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摘要[目的]建立枳壳离体培养再生体系。[方法]采用均匀设计研究了不同时期枳壳茎尖、 茎段、芽的愈伤组织诱导、增殖、分化、及生根情况。[结果]愈伤组织诱导率及生长量由高到低为春梢> 夏梢>秋梢>冬梢；不同时期外植体诱导愈伤组织所需生长调节物质种类、浓度、配比不同，佳。[结论] 为枳壳快速繁殖、脱毒技术和相关细胞工程的研究奠定基础。
关键词枳壳；离体培养；均匀设计
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）21-06934-03
Study on the Establishment of Regeneration System of Poncirus trifoliate（L.） Raf by Uniform Design
GUO Yanjun， JI Qianhua et al（Department of Biology， Fruit Tree Research Institute， Zhaoqing University， Zhaoqing， Guangdong 526061）
Abstract[Objective] The aim was to study the establishment of regeneration system of Poncirus trifoliate（L.） Raf.[ Method]A regeneration method via callus was established in which uniform design was employed in the experimentation. Induction rate and quantity of callus were influenced by the types of explants. [Result]Callus were induced satisfactorily with spring shoots cultured in MT medium supplemented with NAA 0.2 mg/L， 2.4D 0.5 mg/L， KT 0.2 mg/L and IBA 0.1 mg/L and summer shoots in MT mediuin supplemented with NAA 0.2 mg/L， 2，4D 4.5 mg/L， KT 0.2 mg/L and IBA 0.1 mg/L. The calluses underwent good proliferation in MT medium supplied 6BA 0.25 mg/L and NAA 0.2 mg/L. MT medium with 6BA 0.25 mg/L and IBA 0.3 mg/L was favourable for redifferentiation and 1/2MT medium with NAA 4 mg/L resulted in the formation of strong roots.[Conclusion] The study laid foundation for rapid seedling breeding， detoxification technology.
Key words Tissue culture； Uniform design； Poncirus trifoliate（L.） Raf
基金项目肇庆学院柑橘产业技术应用与创新团队建设项目；肇庆市科技计划项目（2012N001）；肇庆学院协调创新基地建设项目（201401）。
作者简介郭雁君（1973-），男，山西左云人，讲师，硕士，从事遗传育种研究。通讯作者，教授，博士，从事果树学研究。
收稿日期20140423枳壳（Poncirus trifoliata（L.） Raf） 为芸香科植物，其幼果及近成熟果实入药，具有行气、散结、消痰、除痞的功效。枳壳是柑橘中很好的砧木，能使树体前期矮化，早结、丰产、优质，且抗脚腐病、流胶病和抗线虫。枳壳也是广东省肇庆地区主栽柑橘品种砂糖橘和贡柑的首选砧木品种。枳壳通过实生播种繁育，具有繁殖率低、出苗不整齐和受季节限制等缺点。利用组织培养进行快速繁殖可克服常规方法的缺点，且在无病毒苗木繁育技术体系中，同样需要利用枳壳的无菌苗作为茎尖微嫁接的砧木材料。枳壳组织培养研究工作主要是砧木实生苗的快繁技术，通过对茎尖、剥去种皮的种子、花药和枳根分生组织等的离体培养，得到再生植株；对枳胚珠、上胚轴等外植体进行培养，诱导出胚状体和愈伤组织[1-4]。笔者运用均匀设计[5]，探讨了在离体培养条件下不同取材时期、不同取材部位枳壳外植体的愈伤组织诱导、增殖、分化及生根情况，旨在建立枳壳离体培养再生体系，为枳壳快速繁殖、脱毒技术和相关细胞工程的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料 供试材料为枳壳6年生实生树的春梢（茎尖、茎段）、夏梢（茎尖、茎段）、秋梢（茎尖、茎段）和冬梢上含芽茎段。
