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摘要 [目的]探究水稻纹枯病拮抗细菌的抑菌活性成分的发酵制备条件。[方法]通过点接种于平板与水稻纹枯病对峙生长对水稻纹枯病拮抗细菌进行了初筛，通过摇瓶发酵进行了复筛，并通过形态鉴定及16S RNA测序构建系统发育树对所得菌株进行鉴定；通过单因素试验研究了所得菌株的抑菌活性成分的发酵制备条件。[结果]初筛获得17株水稻纹枯病的拮抗细菌，复筛获得菌株Lys67，该菌株的发酵液对水稻纹枯病生长具有明显的抑制作用，菌株Lys67鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。经单因素试验，菌株Lys67利用麸皮5.0%，于35 ℃、摇床转速200 r/min条件下发酵3 d，经牛津杯打孔法检测，150 μl发酵液中活性成分抑制水稻纹枯病的抑菌圈达36 mm。[结论]为菌株Lys67的进一步研究及生防应用奠定了基础。
关键词 水稻纹枯病；拮抗菌；筛选；发酵；生物防治
中图分类号 Q93.3；S435.111.4+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）25-08584-03
Abstract [Objective] The aim was to study the fermentation conditions of antagonistic bacteria active ingredient against Rhizoctonia solani. [Method] Some antagonistic bacteria against R. solani were screened through point inoculating contrary to R. solani on agar petri plates and shaking flask fermentation； the obtained strain was identified through morphological identification and 16S RNA sequencing to construct phylogenetic tree； and fermentation conditions of active ingredient of the obtained strain against R. solani were studied through single factor experiment. [Result] Seventeen strains of bacteria antagonist R. solani were obtained， and strain Lys67 was obtained finally； strain Lys67 was identified as Bacillus subtilis. Also， 150 μl fermentation broth of strain Lys67 resulted in 36 mm of inhibition zone against R. solani， determining by method of drilling hole with Oxford cup on agar plate， while strain Lys67 was cultured in wheat bran 5.0%， at 35 ℃， rotation speed 200 r/min for three days. [Conclusion] The results lay basis for further study and application of strain Lys67.
Key words Rhizoctonia solani； Antagonistic bacteria； Screening； Fermentation； Biological control
水稻纹枯病是我国水稻种植区重要病害，严重时会导致我国水稻产量年损失在10%以上[1] 。目前，在生产上主要用3%井冈霉素水剂来防治水稻纹枯病，赖开平等[2]研究表明稀释1 500倍的50%丙环唑左旋松油醇乳油的防效为82.02%。虽然化学农药和抗生素效果较好，但长期使用会导致纹枯病菌产生抗药性和农残问题，且污染环境。自然界经过长期进化，存在大量拮抗病原微生物，寻求生物防治途径已成为研究控制植物土传病害的新方向。例如，孟德超等[3]获得4株对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）有强拮抗作用的菌株；宋雯雯等[4]报道了2株对稻瘟病菌有较强拮抗活性的菌株。笔者采用随机法从水稻田筛选到与水稻纹枯病菌有强拮抗作用的菌株Lys67，并对该菌的进行了鉴定，旨在为该菌的进一步研究和生防应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
