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【摘要】目的探讨复发性尖锐湿疣患者CD4+、CD8+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg细胞）的表达与临床意义。方法收集22例复发性尖锐湿疣患者（观察组）和24例正常对照者（对照组）的血清，采用流式细胞仪检测外周血CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+T细胞和Treg细胞的表达水平。结果观察组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的表达明显低于对照组 （P<0.01），而Treg细胞的表达则明显高于对照组 （P<0.01）。观察组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的表达水平与患者的复发次数无显著相关性（P>0.05）；Treg的表达水平与患者的复发次数呈显著正相关（P<0.01）。结论复发性尖锐湿疣患者T细胞免疫功能低下，Treg细胞的表达水平与尖锐湿疣的复发密切相关。
【关键词】尖锐湿疣； CD4+T细胞； CD8+T细胞；CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞
中图分类号：R752.5+3 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.04.007
【Abstract】ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significance of CD4+，CD8+T cells and CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells （Treg cells） of patients with recrudescent condyloma acuminatum.Methods22 cases of recrudescent condyloma acuminatum were selected as observation group，and 24 cases of normal controls as control group.Serum of both groups were collected，and flow cytometer was used to detect the expression levels of CD4+，CD8+，CD4+/ CD8+T cells and Treg cells in peripheral blood.Results The expression levels of CD4+， CD8+， CD4+/ CD8+T cells in the observation group were lower than those in the control group （P<0.01），while the expression levels of Treg cells in the former group were higher than those in the latter group （P<0.01）.The recurrent frequency of the patients had no significant correlation with the expression level of CD4+，CD8+，CD4+/ CD8+T cells in the observation group（P>0.05），but it had significant positive correlation with the expression level of Treg cells（P<0.01）.ConclusionPatients with recrudescent condyloma acuminatum have a low Treg cells immune function，and the recurrence of condyloma acuminatum has close relationship with the expression level of Treg cells.
【Key words】condyloma acuminatum；CD4+cell，CD8+Tcell；CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells
尖锐湿疣（Condyloma acuminatum，CA）是由人类乳头瘤病毒 （Human papillomavirus，HPV）感染所致，是最常见的性传播疾病之一，该病容易复发，传染性强[1]。近年来，尖锐湿疣发病率逐年升高[2]。有研究显示患者细胞免疫功能可能与CA的发生、发展和转归关系密切[1，3]。本研究通过观察复发性CA患者细胞免疫水平，探讨CA的发病机制，以便用于指导CA的治疗、判断预后。
1资料与方法1.1一般资料所有患者来自我院2013年1月～2014年2月性病科门诊，按照就诊顺序收集22例复发性CA患者作为观察组。观察组男15例，女7例，年龄18～48岁，平均（36.28±9.70）岁，病程2个月～2年，平均（10.1±4.3）个月，复发次数2～6次。选择在我院体检中心健康体检正常者24例作为对照组，其中男10例，女14例，年龄18～50岁，平均（30.68±10.01）岁。两组年龄、性别等比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2病例入选和排除标准入选标准： ①符合尖锐湿疣的诊断标准：临床表现为外生殖器、会阴、肛周部位有典型的乳头状、菜花状或鸡冠状增生物；②5%醋酸白试验阳性；③复发2次或2次以上；④在本次治疗前未经任何治疗；⑤无结核、肿瘤、自身免疫性疾病，未合并其他性病，在治疗前1个月内没有全身应用抗病毒药、免疫调节剂、中药等药物。排除标准：①妊娠期或哺乳期妇女；②精神障碍，难以沟通患者；③合并HIV、生殖器疱疹或者梅毒感染患者。
