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摘 要：目的：比较不同条件培养基中变链菌标准株和LuxS基因突变株的生长差异，分析LuxS基因在变链菌硫代谢方面的功能。方法：采用营养补充实验在硫限定条件下培养两菌株并通过测定不同时期吸光度值来比较两者的生长差异。结果：加入半胱氨酸后突变株明显增长，但仍未及标准株水平;分别加入蛋氨酸及SAH后，突变株明显增长且达到标准株水平;当加入上清液后突变株有所增长并超过标准株水平;而加入SAM后两菌株的生长均降低。结论：LuxS基因在变链菌生长过程中发挥着重要的硫代谢作用。
关键词：变链菌;LuxS基因;硫代谢
变链菌（S.mutans） 是革兰氏阳性微需氧菌，在人类口腔微环境中占有重要的生态地位，是最重要的致龋菌[1]。有学者研究沙雷菌MR-1中LuxS的作用，结果显示LuxS突变株改变生物膜的形成，主要是通过干扰活性甲基周期（AMC）。LuxS蛋白为合成酶，它能合成LuxS系统的信号分子即AI-2信号分子[2]。本研究采用变链菌LuxS基因突变株，在硫限定条件下通过营养补充实验对标准株和突变株进行生长吸光度值的测定比较，以期为进一步研究打下基础。
1 材料和方法
1.1 菌株和培养基
变链菌（S.mutans）Ingbritt C （血清C型） 国际标准株，本实验室成功构建并保存的LuxS基因缺失突变株[3，4]，以下简称突变株。TSA固体培养基，TSA-Eymr固体培养基（加入红霉素至终浓度10?g/ml），牛心脑浸液BHI液体培养基。
1.2 主要试剂和仪器
蛋氨酸，半胱氨酸，SAM，SAH（sigma，美国），PBS缓冲液，标准株上清液（本实验室配置并保存），超净工作台，高速台式离心机，电热恒温水浴箱，隔水式恒温培养箱，紫外线可见光分光光度计（BECKMAN公司，美国），R200电子天平，进口96孔微量板。
1.3 实验方法
制备限定化学成分的条件培养基，在BHI液体培养基中分别加入半胱氨酸10mg/ml，蛋氨酸100μmol，SAM50mg/ml，SAH1mg/ml（sigma），10%标准株的无菌上清液。将两种菌株常规复苏，提纯鉴定为纯菌后，分别挑取单菌落转种于BHI液体培养基及BHI-Eymr液体培养基中，离心弃上清液，用PBS缓冲液混匀于紫外分光光度计600nm处调至A≈0.1备用。将已配制好的条件培养基一式六份每孔200μL加入到无菌96孔板中，以等量BHI液体培养基为空白对照组，在各种条件培养基中分别加入100μL两种菌株菌悬液，一式三份。厌氧条件下培养24h，48h后于紫外分光光度计600nm处测定吸光度值A并分别记录下来。
统计学分析应用SPSS13.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，两组间计量资料的比较采用t检验，P < 0.05有统计学意义。
2 结果
从表中可看出，加入半胱氨酸后突变株吸光度（A）明显增长，但仍未恢复至标准株水平（P < 0.05）;分别加入蛋氨酸及SAH后，突变株明显增长且达到标准株水平;当加入上清液时后突变株吸光度（A）有所增长并超过标准株水平（P < 0.05）;而加入SAM后两菌株均降低，生长受到明显抑制。
3 讨论
本实验通过加入标准株上清液发现突变株的生长吸光度值增长，弥补了因LuxS基因缺失引起的AI-2的表达缺陷，这与Yoshida等研究者们的发现类似。
通过外源性加入一定浓度的蛋氨酸及SAH培养24h后能部分弥补突变株的生长，48h后甚至超过标准株生长水平，这可能与LuxS基因缺失后干扰了AMC，突变株失去利用高半胱氨酸和潜在参与甲基化反应的能力相关[4]。已有研究证实LuxS基因在鼠李糖乳杆菌GG中发挥了重要的硫代谢功能，其基因序列表明LuxS是与硫氨酸代谢相关的主要代谢酶。在AMC中，蛋氨酸是细胞内生成甲基和循环利用高半胱氨酸的关键代谢物[5]，LuxS缺失使作为唯一硫源的蛋氨酸生成能力降低。营养补充实验表明LuxS基因缺失是造成变链菌代谢缺陷的原因，加入一定半胱氨酸可以不同程度补偿突变株的生长缺陷，添加该成分刺激突变株生长是由于LuxS基因缺失导致了变链菌对代谢循环中更多营养必需物质的需要。通过补充AMC中相关的代谢物对两菌株生长状况的分析表明LuxS在变链菌生长过程中发挥着重要的硫代谢作用。在本研究中，当加入一定浓度的SAM时，两菌株的生长受到抑制可能是由于外源性加入SAM不能渗透到变链菌细胞内，而LuxS基因缺失引起了SAM在细胞间积累加强，在其他菌种中还未见相关报道，其机制还有待于进一步研究。