培养皿。平板及斜面培养基（WBA）：麸皮20.0 g，自来水180 ml，100 ℃微火煮沸20 min，并不断添水，2层纱布挤压过滤，滤液定容值200 ml，加4.0 g 琼脂，自然pH，121 ℃灭菌20 min。液体发酵培养基：麸皮5.0 g，自来水95 ml，置于250 ml三角瓶中，自然pH，通气棉塞封口，121 ℃灭菌20 min。
1.1.2
供试病原真菌。
水稻纹枯病菌由湖南农业大学生物科学技术学院保存。将该菌株接种于WBA中28 ℃培养，待菌丝长满平板呈白色，4 ℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1
水稻纹枯病拮抗细菌的收集。从湖南农业大学耘园试验田、浏阳河畔等土壤随机取土样若干，按十倍稀释法涂布平板，37 ℃培养1～2 d，待菌落长出后随机挑取单菌落500余株，接种斜面，编号，37 ℃培养2 d备用。 1.2.2
水稻纹枯病拮抗细菌的初筛。将水稻纹枯病菌用无菌镊子取一小块点接种于WBA中央，28 ℃预培养1～2 d，当菌落直径为0.8～1.0 cm时，再将所筛选到的500余株细菌分别接种于水稻纹枯病菌落四周，细菌接种点距水稻纹枯病菌落约10 mm，每个平板接种6～8株细菌，30 ℃培养，每12 h观察细菌与水稻纹枯病对峙生长情况，记录细菌拮抗效果。
1.2.3
拮抗细菌的摇瓶发酵复筛。选择初筛拮抗效果较好的菌株，接种于100 ml发酵培养基，摇床转速200 r/min下37 ℃培养3 d，取1.5 ml发酵液于EP管中，10 000 r/min离心5 min，上清用于活性成分的检测。另配制WBA 200 ml，趁热倒入放置7个牛津杯（呈星形排列）的平板中（10 ml/皿），凝固后，用无菌镊子拔出牛津杯及杯中多余的培养基，形成小孔，在平板表面均匀接种水稻纹枯病菌，在中心孔中加入未接种的无菌培养基离心液150 μl为对照，四周孔中加入不同的发酵液上清150 μl，每个平板均匀撒入约50 mg硫酸链霉素，抑制细菌生长，记录抑菌圈大小。
1.2.4
菌株Lys67拮抗水稻纹枯病的活性成分的发酵制备。以麸皮5.0%为基础培养基，以温度、培养基起始pH、发酵时间、麸皮含量为单因素变量，分别考察各变量对菌株Lys67的活性成分的影响，活性成分抑制水稻纹枯病的检测按“1.2.3”方法进行。
1.2.4.1
温度对菌株Lys67产抑菌活性物质的影响。配制液体发酵培养基，接种菌株Lys67后，分别置入30、33、35、37、40 ℃和200 r/min 条件下培养3 d，其发酵液进行抑制水稻纹枯病效果测定。
1.2.4.2
培养基起始pH对菌株Lys67产抑菌活性物质的影响。分别配制起始pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的液体发酵培养基，接种菌株Lys67后，于35 ℃、200 r/min 条件下培养3 d，其发酵液用于抑制水稻纹枯病效果测定。
1.2.4.3
发酵时间对菌株Lys67产抑菌活性物质的影响。配制液体发酵培养基若干，接种菌株Lys67后，于35 ℃、200 r/min 条件下培养，测定Lys67发酵不同时间后抑制水稻纹枯病的效果。
1.2.5
菌株Lys65的鉴定。
1.2.5.1
形态鉴定。菌株的细胞染色、形态特征、培养特征和生理生化分析等主要参照文献[5]。
1.2.5.2
16S RNA鉴定。菌种送北京三博远志生物科技公司进行测序，测序结果通过Blast与GenBank中的序列进行比对，构建系统发育树进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 细菌拮抗水稻纹枯病的初筛结果
通过随机法获得500余株细菌，分别接种于水稻纹枯病菌落四周，经对峙生长，发现有17株细菌对纹枯病具有拮抗作用。其中，菌株Lys52、Lys67、Lys138、Lys375拮抗效果明显，水稻纹枯病菌丝不能向细菌菌落一侧延伸，而菌落的对侧纹枯病菌丝生长良好；菌株Lys179、Lys239、Lys341、Lys466的拮抗效果较弱，但分界依然明显（图A～E）。因此，需进一步对上述17株细菌的拮抗活性成分发酵复筛。
2.2 拮抗细菌的摇瓶发酵复筛结果
由表1可知，17株细菌中有4株抑菌圈直径达31～35 mm，5株抑菌圈直径达21～30 mm，6株抑菌圈直径达11～20 mm，2株细菌抑菌效果未检出。其中菌株Lys67、Lys138、Lys375发酵液上清在未接种的培养基上清（CK）中无抑菌作用。发酵液抑菌效果非常明显（图1F）。
