【摘 要】
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目的 建立山羊化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)抗体的间接ELISA检测方法,并进行验证及应用.方法 通过E coli表达系统表达重组溶血素(recombinant pyolysin,rPLO),采用Ni-NT
【机 构】
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重庆市畜牧科学院,重庆402460;重庆市兽用生物制品工程技术研究中心,重庆402460;重庆市兽用生物制品工程技术研究中心,重庆402460
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目的 建立山羊化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)抗体的间接ELISA检测方法,并进行验证及应用.方法 通过E coli表达系统表达重组溶血素(recombinant pyolysin,rPLO),采用Ni-NTA亲和层析进行纯化.以rPLO作为包被抗原,HRP标记的兔抗山羊IgG抗体为二抗,建立检测山羊化脓隐秘杆菌PLO抗体的间接ELISA法.采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度(3.5、0.7、0.14和0.05 μg/mL)及最佳二抗稀释度(1∶10 000、1∶20000、1∶40000),同时验证方法的特异性、灵敏性及精密性.分别采用琼脂糖凝胶扩散试验和优化的间接ELISA法检测15份化脓隐秘杆菌自然感染的山羊血清,计算两者符合率;并采用优化的间接ELISA法检测360份临床山羊血清样本.结果 纯化的rPLO相对分子质量约34 000,纯度达90％.优化后ELISA法最佳抗原包被浓度为0.14 μg/mL,二抗稀释度为1∶40000.优化后的ELISA法对E.coli、链球菌和伪结核棒状杆菌的阳性血清均无交叉反应;可检测出1:800稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10％.两种方法检测15份化脓隐秘杆菌自然感染山羊血清阳性检出率均为100％,符合率为100％;采用优化方法检测360份山羊血清的阳性率为24.1％(87/360).结论 成功建立了用于检测山羊化脓隐秘杆菌PLO抗体的间接ELISA法,该方法具有良好的特异性、灵敏性及精密性.
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