1.2试验方法
2.2愈伤组织的继代培养和增殖
3结论与讨论
研究表明，用枳壳花药、离体胚珠等作外殖体，可以诱导产生愈伤组织[1]，该研究采用枳壳春梢、夏梢和秋梢的茎尖、茎段以及冬梢带芽的茎段为外植体，同样诱导产生愈伤组织。多数植物组织（器官） 皆可在人工控制的条件下诱导产生愈伤组织，但不同取材部位对诱导愈伤组织的适应性不同，同样影响愈伤组织的器官发生能力。该研究结果表明，枳壳春梢、夏梢茎段易产生愈伤组织，其中产生的致密、绿色、 瘤状愈伤组织的器官发生能力较强，同时因取材受季节性影响小，取材容易，数量大等优点，在诱导愈伤组织的应用中较之花药、胚珠等外植体材料具有广泛的实用价值，且可以利用器官发生能力强的愈伤组织进行再分化研究。 愈伤组织的诱导、增殖主要受外植体、培养基和培养环境三大因素的调控，培养基种类和成分的研究以生长调节物质研究的最多，诱导和保持愈伤组织生长所需生长调节物质的种类、浓度及比例与外植体本身的生理状态及对生长调节物质的敏感性有密切的关系[6]，这在该试验中得到充分的验证。
愈伤组织的不定芽及不定根的发生是植株再生的重要途径。 愈伤组织类型、 培养基成分均对不定芽的发生有影响。该研究结果表明，枳壳愈伤组织中以致密、绿色、瘤状愈伤组织的分化能力强。通过最优分析获得了分化培养生长调节因子的最优配方。 一般细胞分裂素在愈伤组织分化培养中起重要作用，而生长素的作用则随植物材料的不同而不同， 通常在一些植物中细胞分裂素与生长素的适当比例有利于不定芽的产生。
芽的分化具有更明显的促进作用。
同大多数植物相似，在枳壳上生长素的作用在不定根的发生中也起关键性作用， 基本培养基中无机盐浓度的降低有利于生根。研究表明，在不含激素的培养基上枳壳无根苗即可形成不定根[7]， 该试验结果与其相反，在无激素的MT或1/2MT培养基上， 枳壳无菌苗愈伤化，而在1/2MT+4 mg/L NAA培养基上产生的不定根短而粗壮。陈力耕[7]在添加10-5 mol/L NAA培养基上经过15～20 d即发根成苗。但该试验中枳壳组织培养物的生根仍存在问题，不定根的发生需经过一次继代培养后，才能达2～3 cm长，生根较慢，生根培养的条件仍需进一步的摸索。
均匀设计在五味子、柴胡、西瓜等的组织培养中已有应用[8-10]，但在柑橘以及砧木上较少，该试验运用均匀设计方法考虑了多种生长调节物质对枳壳愈伤组织诱导、增殖、分化的作用，并通过回归分析给出了定量方程，通过最优分析预测了优化配方。均匀设计的特点是试验点在试验范围内充分“均匀分散”，每个因素每个水平只进行一次试验且试验次数与水平数相等，可以以较少的试验次数研究多因素多水平的问题。以4因素6水平为例，正交设计要72次试验而均匀设计仅需6次试验，大大减少了试验次数，提高了工作效率，降低了试验成本。在组织培养研究中，特别是生长调节物质作用的研究中，需要研究的生长调节物质种类和水平往往较多，降低试验的复杂性对组培研究具有实际意义。该试验通过6因素10水平较全面地考察了各因素对愈伤组织诱导作用的显著程度，因水平设置多且范围较宽， 能较准确、较容易地确定生长调节剂的作用水平范围，而避免了多次试验，取得了较好的效果。
参考文献
[1] 张进仁.枳胚珠的离体繁殖[J].中国柑桔，1985（1）：22-23.
[2] 赵惠祥，黄启风.枳壳花药离体培养分化出单倍体植株[J].国外农学（果树），1981（2）：43-44.
[3] 贺红.枳壳组织培养和植株再生研究[J].中草药，1998，29（12）：824-825.
[4] 杨春霞，朱培林，黄小春.中药“枳壳”的组织培养与植株再生[J].亚热带植物科学，2009，38（1）：66.
[5] 方开泰.均匀设计-数论方法在试验设计中的应用[J].应用数学学报，1980，3（4）：363-372.
[6] 马燕，韩瑞超，臧德奎，等.木本观赏植物组织培养研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（4）：1956-1958，2023 .
[7] 陈力耕.柑桔实生苗大量增殖研究[J].亚热带植物通讯，1990（2）：40-45.
[8] 张佳，金东淳，金海林，等.均匀设计法优化北五味子愈伤组织诱导培养基研究[J].安徽农业科学，2011，39（12）：6977-6978，6987.
[9] 张东向，徐爽，史绍林，等.不同激素配比对三岛柴胡悬浮细胞生长发育的影响[J].安徽农业科学，2012，40（26）：12864-12865，12895.