3 讨论
水稻纹枯病是国内外最难治理的真菌病害之一。该病对国内的主要防治药剂井冈霉素已产生明显的抗药性，过去因长期大量使用农药造成自然生态环境污染及稻米农药残留量增加的问题日益突出。因此，开展该病的生物防治研究或者研究新型抗生素具有十分重要的意义，有关报道水稻纹枯病的拮抗菌中细菌主要为芽孢杆菌和假单胞菌，真菌主要为木霉，放线菌主要为链霉菌[6-7]，这与该研究结论一致。上述拮抗菌中，细菌和链霉菌适宜在土壤中生长，木霉菌适宜在非活体的木质纤维组织中生长，而纹枯病主要通过侵染活体稻株而致病，因此通过拮抗菌防治纹枯病的发生有一定的局限性。为此，笔者在实验室条件下探索了芽孢杆菌Lys67发酵产生的活性成分对纹枯病的抑菌效果，该菌株发酵生产抑制水稻纹枯病的活性成分的工艺简单，培养基廉价，周期较短，为进一步探索水稻纹枯病的拮抗菌及其代谢产物田间防治剂奠定了基础。
参考文献
[1] 李涛，路雪君，廖晓兰，等.水稻纹枯病的发生及其防治策略[J].江西农业学报，2010，22（9）：91-93.
[2] 赖开平，叶一强，方峰，等.50%丙环唑左旋松油醇乳油对水稻纹枯病的田间防治效果[J].安徽农业科学，2009，37（31）：15297-15298.
[3] 孟德超，纪明山.辽宁地区水稻纹枯病拮抗细菌的分离和筛选[J].河南农业科学，2009（4）：79-81.
[4] 宋雯雯，覃强，田甜.稻瘟病菌拮抗微生物的筛选[J].农业科学研究，2009，30（2）：14-17.
[5] 东秀株，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[K].北京：科学出版社，2001：44-65.
[6] 俞振明，李家玉，林志华，等.植物抗性诱导防御病虫草害的研究进展[J].农业科学研究，2013，34（2）：69-76.
[7] 姚英娟，曾小军，舒平平，等.有机水稻病虫害防控措施研究进展[J].江西农业学报，2010，22（10）：80-82.
关键词 水稻纹枯病；拮抗菌；筛选；发酵；生物防治
中图分类号 Q93.3；S435.111.4+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）25-08584-03
Abstract [Objective] The aim was to study the fermentation conditions of antagonistic bacteria active ingredient against Rhizoctonia solani. [Method] Some antagonistic bacteria against R. solani were screened through point inoculating contrary to R. solani on agar petri plates and shaking flask fermentation； the obtained strain was identified through morphological identification and 16S RNA sequencing to construct phylogenetic tree； and fermentation conditions of active ingredient of the obtained strain against R. solani were studied through single factor experiment. [Result] Seventeen strains of bacteria antagonist R. solani were obtained， and strain Lys67 was obtained finally； strain Lys67 was identified as Bacillus subtilis. Also， 150 μl fermentation broth of strain Lys67 resulted in 36 mm of inhibition zone against R. solani， determining by method of drilling hole with Oxford cup on agar plate， while strain Lys67 was cultured in wheat bran 5.0%， at 35 ℃， rotation speed 200 r/min for three days. [Conclusion] The results lay basis for further study and application of strain Lys67.
