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摘要：参照GenBank中登录的牛肠道病毒（BEV）全基因组序列，针对其3D基因设计合成了1对特异性引物，提取病毒RNA，逆转录为cDNA，进行PCR扩增，经条件优化，建立了BEV的RT-PCR检测方法，并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示，该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段；且对牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BCoV）等相关病毒均无交叉反应；其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测，21份为阳性，阳性检出率为25%。
关键词：牛肠道病毒；3D基因；RT-PCR；检测
中图分类号：S852.65+3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0013-04
牛肠道病毒（Bovine enterovirus， BEV）属于小RNA病毒科、肠道病毒属，呈球形，大小为25～30 nm，是无囊膜单股正链RNA病毒[1]。自1959年Moll和Davis[2]首次分离到BEV以来，很多国家和地区先后报道了牛肠道病毒的感染情况[3～5]。肠道病毒是脊椎动物肠道中原有的栖居者，可以从患肠道疾病、肺炎、呼吸系统疾病和生殖障碍疾病的牛分泌物或排泄物中分离获得，也可以从正常牛的粪便样品中分离，还存在于牛粪便污染的环境或水体中，常作为粪便污染指示剂[6]。
据研究报道，牛肠道病毒在国外牛群中的阳性率约为17.6%～80%[7]，而在我国，有关此病的病原学及流行病学调查的报道很少。近年来，山东省周边某些牛场发生了以水样和血便等严重腹泻为特征的疾病，致使奶牛的食欲和产奶量大幅下降。本研究结合本实验室分离获得的牛肠道病毒基因和GenBank登录的牛肠道病毒全基因组序列，针对其3D基因的相对保守区域，设计1对特异性引物，建立了牛肠道病毒的RT-PCR检测方法，并初步应用于临床送检样本的检测，具有较好的敏感性和特异性，为国内牛肠道病毒的临床检测及流行病学监测提供了有力支持。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1毒株和样品来源病料样品为山东省某牛场发生腹泻症状的病牛粪便。BVDV Oregon C24V 病毒株购自中国兽医药品监察所；牛肠道病毒（BEV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BcoV）、MDBK正常细胞等均由山东省农业科学院奶牛研究中心保存。临床组织样品来自牛场送检的疑似发病样品，共84份，主要包括血液、粪便、淋巴结、肠等。
1.1.2主要试剂生理盐水、青霉素、链霉素购自Hyclone公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；rTaq DNA 聚合酶、dNTP、RNA酶抑制剂、DNA Marker DL2000购自宝生物工程（大连） 有限公司。
1.2试验方法
1.2.1引物的设计与合成根据GenBank已登录的BEV K2577株（AF123432）、SL305株（AF123433）、VG-5-27株（NC_001859）等毒株的全序列，分析BEV 3D基因的保守区，设计引物BEVF：5′GAGCCCAGTGTTTTCTTTGATGTTTTC3′和BEVR： 5′AAAGTTGATCAATAAAGTGCTTGCA3′，扩增片段大小为732 bp。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，稀释成20 μmol/L，-20℃保存。
1.2.2病料处理将病料按1∶5加入灭菌生理盐水研磨，经反复冻融后，按每毫升加入青霉素、链霉素各1 000单位，以3 000 r/min离心20 min，取上清液用于试验或-70℃保存备用。
1.2.3病毒RNA的提取取200 μl病料处理液，按EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书进行操作。
1.2.4反转录合成cDNA将提取的RNA按照 TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书进行反转录合成cDNA。
1.2.5RT-PCR检测方法的建立以反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，对PCR 反应体系（模板、酶、引物、镁离子、dNTPs的浓度）、反应条件（变性、退火、延伸的温度及循环次数）进行调整优化，确定最佳PCR反应条件。
1.2.6RT-PCR 特异性试验应用建立的RT-PCR方法分别对BEV、BVDV、IBRV、BCoV、BRV、MDBK正常细胞进行检测，验证该检测方法的特异性。
1.2.7病毒的培养选择细胞形态良好的MDBK单层细胞，弃去营养液后用PBS清洗细胞。按照1%的细胞培养量接种病料处理液，于37℃感作1 h，弃去感作液，加入维持液（2%新生马血清的DMEM），于5%CO2、37℃培养，12 h观察细胞病变，培养24 h后收毒。细胞培养毒反复冻融3次后再次接种易感细胞，如此传3代，收获的细胞毒用于其他试验[8]。以未接毒的MDBK细胞为对照。
1.2.8RT-PCR敏感性试验将BEV RNA进行10倍梯度稀释后，分别取10 μl进行反转录，然后进行PCR扩增，验证该检测方法的敏感性。
1.2.9临床样本的检测应用优化建立的牛肠道病毒RT-PCR检测方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测，将检出的阳性样本RT-PCR扩增产物分别送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，进一步验证该方法的特异性。
2结果与分析