[10] 刘丽敏，刘红坚，余坤兴.甘蔗新品种桂糖02-1156均匀设计组培快繁[J].中国糖料，2014（1）：8-11.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（21）：6941，6977
关键词枳壳；离体培养；均匀设计
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）21-06934-03
Study on the Establishment of Regeneration System of Poncirus trifoliate（L.） Raf by Uniform Design
GUO Yanjun， JI Qianhua et al（Department of Biology， Fruit Tree Research Institute， Zhaoqing University， Zhaoqing， Guangdong 526061）
Abstract[Objective] The aim was to study the establishment of regeneration system of Poncirus trifoliate（L.） Raf.[ Method]A regeneration method via callus was established in which uniform design was employed in the experimentation. Induction rate and quantity of callus were influenced by the types of explants. [Result]Callus were induced satisfactorily with spring shoots cultured in MT medium supplemented with NAA 0.2 mg/L， 2.4D 0.5 mg/L， KT 0.2 mg/L and IBA 0.1 mg/L and summer shoots in MT mediuin supplemented with NAA 0.2 mg/L， 2，4D 4.5 mg/L， KT 0.2 mg/L and IBA 0.1 mg/L. The calluses underwent good proliferation in MT medium supplied 6BA 0.25 mg/L and NAA 0.2 mg/L. MT medium with 6BA 0.25 mg/L and IBA 0.3 mg/L was favourable for redifferentiation and 1/2MT medium with NAA 4 mg/L resulted in the formation of strong roots.[Conclusion] The study laid foundation for rapid seedling breeding， detoxification technology.
Key words Tissue culture； Uniform design； Poncirus trifoliate（L.） Raf
基金项目肇庆学院柑橘产业技术应用与创新团队建设项目；肇庆市科技计划项目（2012N001）；肇庆学院协调创新基地建设项目（201401）。
作者简介郭雁君（1973-），男，山西左云人，讲师，硕士，从事遗传育种研究。通讯作者，教授，博士，从事果树学研究。
收稿日期20140423枳壳（Poncirus trifoliata（L.） Raf） 为芸香科植物，其幼果及近成熟果实入药，具有行气、散结、消痰、除痞的功效。枳壳是柑橘中很好的砧木，能使树体前期矮化，早结、丰产、优质，且抗脚腐病、流胶病和抗线虫。枳壳也是广东省肇庆地区主栽柑橘品种砂糖橘和贡柑的首选砧木品种。枳壳通过实生播种繁育，具有繁殖率低、出苗不整齐和受季节限制等缺点。利用组织培养进行快速繁殖可克服常规方法的缺点，且在无病毒苗木繁育技术体系中，同样需要利用枳壳的无菌苗作为茎尖微嫁接的砧木材料。枳壳组织培养研究工作主要是砧木实生苗的快繁技术，通过对茎尖、剥去种皮的种子、花药和枳根分生组织等的离体培养，得到再生植株；对枳胚珠、上胚轴等外植体进行培养，诱导出胚状体和愈伤组织[1-4]。笔者运用均匀设计[5]，探讨了在离体培养条件下不同取材时期、不同取材部位枳壳外植体的愈伤组织诱导、增殖、分化及生根情况，旨在建立枳壳离体培养再生体系，为枳壳快速繁殖、脱毒技术和相关细胞工程的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料 供试材料为枳壳6年生实生树的春梢（茎尖、茎段）、夏梢（茎尖、茎段）、秋梢（茎尖、茎段）和冬梢上含芽茎段。