Key words Rhizoctonia solani； Antagonistic bacteria； Screening； Fermentation； Biological control
水稻纹枯病是我国水稻种植区重要病害，严重时会导致我国水稻产量年损失在10%以上[1] 。目前，在生产上主要用3%井冈霉素水剂来防治水稻纹枯病，赖开平等[2]研究表明稀释1 500倍的50%丙环唑左旋松油醇乳油的防效为82.02%。虽然化学农药和抗生素效果较好，但长期使用会导致纹枯病菌产生抗药性和农残问题，且污染环境。自然界经过长期进化，存在大量拮抗病原微生物，寻求生物防治途径已成为研究控制植物土传病害的新方向。例如，孟德超等[3]获得4株对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）有强拮抗作用的菌株；宋雯雯等[4]报道了2株对稻瘟病菌有较强拮抗活性的菌株。笔者采用随机法从水稻田筛选到与水稻纹枯病菌有强拮抗作用的菌株Lys67，并对该菌的进行了鉴定，旨在为该菌的进一步研究和生防应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
培养皿。平板及斜面培养基（WBA）：麸皮20.0 g，自来水180 ml，100 ℃微火煮沸20 min，并不断添水，2层纱布挤压过滤，滤液定容值200 ml，加4.0 g 琼脂，自然pH，121 ℃灭菌20 min。液体发酵培养基：麸皮5.0 g，自来水95 ml，置于250 ml三角瓶中，自然pH，通气棉塞封口，121 ℃灭菌20 min。
1.1.2
供试病原真菌。
水稻纹枯病菌由湖南农业大学生物科学技术学院保存。将该菌株接种于WBA中28 ℃培养，待菌丝长满平板呈白色，4 ℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1
水稻纹枯病拮抗细菌的收集。从湖南农业大学耘园试验田、浏阳河畔等土壤随机取土样若干，按十倍稀释法涂布平板，37 ℃培养1～2 d，待菌落长出后随机挑取单菌落500余株，接种斜面，编号，37 ℃培养2 d备用。 1.2.2
水稻纹枯病拮抗细菌的初筛。将水稻纹枯病菌用无菌镊子取一小块点接种于WBA中央，28 ℃预培养1～2 d，当菌落直径为0.8～1.0 cm时，再将所筛选到的500余株细菌分别接种于水稻纹枯病菌落四周，细菌接种点距水稻纹枯病菌落约10 mm，每个平板接种6～8株细菌，30 ℃培养，每12 h观察细菌与水稻纹枯病对峙生长情况，记录细菌拮抗效果。
1.2.3
拮抗细菌的摇瓶发酵复筛。选择初筛拮抗效果较好的菌株，接种于100 ml发酵培养基，摇床转速200 r/min下37 ℃培养3 d，取1.5 ml发酵液于EP管中，10 000 r/min离心5 min，上清用于活性成分的检测。另配制WBA 200 ml，趁热倒入放置7个牛津杯（呈星形排列）的平板中（10 ml/皿），凝固后，用无菌镊子拔出牛津杯及杯中多余的培养基，形成小孔，在平板表面均匀接种水稻纹枯病菌，在中心孔中加入未接种的无菌培养基离心液150 μl为对照，四周孔中加入不同的发酵液上清150 μl，每个平板均匀撒入约50 mg硫酸链霉素，抑制细菌生长，记录抑菌圈大小。
1.2.4
菌株Lys67拮抗水稻纹枯病的活性成分的发酵制备。以麸皮5.0%为基础培养基，以温度、培养基起始pH、发酵时间、麸皮含量为单因素变量，分别考察各变量对菌株Lys67的活性成分的影响，活性成分抑制水稻纹枯病的检测按“1.2.3”方法进行。
1.2.4.1
温度对菌株Lys67产抑菌活性物质的影响。配制液体发酵培养基，接种菌株Lys67后，分别置入30、33、35、37、40 ℃和200 r/min 条件下培养3 d，其发酵液进行抑制水稻纹枯病效果测定。
1.2.4.2