2.1RT-PCR扩增及鉴定 对临床发生严重腹泻的病牛粪便样本处理后，提取病毒RNA，逆转录为cDNA，进行PCR扩增。经优化，建立了最佳的PCR反应体系： 10×PCR Buffer（MgCl2 Plus） 3 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μl，BEV-F （20 μmol/L） 0.5 μl，BEV-R（20 μmol/L） 0.5 μl，rTaq （5 U/μl） 0.25 μl，cDNA 2 μl，RNA/DNA-Free Water 19.75 μl，总体积30 μl；PCR最佳反应条件为94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，31个循环。
利用该体系扩增获得了约732 bp的目的片段（图1），与预期相符。将PCR扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果进行BLAST比对分析。结果表明，扩增片段与GenBank中收录的BEV VG-5-27株部分3D基因的同源性达82%。
3讨论
牛肠道病毒（BEV）可以导致牛发生多种综合征，为及时减轻该病毒对奶牛生产性能的影响，建立快速、有效的检测方法是非常有必要的。目前已报道的BEV检测技术主要有电镜检查、病毒分离、血清学试验和TaqMan荧光定量PCR等，这些方法存在使用的仪器设备昂贵，试验周期长，耗费人力、物力等缺点[9～11]，因此，迫切需要建立一种快速、敏感、特异的检测方法来解决生产实际中的问题。
近年随着PCR诊断技术的建立及广泛应用，许多研究者已经将PCR技术应用于多种病毒性疾病的检测，并且取得了一定的成绩[12]。肠道病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，本研究建立的RT-PCR检测方法主要基于3D基因的相对保守序列设计引物，用该方法检测BEV，可以检测出10-1TCID50的BEV样品，敏感性高于病毒分离法；同时具有良好的特异性，检测BVDV、IBRV、BRV、BCoV、MDBK细胞等均为阴性；且病毒样品RNA的提取、反转录到PCR扩增以及电泳检测，全部过程用时较短，可方便快捷地诊断出BEV感染，适合大规模推广应用。
利用该RT-PCR方法对山东省送检的84份临床疑似发病牛样品进行检测，共检出21份阳性，阳性检出率为25%，表明牛肠道病毒感染在我国部分地区的牛群中普遍存在，且危害相当严重。随机选取4个阳性样品进行测序，结果也证实为BEV，进一步表明该方法具有较高的敏感性和特异性。该RT-PCR方法不仅可用于BEV的实验室检测或诊断，还可用于BEV的流行病学调查及监测等，为BEV的防控奠定了基础。
参考文献：
[1]Knipe D M， Howley P M. Fields Virology[M].5th Edition.Philadelphia：Lippincott Williams & Wilkins， 2007：1649-1724.
[2]Moll T， Davis A D. Isolation and characterization of cytopathogenic enteroviruses from cattle with respiratory disease[J]. Am. J. Vet. Res.， 1959， 20：27-32.
[3]Shaukat S， Angez M， Alam M M， et al. Molecular identification and characterization of a new type of bovine enterovirus[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2012， 78（12）：4497-4500.
[4]彭小薇，董浩，吴丹， 等.牛肠道病毒2型的分离与鉴定[J].畜牧兽医学报， 2013， 44（5）：823-828.
[5]McClenahan S D， Scherba G， Borst L， et al. Discovery of a bovine enterovirus in alpaca[J]. PLoS One， 2013， 8（8）： e68777.
[6]Ley V， Higgins J， Fayer R. Bovine enteroviruses as indicators of fecal contamination [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2002， 68（7）：3455-3461.
[7]Gür S， Yapkic O， Yilmaz A. Serological survey of bovine enterovirus type 1 in different mammalian species in Turkey [J].Zoonoses Public Health，2008， 55（2）：106-111.
[8]侯佩莉，王洪梅，杨盛华， 等.牛肠道病毒山东分离株的分离鉴定及序列分析[C].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集. 2013：1027-1030.
[9]吴丹，吴涛，张鹤晓， 等.牛肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2012， 11（34）：903-906.
[10]Zhang A Q， Smith J R， Burgess G W. A capture antibody ELISA for detection of antibodies against bovine enterovirus [J].J.Virol.Methods，1989，12（1-2）：223-226.
[11]Jimenez-Clavero M A， Escribano-Romero E， Mansilla C， et al. Survey of bovine enterovirus in biological and environmental samples by a highly sensitive real-time reverse transcription-PCR[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2005， 71（7）：3536-3543.