1.3实验方法流式细胞仪检测：抽取两组受试者肝素抗凝血100 μl，加入淋巴细胞检测试剂25 μl，混匀，室温避光染色20 min；加入2 ml红细胞裂解液，室温避光放置10 min； 1500 r/min离心5 min弃上清液，加磷酸盐缓冲液（PBS）2 ml，混匀；1500 r/min离心5 min弃上清液，加2%多聚甲醛PBS 500 ml固定，放置4℃～8℃冰箱待检测。每管加细胞液100 μl，加入10 μl抗CD4 mAbPerCP、抗CD8mAbPerCP、抗CD4+CD25+Foxp3+ mAbPerCP，温室避光放置15 min；红细胞溶解液0.5 μl溶解红细胞15 min；破膜剂Ⅰ、Ⅱ固定和破膜；加PBS 3 ml，1200 r/min离心5 min，弃上清；加细胞因子抗体，每份标本分别加同型对照IgG1FITC；温室避光放置15 min；加PBS 4 ml，1200 r/min，离心10 min，弃上清；适量PBS重悬细胞上流式细胞仪检测；每份标本检测1万个细胞，在 CD4+T淋巴细胞中，根据阴性对照试剂结果，以 CD25、Foxp3 设门，分析CD4+CD25+ Foxp3+细胞占 CD4+T淋巴细胞的比例。结果以阳性细胞百分率（%）表示并经Cell Quest功能软件进行参数获取和数据分析。 1.4统计学方法采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，相关性采用直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果2.1两组T细胞及Treg细胞的表达情况比较观察组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的表达明显低于对照组，组间比较差异有统计学意义（P<0.01）；而Treg细胞的表达则明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。
2.2观察组CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+T细胞和Treg细胞与复发次数的相关性分析观察组CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+的表达水平与患者的复发次数无显著相关性（r=0.555，P=0.352；r=-0.319，P=0650；r=0.239，P=0.284）；Treg的表达水平与患者的复发次数呈显著正相关（r=0.612，P=0.002）。3讨论细胞免疫是免疫活性T淋巴细胞所介导的一系列免疫应答和免疫调节功能。免疫活性T淋巴细胞可分为CD4和CD8两个亚群，CD4 T细胞亚群根据它们细胞因子分泌模式和效应子功能的不同又可极化为两个亚群，即Th1和Th2细胞。研究发现，CA患者外周血有CD4和CD8细胞亚群数目及比例异常，并有Th1和Th2型细胞因子分泌异常，表达倾向于向Th2偏移[5～7]。Th2介导的细胞免疫功能障碍可能是HPV感染后病毒持久存在并复制致尖锐湿疣治疗后反复复发的病理基础[5～7]。
前期的研究显示CA患者的体液免疫缺陷[8，9]，但关于CA患者的细胞免疫功能的研究比较少。本研究旨在探讨复发性CA患者细胞免疫水平，结果显示，CD4+、CD8+细胞水平及CD4+/ CD8+的比值明显低于对照组，提示CA患者细胞免疫功能低下，机体免疫监测功能减低，HPV病毒复制，临床表现为疣状赘生物持续生长，本研究结果与黄永华等[4]的研究结果基本一致。Treg细胞是一类控制体内自身免疫反应的T细胞亚群。机体对抗原的免疫应答是一把双刃剑，反馈调节达到阴阳平衡，一方面清除有害抗原，另一方面又可造成机体损伤[10]。免疫平衡需要完善的调节机制。Treg细胞对维持机体免疫耐受和免疫应答稳态具有非常重要的作用，可以通过一系列机制抑制过强的免疫应答，使得机体在自身损伤最小的情况下有效地清除抗原或病原体。本研究显示复发性CA患者外周血Treg的表达水平明显高于健康对照组，提示机体受到HPV病毒感染时，体内T细胞向Treg细胞分化明显加强，产生更多的Treg细胞来清除病毒。复发性CA患者CD4+、CD8+细胞水平下降，而Treg升高，这种免疫机理可能与病毒刺激机体诱导免疫反应过程中，免疫正应答与潜在免疫耐受诱导同时共存。
本研究结果显示，CD4+、CD8+细胞水平及CD4+/ CD8+的比值与患者的复发次数无显著相关性，但Treg细胞表达水平与患者的复发次数呈显著的正相关，即复发次数越多，Treg细胞水平越高，提示尖锐湿疣患者在首发时检测Treg细胞表达水平可判断预后，对于高表达的患者给予更多的关注。黄永华等[4]的研究结果显示CA患者抑郁情绪发生率为48.6%；CA患者抑郁组CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+和NK细胞的水平明显低于非抑郁组，提示CA患者存在明显抑郁情绪并与个人及社会因素相关，且抑郁者细胞免疫功能更为低下。本研究结果结合前期研究，提示复发性CA患者除了给予常规的物理、药物治疗外，还需要缓解患者的抑郁情绪，有助于提高机体细胞免疫功能，减少CA的复发。参考文献[1] 李嘉彦，罗育武，杨日东，等.复发性尖锐湿疣患者 HPV 感染模式和细胞免疫功能的分析[J].皮肤性病诊疗学杂志，2014，21（3）：197200.
