳洲坚果蛋白肽[1，7]，但采用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白来制备蛋白肽还未见报道。
本试验以澳洲坚果粕为原料，通过碱提酸沉得到澳洲坚果蛋白，以水解度为指标，研究木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白的工艺优化条件，同时，采用ABTS自由基清除能力来评价澳洲坚果蛋白肽的抗氧化活性，以期为澳洲坚果粕的高值化利用提供一条途径，同时也为澳洲坚果蛋白肽的应用提供科学的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂
澳洲坚果饼粕由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所休闲加工厂提供；木瓜蛋白酶（活力≥4 000 U/mg）、丝氨酸（99.99 %）、ABTS（≥97 %）（阿拉丁化学试剂有限公司）；十水四硼酸钠、十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、氢氧化钠、盐酸、过硫酸钾、无水乙醇均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。
1.1.2 儀器与设备
AR224CN型分析天平（奥康斯仪器有限公司）；LXJ-IIB型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；BCD-539WT冰箱（青岛海尔股份有限公司）；HH-4型恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；DHG-9013A鼓风干燥箱（嘉兴市中新医疗仪器有限公司）；100-1000 μL移液枪（德国Eppendorf公司）；BSXT-06型索氏提取器（上海比朗仪器制造有限公司）；ST40高速冷冻离心机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；UV2700型紫外-可见分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司]；S210 Seven Compact pH计（梅特勒-托利多国际股份有限公司）；玻璃仪器。 1.2 方法
1.2.1 蛋白质样品的制备
采用碱提酸沉法，工艺流程为：称取100 g澳洲坚果饼粕放入滤纸包中，用沸点为30-60 ℃的石油醚进行索氏提取6 h；取出晾干，按1：50（W：V）的比例加入蒸馏水，用1.0 mol/L NaOH调pH至9.0；于45 ℃水浴磁力搅拌2 h，以4 800 r/min离心過滤10 min，将上清液pH调至4.5，于4 ℃冰箱冷藏过夜；离心，水洗3次，冷冻干燥48 h，得到澳洲坚果粗蛋白，通过测定可知，其蛋白质含量为84.6 %。
1.2.2 澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽含量的测定
澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽的含量参照Pedroche等[13]和Nielsen等[14]报道的o-邻苯二甲醛法（OPA）进行测定。
标准曲线的绘制：准确称取0.100 0 g丝氨酸标准品，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg/mL的丝氨酸标准溶液；采用逐级稀释法来配置浓度分别为400、300、200、100、50、20、10 μg/mL的丝氨酸标准使用液；取100 μL丝氨酸标准使用液，加入4.00 mL OPA试剂（称取3.81 g十水四硼酸钠、100 mg SDS、8 mg OPA、88 mg二硫苏糖醇，用蒸馏水溶解并定容至100 mL），充分混匀，在室温下放置5 min，在340 nm下测定吸光值。
澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽的测定：取澳洲坚果蛋白酶解液100 μL，按上述操作测定。对照组：澳洲坚果蛋白用强酸充分水解后[8]，用上述操作测定其蛋白肽含量。澳洲坚果蛋白水解度按下列公式计算：
式中：DH—澳洲坚果蛋白水解度，%；A—澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽含量，μg/g；B—充分水解的澳洲坚果蛋白中蛋白肽含量，μg/g。
1.2.3 澳洲坚果蛋白酶解制备蛋白肽单因素试验