1.2试验方法
2.2愈伤组织的继代培养和增殖
3结论与讨论
研究表明，用枳壳花药、离体胚珠等作外殖体，可以诱导产生愈伤组织[1]，该研究采用枳壳春梢、夏梢和秋梢的茎尖、茎段以及冬梢带芽的茎段为外植体，同样诱导产生愈伤组织。多数植物组织（器官） 皆可在人工控制的条件下诱导产生愈伤组织，但不同取材部位对诱导愈伤组织的适应性不同，同样影响愈伤组织的器官发生能力。该研究结果表明，枳壳春梢、夏梢茎段易产生愈伤组织，其中产生的致密、绿色、 瘤状愈伤组织的器官发生能力较强，同时因取材受季节性影响小，取材容易，数量大等优点，在诱导愈伤组织的应用中较之花药、胚珠等外植体材料具有广泛的实用价值，且可以利用器官发生能力强的愈伤组织进行再分化研究。 愈伤组织的诱导、增殖主要受外植体、培养基和培养环境三大因素的调控，培养基种类和成分的研究以生长调节物质研究的最多，诱导和保持愈伤组织生长所需生长调节物质的种类、浓度及比例与外植体本身的生理状态及对生长调节物质的敏感性有密切的关系[6]，这在该试验中得到充分的验证。
愈伤组织的不定芽及不定根的发生是植株再生的重要途径。 愈伤组织类型、 培养基成分均对不定芽的发生有影响。该研究结果表明，枳壳愈伤组织中以致密、绿色、瘤状愈伤组织的分化能力强。通过最优分析获得了分化培养生长调节因子的最优配方。 一般细胞分裂素在愈伤组织分化培养中起重要作用，而生长素的作用则随植物材料的不同而不同， 通常在一些植物中细胞分裂素与生长素的适当比例有利于不定芽的产生。
芽的分化具有更明显的促进作用。
同大多数植物相似，在枳壳上生长素的作用在不定根的发生中也起关键性作用， 基本培养基中无机盐浓度的降低有利于生根。研究表明，在不含激素的培养基上枳壳无根苗即可形成不定根[7]， 该试验结果与其相反，在无激素的MT或1/2MT培养基上， 枳壳无菌苗愈伤化，而在1/2MT+4 mg/L NAA培养基上产生的不定根短而粗壮。陈力耕[7]在添加10-5 mol/L NAA培养基上经过15～20 d即发根成苗。但该试验中枳壳组织培养物的生根仍存在问题，不定根的发生需经过一次继代培养后，才能达2～3 cm长，生根较慢，生根培养的条件仍需进一步的摸索。
均匀设计在五味子、柴胡、西瓜等的组织培养中已有应用[8-10]，但在柑橘以及砧木上较少，该试验运用均匀设计方法考虑了多种生长调节物质对枳壳愈伤组织诱导、增殖、分化的作用，并通过回归分析给出了定量方程，通过最优分析预测了优化配方。均匀设计的特点是试验点在试验范围内充分“均匀分散”，每个因素每个水平只进行一次试验且试验次数与水平数相等，可以以较少的试验次数研究多因素多水平的问题。以4因素6水平为例，正交设计要72次试验而均匀设计仅需6次试验，大大减少了试验次数，提高了工作效率，降低了试验成本。在组织培养研究中，特别是生长调节物质作用的研究中，需要研究的生长调节物质种类和水平往往较多，降低试验的复杂性对组培研究具有实际意义。该试验通过6因素10水平较全面地考察了各因素对愈伤组织诱导作用的显著程度，因水平设置多且范围较宽， 能较准确、较容易地确定生长调节剂的作用水平范围，而避免了多次试验，取得了较好的效果。
参考文献
[1] 张进仁.枳胚珠的离体繁殖[J].中国柑桔，1985（1）：22-23.
[2] 赵惠祥，黄启风.枳壳花药离体培养分化出单倍体植株[J].国外农学（果树），1981（2）：43-44.
[3] 贺红.枳壳组织培养和植株再生研究[J].中草药，1998，29（12）：824-825.
[4] 杨春霞，朱培林，黄小春.中药“枳壳”的组织培养与植株再生[J].亚热带植物科学，2009，38（1）：66.
[5] 方开泰.均匀设计-数论方法在试验设计中的应用[J].应用数学学报，1980，3（4）：363-372.
[6] 马燕，韩瑞超，臧德奎，等.木本观赏植物组织培养研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（4）：1956-1958，2023 .
[7] 陈力耕.柑桔实生苗大量增殖研究[J].亚热带植物通讯，1990（2）：40-45.
[8] 张佳，金东淳，金海林，等.均匀设计法优化北五味子愈伤组织诱导培养基研究[J].安徽农业科学，2011，39（12）：6977-6978，6987.
[9] 张东向，徐爽，史绍林，等.不同激素配比对三岛柴胡悬浮细胞生长发育的影响[J].安徽农业科学，2012，40（26）：12864-12865，12895.
[10] 刘丽敏，刘红坚，余坤兴.甘蔗新品种桂糖02-1156均匀设计组培快繁[J].中国糖料，2014（1）：8-11.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（21）：6941，6977