[2] 李雪芽，肖艳，曾抗，等.尖锐湿疣防治药物的研究进展[J].皮肤性病诊疗学杂志，2013，20（1）：6668.
[3] 韩凯，曾抗.尖锐湿疣的细胞免疫研究进展[J].皮肤性病诊疗学杂志，2011，18（4）：279282.
[4] 黄永华，李其林，盛文婷，等.尖锐湿疣患者抑郁情绪和CD4+、CD8+以及NK细胞相关性研究[J].广东医学，2010，31（22）：29412943.
[5] Mosmann TR，Sad S.The expanding universe of Tcell subsets：Th1，Th2 and more[J].Immunol Today，1996，17（3）：138146.
[6] Romagnani S.The Th1/Th2 paradigm[J].Immunol Today，1997，18（6）：263266.
[7] Romani L，Puccetti P.Immune regulation and tolerance to fungi in the lungs and skin[J].Chem Immunol Allergy，2008，94：124137.
[8] 刘琼芬，胡斌.白细胞介素4及血管内皮生长因子在尖锐湿疣组织中的定量表达[J].广东医学，2009，30（4）：598600.
[9] 伍金妹，侯宜金.不同方法治疗女性尖锐湿疣138例临床分析[J].现代医院，2011，11（6）：6061.
[10] 王振华，杨芳红，孙怡，等.卡介菌多糖核酸对尖锐湿疣患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的影响[J].中华皮肤科杂志，2014，47（9）：665666.
【关键词】尖锐湿疣； CD4+T细胞； CD8+T细胞；CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞
中图分类号：R752.5+3 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.04.007
【Abstract】ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significance of CD4+，CD8+T cells and CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells （Treg cells） of patients with recrudescent condyloma acuminatum.Methods22 cases of recrudescent condyloma acuminatum were selected as observation group，and 24 cases of normal controls as control group.Serum of both groups were collected，and flow cytometer was used to detect the expression levels of CD4+，CD8+，CD4+/ CD8+T cells and Treg cells in peripheral blood.Results The expression levels of CD4+， CD8+， CD4+/ CD8+T cells in the observation group were lower than those in the control group （P<0.01），while the expression levels of Treg cells in the former group were higher than those in the latter group （P<0.01）.The recurrent frequency of the patients had no significant correlation with the expression level of CD4+，CD8+，CD4+/ CD8+T cells in the observation group（P>0.05），but it had significant positive correlation with the expression level of Treg cells（P<0.01）.ConclusionPatients with recrudescent condyloma acuminatum have a low Treg cells immune function，and the recurrence of condyloma acuminatum has close relationship with the expression level of Treg cells.
