论文部分内容阅读
目的:探讨过表达蛋白激酶C-α(protein kinase C-α,PKC-α)对HEK-293T细胞中核因子-κB-p65 (nuclear factor-κB-p65,NF-κB-p65)磷酸化水平的影响,并检查青藤碱(sinomenine,SIN)对PKC-α/NF-κB-p65信号通路的抑制作用.方法:采用PCR技术扩增大鼠PKC-α基因蛋白质编码区(complete sequence coding,CDS)序列,将其插入到pIRES2-EGFP空载质粒中,构建野生型(wide type,WT)PKC-α过表达质粒(pIRES2-PKC-α-WT,PKC-αWT);在PKC-αWT质粒的基础上,将PKC-α第25位丙氨酸(A)与368位赖氨酸(K)分别突变为谷氨酸(E)和精氨酸(R),即构建持续活化(constitutively active,CA)突变型PKC-α过表达质粒(pIRES2-PKC-α-A25E,PKC-αCA)和显性负性(dominant negative,DN)突变型PKC-α过表达质粒(pIRES2-PKC-α-K368R,PKC-αDN).本课题组前期构建的大鼠野生型NF-κB-p65过表达质粒(pIRES2-NF-κB-p65,p65WT)分别与上述各PKC-α过表达质粒共同转染HEK-293T细胞,免疫印迹法检测PKC-α、NF-κB-p65的表达及磷酸化水平.再将上述不同质粒转染HEK-293T细胞,46 h后予50 ng/mL SIN处理细胞2h,再行免疫印迹实验分析SIN对PKC-α、NF-κB-p65磷酸化的影响.结果:菌液PCR及测序证实,上述PKC-α过表达质粒构建成功.在HEK-293T中过表达PKC-αWT或PKC-αCA可促进NF-κB-p65的磷酸化,且过表达PKC-αCA时尤为显著,而过表达PKC-αDN后NF-κB-p65的磷酸化无明显变化.SIN处理可抑制PKC-αWT、PKC-αCA和PKC-αDN转染组HEK-293T细胞中PKC-α的磷酸化,同时也能抑制过表达PKC-αWT上调的NF-κB-p65磷酸化修饰,但不影响过表达PKC-αCA和PKC-αDN对NF-κB-p65的磷酸化作用.结论:过表达PKC-α可促进HEK-293T细胞中NF-κB-p65的磷酸化,SIN处理HEK-293T细胞后可通过抑制PKC-α的磷酸化下调NF-κB-p65的磷酸化修饰.