（1）酶解时间对澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取3.000 g澳洲坚果蛋白，将其溶解于100 mL蒸馏水中，用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH值为8.0，加入100 mg/mL木瓜蛋白酶，在50 ℃条件下恒温酶解不同时间，测定不同酶解时间（0、10、30、60、120、240、300 min）对澳洲坚果蛋白水解度的影响。
（2）酶解温度对澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取3.000 g澳洲坚果蛋白，将其溶解到100 mL蒸馏水中，用1.0 moL/L NaOH调节溶液pH值为8.0，加入100 mg/mL木瓜蛋白酶，在不同酶解温度条件下恒温酶解120 min，测定不同酶解温度（40、45、50、55、60、65、70、80 ℃）对澳洲坚果蛋白水解度的影响。
（3）加酶量对澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取3.000 g澳洲坚果蛋白，将其溶解到100 mL蒸馏水中，用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH值为8.0，加入不等量的木瓜蛋白酶，在50 ℃酶解温度条件下恒温酶解120 min，测定不等木瓜蛋白酶添加量（10、20、50、100、150、200、300 mg/mL）对澳洲坚果蛋白水解度的影响。
（4）酶解液pH值对澳洲坚果蛋白水解度的影响。称取3.000 g澳洲坚果蛋白溶解到100 mL蒸馏水中，用1.0 moL/L NaOH分别调节溶液pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入100 mg/mL木瓜蛋白酶，在50 ℃酶解温度条件下恒温酶解120 min，测定不同pH值对澳洲坚果蛋白水解度的影响。
1.2.4 澳洲坚果蛋白酶解制备蛋白肽正交试验
在用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽单因素试验的基础上，分别选用酶解时间（A）、酶解液pH值（B）、加酶量（C）、酶解温度（D）共4个因素，每个因素选择3个水平，以水解度为指标，选用L9（34）进行正交设计来优化最佳酶解工艺条件。
1.2.5 澳洲坚果蛋白酶解液抗氧化活性的测定
ABTS自由基溶液的配制和抗氧化活性测定参照李瑞等[15]的方法，并作略微修改。
样品测定：取0.20 mL澳洲坚果蛋白酶解液，加入4.00 mL ABTS自由基工作液，室温下静置反应30 min，在734 nm下测定其吸光值，用无水乙醇调零，以蒸馏水作为空白对照。按下列公式计算其清除率：
式中：SA—ABTS自由基清除率，%；A—澳洲坚果酶解液清除ABTS自由基的吸光值；A0—对照组清除ABTS自由基的吸光值。
1.3 统计分析
采用SPSS 17.0软件对实验数据进行分析，结果均表示为均值±标准偏差；实验数据采用origin 8.0软件作图，所有结果均进行3次重复试验。
2 结果与分析
2.1 酶解时间对澳洲坚果蛋白水解度的影响
通过丝氨酸标准曲线的绘制，得出其线性回归方程为y=0.001 3 x+0.004 5[x为丝氨酸含量（μg/mL），y为吸光度，R2=0.999 8]。由图1可知，随着酶解时间的增加，澳洲坚果蛋白的水解度逐渐增加，在240 min达到最大值，之后趋于平缓，这可能是因为酶解前240 min内，木瓜蛋白酶活性高，酶解产物的抑制作用小，而4 h后随着酶解时间的增加，酶解液中蛋白肽和游离氨基酸含量逐渐增加，其产生的抑制作用增大，木瓜蛋白酶的活性因受到抑制而降低，水解度增加的幅度趋于平缓[16]，这与范方宇等[1]和郭刚军等[7]研究碱性蛋白酶和中性蛋白酶对澳洲坚果蛋白酶解的影响中，水解度随酶解时间的变化极其相似。综合各方面因素考虑，木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白的适宜时间为4 h左右，在此条件下澳洲坚果蛋白的水解度为56.46 %。
2.2 酶解温度对澳洲坚果蛋白水解度的影响 由图2可知，酶解温度在35-60 ℃时，澳洲坚果蛋白水解度随着温度的升高而增加，当酶解温度超过60 ℃后，水解度随着温度的升高而降低，这可能是由于在一定的温度范围内，随着温度的升高，木瓜蛋白酶的催化活性增加，酶解能力增强，所以水解度逐渐增加，产生的澳洲坚果蛋白肽也增加；当超过最适酶解温度后，酶的催化活性因受到抑制而减弱，甚至有可能导致酶失活[17]。因此，木瓜蛋白酶酶解澳洲堅果蛋白的最适酶解温度为60 ℃左右，在此条件下水解度达到55.78 %。
2.3 酶解液pH值对澳洲坚果蛋白水解度的影响
由图3可知，随着酶解液pH值的增加，澳洲坚果蛋白的水解度逐渐增加，这可能是由于澳洲坚果蛋白在pH 4.0时溶解度较低，底物与酶接触不充分，而且过高或过低的pH值均会导致酶的空间结构破坏，使酶活性降低，甚至失活。在pH 8.0、pH 9.0时，澳洲坚果蛋白的溶解度较大，底物与酶接触比较充分，水解度增加。因此，木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白的适宜pH值为9.0左右，在此条件下水解度达到54.58 %。