【Key words】condyloma acuminatum；CD4+cell，CD8+Tcell；CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells
尖锐湿疣（Condyloma acuminatum，CA）是由人类乳头瘤病毒 （Human papillomavirus，HPV）感染所致，是最常见的性传播疾病之一，该病容易复发，传染性强[1]。近年来，尖锐湿疣发病率逐年升高[2]。有研究显示患者细胞免疫功能可能与CA的发生、发展和转归关系密切[1，3]。本研究通过观察复发性CA患者细胞免疫水平，探讨CA的发病机制，以便用于指导CA的治疗、判断预后。
1资料与方法1.1一般资料所有患者来自我院2013年1月～2014年2月性病科门诊，按照就诊顺序收集22例复发性CA患者作为观察组。观察组男15例，女7例，年龄18～48岁，平均（36.28±9.70）岁，病程2个月～2年，平均（10.1±4.3）个月，复发次数2～6次。选择在我院体检中心健康体检正常者24例作为对照组，其中男10例，女14例，年龄18～50岁，平均（30.68±10.01）岁。两组年龄、性别等比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2病例入选和排除标准入选标准： ①符合尖锐湿疣的诊断标准：临床表现为外生殖器、会阴、肛周部位有典型的乳头状、菜花状或鸡冠状增生物；②5%醋酸白试验阳性；③复发2次或2次以上；④在本次治疗前未经任何治疗；⑤无结核、肿瘤、自身免疫性疾病，未合并其他性病，在治疗前1个月内没有全身应用抗病毒药、免疫调节剂、中药等药物。排除标准：①妊娠期或哺乳期妇女；②精神障碍，难以沟通患者；③合并HIV、生殖器疱疹或者梅毒感染患者。
1.3实验方法流式细胞仪检测：抽取两组受试者肝素抗凝血100 μl，加入淋巴细胞检测试剂25 μl，混匀，室温避光染色20 min；加入2 ml红细胞裂解液，室温避光放置10 min； 1500 r/min离心5 min弃上清液，加磷酸盐缓冲液（PBS）2 ml，混匀；1500 r/min离心5 min弃上清液，加2%多聚甲醛PBS 500 ml固定，放置4℃～8℃冰箱待检测。每管加细胞液100 μl，加入10 μl抗CD4 mAbPerCP、抗CD8mAbPerCP、抗CD4+CD25+Foxp3+ mAbPerCP，温室避光放置15 min；红细胞溶解液0.5 μl溶解红细胞15 min；破膜剂Ⅰ、Ⅱ固定和破膜；加PBS 3 ml，1200 r/min离心5 min，弃上清；加细胞因子抗体，每份标本分别加同型对照IgG1FITC；温室避光放置15 min；加PBS 4 ml，1200 r/min，离心10 min，弃上清；适量PBS重悬细胞上流式细胞仪检测；每份标本检测1万个细胞，在 CD4+T淋巴细胞中，根据阴性对照试剂结果，以 CD25、Foxp3 设门，分析CD4+CD25+ Foxp3+细胞占 CD4+T淋巴细胞的比例。结果以阳性细胞百分率（%）表示并经Cell Quest功能软件进行参数获取和数据分析。 1.4统计学方法采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，相关性采用直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果2.1两组T细胞及Treg细胞的表达情况比较观察组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的表达明显低于对照组，组间比较差异有统计学意义（P<0.01）；而Treg细胞的表达则明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。
2.2观察组CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+T细胞和Treg细胞与复发次数的相关性分析观察组CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+的表达水平与患者的复发次数无显著相关性（r=0.555，P=0.352；r=-0.319，P=0650；r=0.239，P=0.284）；Treg的表达水平与患者的复发次数呈显著正相关（r=0.612，P=0.002）。3讨论细胞免疫是免疫活性T淋巴细胞所介导的一系列免疫应答和免疫调节功能。免疫活性T淋巴细胞可分为CD4和CD8两个亚群，CD4 T细胞亚群根据它们细胞因子分泌模式和效应子功能的不同又可极化为两个亚群，即Th1和Th2细胞。研究发现，CA患者外周血有CD4和CD8细胞亚群数目及比例异常，并有Th1和Th2型细胞因子分泌异常，表达倾向于向Th2偏移[5～7]。Th2介导的细胞免疫功能障碍可能是HPV感染后病毒持久存在并复制致尖锐湿疣治疗后反复复发的病理基础[5～7]。