[12]Beld M， Minnaar R， Weel J， et al. Highly sensitive assay for detection of enterovirus in clinical specimens by reverse transcription-PCR with an armored RNA internal control[J]. J. Clin. Microbiol.， 2004，42（7）：3059-3064.
关键词：牛肠道病毒；3D基因；RT-PCR；检测
中图分类号：S852.65+3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0013-04
牛肠道病毒（Bovine enterovirus， BEV）属于小RNA病毒科、肠道病毒属，呈球形，大小为25～30 nm，是无囊膜单股正链RNA病毒[1]。自1959年Moll和Davis[2]首次分离到BEV以来，很多国家和地区先后报道了牛肠道病毒的感染情况[3～5]。肠道病毒是脊椎动物肠道中原有的栖居者，可以从患肠道疾病、肺炎、呼吸系统疾病和生殖障碍疾病的牛分泌物或排泄物中分离获得，也可以从正常牛的粪便样品中分离，还存在于牛粪便污染的环境或水体中，常作为粪便污染指示剂[6]。
据研究报道，牛肠道病毒在国外牛群中的阳性率约为17.6%～80%[7]，而在我国，有关此病的病原学及流行病学调查的报道很少。近年来，山东省周边某些牛场发生了以水样和血便等严重腹泻为特征的疾病，致使奶牛的食欲和产奶量大幅下降。本研究结合本实验室分离获得的牛肠道病毒基因和GenBank登录的牛肠道病毒全基因组序列，针对其3D基因的相对保守区域，设计1对特异性引物，建立了牛肠道病毒的RT-PCR检测方法，并初步应用于临床送检样本的检测，具有较好的敏感性和特异性，为国内牛肠道病毒的临床检测及流行病学监测提供了有力支持。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1毒株和样品来源病料样品为山东省某牛场发生腹泻症状的病牛粪便。BVDV Oregon C24V 病毒株购自中国兽医药品监察所；牛肠道病毒（BEV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BcoV）、MDBK正常细胞等均由山东省农业科学院奶牛研究中心保存。临床组织样品来自牛场送检的疑似发病样品，共84份，主要包括血液、粪便、淋巴结、肠等。
1.1.2主要试剂生理盐水、青霉素、链霉素购自Hyclone公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；rTaq DNA 聚合酶、dNTP、RNA酶抑制剂、DNA Marker DL2000购自宝生物工程（大连） 有限公司。
1.2试验方法
1.2.1引物的设计与合成根据GenBank已登录的BEV K2577株（AF123432）、SL305株（AF123433）、VG-5-27株（NC_001859）等毒株的全序列，分析BEV 3D基因的保守区，设计引物BEVF：5′GAGCCCAGTGTTTTCTTTGATGTTTTC3′和BEVR： 5′AAAGTTGATCAATAAAGTGCTTGCA3′，扩增片段大小为732 bp。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，稀释成20 μmol/L，-20℃保存。
1.2.2病料处理将病料按1∶5加入灭菌生理盐水研磨，经反复冻融后，按每毫升加入青霉素、链霉素各1 000单位，以3 000 r/min离心20 min，取上清液用于试验或-70℃保存备用。
1.2.3病毒RNA的提取取200 μl病料处理液，按EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书进行操作。
1.2.4反转录合成cDNA将提取的RNA按照 TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书进行反转录合成cDNA。
1.2.5RT-PCR检测方法的建立以反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，对PCR 反应体系（模板、酶、引物、镁离子、dNTPs的浓度）、反应条件（变性、退火、延伸的温度及循环次数）进行调整优化，确定最佳PCR反应条件。
1.2.6RT-PCR 特异性试验应用建立的RT-PCR方法分别对BEV、BVDV、IBRV、BCoV、BRV、MDBK正常细胞进行检测，验证该检测方法的特异性。
1.2.7病毒的培养选择细胞形态良好的MDBK单层细胞，弃去营养液后用PBS清洗细胞。按照1%的细胞培养量接种病料处理液，于37℃感作1 h，弃去感作液，加入维持液（2%新生马血清的DMEM），于5%CO2、37℃培养，12 h观察细胞病变，培养24 h后收毒。细胞培养毒反复冻融3次后再次接种易感细胞，如此传3代，收获的细胞毒用于其他试验[8]。以未接毒的MDBK细胞为对照。
1.2.8RT-PCR敏感性试验将BEV RNA进行10倍梯度稀释后，分别取10 μl进行反转录，然后进行PCR扩增，验证该检测方法的敏感性。
1.2.9临床样本的检测应用优化建立的牛肠道病毒RT-PCR检测方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测，将检出的阳性样本RT-PCR扩增产物分别送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，进一步验证该方法的特异性。
2结果与分析
2.1RT-PCR扩增及鉴定 对临床发生严重腹泻的病牛粪便样本处理后，提取病毒RNA，逆转录为cDNA，进行PCR扩增。经优化，建立了最佳的PCR反应体系： 10×PCR Buffer（MgCl2 Plus） 3 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μl，BEV-F （20 μmol/L） 0.5 μl，BEV-R（20 μmol/L） 0.5 μl，rTaq （5 U/μl） 0.25 μl，cDNA 2 μl，RNA/DNA-Free Water 19.75 μl，总体积30 μl；PCR最佳反应条件为94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，31个循环。