培养基起始pH对菌株Lys67产抑菌活性物质的影响。分别配制起始pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的液体发酵培养基，接种菌株Lys67后，于35 ℃、200 r/min 条件下培养3 d，其发酵液用于抑制水稻纹枯病效果测定。
1.2.4.3
发酵时间对菌株Lys67产抑菌活性物质的影响。配制液体发酵培养基若干，接种菌株Lys67后，于35 ℃、200 r/min 条件下培养，测定Lys67发酵不同时间后抑制水稻纹枯病的效果。
1.2.5
菌株Lys65的鉴定。
1.2.5.1
形态鉴定。菌株的细胞染色、形态特征、培养特征和生理生化分析等主要参照文献[5]。
1.2.5.2
16S RNA鉴定。菌种送北京三博远志生物科技公司进行测序，测序结果通过Blast与GenBank中的序列进行比对，构建系统发育树进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 细菌拮抗水稻纹枯病的初筛结果
通过随机法获得500余株细菌，分别接种于水稻纹枯病菌落四周，经对峙生长，发现有17株细菌对纹枯病具有拮抗作用。其中，菌株Lys52、Lys67、Lys138、Lys375拮抗效果明显，水稻纹枯病菌丝不能向细菌菌落一侧延伸，而菌落的对侧纹枯病菌丝生长良好；菌株Lys179、Lys239、Lys341、Lys466的拮抗效果较弱，但分界依然明显（图A～E）。因此，需进一步对上述17株细菌的拮抗活性成分发酵复筛。
2.2 拮抗细菌的摇瓶发酵复筛结果
由表1可知，17株细菌中有4株抑菌圈直径达31～35 mm，5株抑菌圈直径达21～30 mm，6株抑菌圈直径达11～20 mm，2株细菌抑菌效果未检出。其中菌株Lys67、Lys138、Lys375发酵液上清在未接种的培养基上清（CK）中无抑菌作用。发酵液抑菌效果非常明显（图1F）。
3 讨论
水稻纹枯病是国内外最难治理的真菌病害之一。该病对国内的主要防治药剂井冈霉素已产生明显的抗药性，过去因长期大量使用农药造成自然生态环境污染及稻米农药残留量增加的问题日益突出。因此，开展该病的生物防治研究或者研究新型抗生素具有十分重要的意义，有关报道水稻纹枯病的拮抗菌中细菌主要为芽孢杆菌和假单胞菌，真菌主要为木霉，放线菌主要为链霉菌[6-7]，这与该研究结论一致。上述拮抗菌中，细菌和链霉菌适宜在土壤中生长，木霉菌适宜在非活体的木质纤维组织中生长，而纹枯病主要通过侵染活体稻株而致病，因此通过拮抗菌防治纹枯病的发生有一定的局限性。为此，笔者在实验室条件下探索了芽孢杆菌Lys67发酵产生的活性成分对纹枯病的抑菌效果，该菌株发酵生产抑制水稻纹枯病的活性成分的工艺简单，培养基廉价，周期较短，为进一步探索水稻纹枯病的拮抗菌及其代谢产物田间防治剂奠定了基础。
参考文献
[1] 李涛，路雪君，廖晓兰，等.水稻纹枯病的发生及其防治策略[J].江西农业学报，2010，22（9）：91-93.
[2] 赖开平，叶一强，方峰，等.50%丙环唑左旋松油醇乳油对水稻纹枯病的田间防治效果[J].安徽农业科学，2009，37（31）：15297-15298.
[3] 孟德超，纪明山.辽宁地区水稻纹枯病拮抗细菌的分离和筛选[J].河南农业科学，2009（4）：79-81.
[4] 宋雯雯，覃强，田甜.稻瘟病菌拮抗微生物的筛选[J].农业科学研究，2009，30（2）：14-17.
[5] 东秀株，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[K].北京：科学出版社，2001：44-65.
[6] 俞振明，李家玉，林志华，等.植物抗性诱导防御病虫草害的研究进展[J].农业科学研究，2013，34（2）：69-76.
[7] 姚英娟，曾小军，舒平平，等.有机水稻病虫害防控措施研究进展[J].江西农业学报，2010，22（10）：80-82.