前期的研究显示CA患者的体液免疫缺陷[8，9]，但关于CA患者的细胞免疫功能的研究比较少。本研究旨在探讨复发性CA患者细胞免疫水平，结果显示，CD4+、CD8+细胞水平及CD4+/ CD8+的比值明显低于对照组，提示CA患者细胞免疫功能低下，机体免疫监测功能减低，HPV病毒复制，临床表现为疣状赘生物持续生长，本研究结果与黄永华等[4]的研究结果基本一致。Treg细胞是一类控制体内自身免疫反应的T细胞亚群。机体对抗原的免疫应答是一把双刃剑，反馈调节达到阴阳平衡，一方面清除有害抗原，另一方面又可造成机体损伤[10]。免疫平衡需要完善的调节机制。Treg细胞对维持机体免疫耐受和免疫应答稳态具有非常重要的作用，可以通过一系列机制抑制过强的免疫应答，使得机体在自身损伤最小的情况下有效地清除抗原或病原体。本研究显示复发性CA患者外周血Treg的表达水平明显高于健康对照组，提示机体受到HPV病毒感染时，体内T细胞向Treg细胞分化明显加强，产生更多的Treg细胞来清除病毒。复发性CA患者CD4+、CD8+细胞水平下降，而Treg升高，这种免疫机理可能与病毒刺激机体诱导免疫反应过程中，免疫正应答与潜在免疫耐受诱导同时共存。
本研究结果显示，CD4+、CD8+细胞水平及CD4+/ CD8+的比值与患者的复发次数无显著相关性，但Treg细胞表达水平与患者的复发次数呈显著的正相关，即复发次数越多，Treg细胞水平越高，提示尖锐湿疣患者在首发时检测Treg细胞表达水平可判断预后，对于高表达的患者给予更多的关注。黄永华等[4]的研究结果显示CA患者抑郁情绪发生率为48.6%；CA患者抑郁组CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+和NK细胞的水平明显低于非抑郁组，提示CA患者存在明显抑郁情绪并与个人及社会因素相关，且抑郁者细胞免疫功能更为低下。本研究结果结合前期研究，提示复发性CA患者除了给予常规的物理、药物治疗外，还需要缓解患者的抑郁情绪，有助于提高机体细胞免疫功能，减少CA的复发。参考文献[1] 李嘉彦，罗育武，杨日东，等.复发性尖锐湿疣患者 HPV 感染模式和细胞免疫功能的分析[J].皮肤性病诊疗学杂志，2014，21（3）：197200.
[2] 李雪芽，肖艳，曾抗，等.尖锐湿疣防治药物的研究进展[J].皮肤性病诊疗学杂志，2013，20（1）：6668.
[3] 韩凯，曾抗.尖锐湿疣的细胞免疫研究进展[J].皮肤性病诊疗学杂志，2011，18（4）：279282.
[4] 黄永华，李其林，盛文婷，等.尖锐湿疣患者抑郁情绪和CD4+、CD8+以及NK细胞相关性研究[J].广东医学，2010，31（22）：29412943.
[5] Mosmann TR，Sad S.The expanding universe of Tcell subsets：Th1，Th2 and more[J].Immunol Today，1996，17（3）：138146.
[6] Romagnani S.The Th1/Th2 paradigm[J].Immunol Today，1997，18（6）：263266.
[7] Romani L，Puccetti P.Immune regulation and tolerance to fungi in the lungs and skin[J].Chem Immunol Allergy，2008，94：124137.
[8] 刘琼芬，胡斌.白细胞介素4及血管内皮生长因子在尖锐湿疣组织中的定量表达[J].广东医学，2009，30（4）：598600.
[9] 伍金妹，侯宜金.不同方法治疗女性尖锐湿疣138例临床分析[J].现代医院，2011，11（6）：6061.
[10] 王振华，杨芳红，孙怡，等.卡介菌多糖核酸对尖锐湿疣患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的影响[J].中华皮肤科杂志，2014，47（9）：665666.