利用该体系扩增获得了约732 bp的目的片段（图1），与预期相符。将PCR扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果进行BLAST比对分析。结果表明，扩增片段与GenBank中收录的BEV VG-5-27株部分3D基因的同源性达82%。
3讨论
牛肠道病毒（BEV）可以导致牛发生多种综合征，为及时减轻该病毒对奶牛生产性能的影响，建立快速、有效的检测方法是非常有必要的。目前已报道的BEV检测技术主要有电镜检查、病毒分离、血清学试验和TaqMan荧光定量PCR等，这些方法存在使用的仪器设备昂贵，试验周期长，耗费人力、物力等缺点[9～11]，因此，迫切需要建立一种快速、敏感、特异的检测方法来解决生产实际中的问题。
近年随着PCR诊断技术的建立及广泛应用，许多研究者已经将PCR技术应用于多种病毒性疾病的检测，并且取得了一定的成绩[12]。肠道病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，本研究建立的RT-PCR检测方法主要基于3D基因的相对保守序列设计引物，用该方法检测BEV，可以检测出10-1TCID50的BEV样品，敏感性高于病毒分离法；同时具有良好的特异性，检测BVDV、IBRV、BRV、BCoV、MDBK细胞等均为阴性；且病毒样品RNA的提取、反转录到PCR扩增以及电泳检测，全部过程用时较短，可方便快捷地诊断出BEV感染，适合大规模推广应用。
利用该RT-PCR方法对山东省送检的84份临床疑似发病牛样品进行检测，共检出21份阳性，阳性检出率为25%，表明牛肠道病毒感染在我国部分地区的牛群中普遍存在，且危害相当严重。随机选取4个阳性样品进行测序，结果也证实为BEV，进一步表明该方法具有较高的敏感性和特异性。该RT-PCR方法不仅可用于BEV的实验室检测或诊断，还可用于BEV的流行病学调查及监测等，为BEV的防控奠定了基础。
参考文献：
[1]Knipe D M， Howley P M. Fields Virology[M].5th Edition.Philadelphia：Lippincott Williams & Wilkins， 2007：1649-1724.
[2]Moll T， Davis A D. Isolation and characterization of cytopathogenic enteroviruses from cattle with respiratory disease[J]. Am. J. Vet. Res.， 1959， 20：27-32.
[3]Shaukat S， Angez M， Alam M M， et al. Molecular identification and characterization of a new type of bovine enterovirus[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2012， 78（12）：4497-4500.
[4]彭小薇，董浩，吴丹， 等.牛肠道病毒2型的分离与鉴定[J].畜牧兽医学报， 2013， 44（5）：823-828.
[5]McClenahan S D， Scherba G， Borst L， et al. Discovery of a bovine enterovirus in alpaca[J]. PLoS One， 2013， 8（8）： e68777.
[6]Ley V， Higgins J， Fayer R. Bovine enteroviruses as indicators of fecal contamination [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2002， 68（7）：3455-3461.
[7]Gür S， Yapkic O， Yilmaz A. Serological survey of bovine enterovirus type 1 in different mammalian species in Turkey [J].Zoonoses Public Health，2008， 55（2）：106-111.
[8]侯佩莉，王洪梅，杨盛华， 等.牛肠道病毒山东分离株的分离鉴定及序列分析[C].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集. 2013：1027-1030.
[9]吴丹，吴涛，张鹤晓， 等.牛肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2012， 11（34）：903-906.
[10]Zhang A Q， Smith J R， Burgess G W. A capture antibody ELISA for detection of antibodies against bovine enterovirus [J].J.Virol.Methods，1989，12（1-2）：223-226.
[11]Jimenez-Clavero M A， Escribano-Romero E， Mansilla C， et al. Survey of bovine enterovirus in biological and environmental samples by a highly sensitive real-time reverse transcription-PCR[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2005， 71（7）：3536-3543.
[12]Beld M， Minnaar R， Weel J， et al. Highly sensitive assay for detection of enterovirus in clinical specimens by reverse transcription-PCR with an armored RNA internal control[J]. J. Clin. Microbiol.， 2004，42（7）：3059-3064.