2.4 加酶量对澳洲坚果蛋白水解度的影响
由图4可知，随着木瓜蛋白酶加酶量的增加，澳洲坚果蛋白的水解度逐渐增加，但水解度的增加幅度逐渐减弱，这可能是由于随着木瓜蛋白酶添加量的增加，增大了底物与酶的接触面积，从而促进了酶催化反应速率，所以水解度增加较快，但木瓜蛋白酶添加量超过最适加酶量后，没有足够的底物与过量的酶作用，导致蛋白水解度增加较缓[7]。因此，木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白的最适加酶量为200 mg/mL左右，在此条件下水解度达到57.67 %。
2.5 木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽正交试验分析
根据以上单因素实验，以水解度为指标，选择酶解时间（A）、酶解液pH值（B）、加酶量（C）和酶解温度（D）共4个因素进行L9（34）正交优化设计，确定木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽的最优工艺条件。正交试验设计见表1，正交试验结果见表2。
由表2可知，木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽的工艺中各因素对蛋白水解度的影响为：酶解时间>加酶量>酶解温度>酶解液pH值，其中酶解时间影响最为显著，其最优的工艺条件为A3B3C2D2，即酶解时间4.0 h、酶解液pH值9.0、加酶量200 mg/mL、酶解温度60 ℃。在此条件下进行了3组平行验证试验，其水解度平均值为64.01 %，优于正交试验的结果。张兴灿[18]采用木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白来制备多肽，其水解度为14.67 %，并且本研究结果较范方宇等[1]利用碱性蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备多肽的水解度（52.50 %）高，说明利用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽更为适宜。
2.6 木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备的蛋白肽抗氧化活性分析
ABTS自由基清除能力可用来评价物质抗氧化活性的强弱，ABTS自由基与物质反应后可使其溶液褪色，褪色越明显说明其抗氧化能力越强[19]。图5显示了木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备的蛋白肽以及不同浓度Vc和BHT对ABTS自由基的清除能力。由图5可知，澳洲坚果蛋白肽对ABTS自由基都有很强的清除能力，5.0 %的澳洲坚果蛋白酶酶解液对ABTS自由基的清除能力为54.73 %，且随着澳洲坚果蛋白酶酶解液浓度的增加，其清除能力也增强，100 %澳洲坚果蛋白酶酶解液对ABTS自由基的清除能力达到96.58 %，而100 μg/mL Vc和100 μg/mL BHT对ABTS自由基的清除能力分别为67.59 %和66.12 %。卢晓会[20]研究发现，菜籽肽及其分离组分对ABTS自由基清除效果较好，且其组分的相对分子质量越小，其清除能力越强；范方宇等[1]研究利用碱性蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白所得酶解液的抗氧化活性，发现其清除羟基自由基和超氧自由基的能力都较强。说明利用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备的蛋白肽可用来开发一种高活性抗氧化肽。
3 结论
本研究采用木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白制备蛋白肽，并对其抗氧化活性进行评价。通过正交和验证试验发现其最优酶解条件为：酶解时间4.0 h、酶解液pH值9.0、加酶量200 mg/mL、酶解温度60 ℃，且各因素对澳洲坚果蛋白水解度影响次序为：酶解时间>加酶量>酶解温度>酶解液pH值，在此条件下澳洲坚果蛋白的水解度为64.01 %，其清除ABTS自由基的能力为96.58 %。本研究结果出现木瓜蛋白酶酶解澳洲坚果蛋白所得酶解液具有较强的抗氧化活性，但对于酶解液中的蛋白肽含量、氨基酸组成、蛋白肽分子结构及构效关系等未进行研究，后续将主要针对这些方面进行深入研究。
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