参考文献：
[1]SHARMA A， AGARWAL N， ANAND A，et al. To compare the effectiveness of different mouthrinses on Streptococcus mutans count in caries active children[J].J Oral Biol Craniofac Res，2018 ，8（2）：113-117.
[2]ZHENG H M，MAO Y L，ZHU Q C，et al.The quorum sensing regulator CinR hierarchically regulates two other quorum sensing pathways in ligand-dependent and-independent fashions in Rhizobium etli[J].J Bacterial，2015，197（9）：1573-1581.
[3]张耀超，韩育植，韩福胜.变异链球菌LuxS基因缺陷突变株的构建及其生物膜结构的初步观察研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2012，22（6）：309-313.
[4]Bodor，A，B.Elxnat，Thiel V，et al.Wagner-Dobler I Potential for LuxS related signaling in marine bacteria and production of autoinducer-2 in the genus Shewanella[J].BMC Microbiol 2008，8：13.
[5]Deric R.Learman，Haakrho Yi，Steven D.Brown，et，al.Involvement of Shewanella oneidensis MR-1 LuxS in Biofilm Development and Sulfur Metabolism.[J].Appl Environ Microbiol.2009，75（5）：1301-1307.
基金項目：
陕西省教育厅专项科研计划项目， （项目编号： 18JK0656）
关键词：变链菌;LuxS基因;硫代谢
变链菌（S.mutans） 是革兰氏阳性微需氧菌，在人类口腔微环境中占有重要的生态地位，是最重要的致龋菌[1]。有学者研究沙雷菌MR-1中LuxS的作用，结果显示LuxS突变株改变生物膜的形成，主要是通过干扰活性甲基周期（AMC）。LuxS蛋白为合成酶，它能合成LuxS系统的信号分子即AI-2信号分子[2]。本研究采用变链菌LuxS基因突变株，在硫限定条件下通过营养补充实验对标准株和突变株进行生长吸光度值的测定比较，以期为进一步研究打下基础。
1 材料和方法
1.1 菌株和培养基
变链菌（S.mutans）Ingbritt C （血清C型） 国际标准株，本实验室成功构建并保存的LuxS基因缺失突变株[3，4]，以下简称突变株。TSA固体培养基，TSA-Eymr固体培养基（加入红霉素至终浓度10?g/ml），牛心脑浸液BHI液体培养基。
1.2 主要试剂和仪器
蛋氨酸，半胱氨酸，SAM，SAH（sigma，美国），PBS缓冲液，标准株上清液（本实验室配置并保存），超净工作台，高速台式离心机，电热恒温水浴箱，隔水式恒温培养箱，紫外线可见光分光光度计（BECKMAN公司，美国），R200电子天平，进口96孔微量板。
1.3 实验方法
制备限定化学成分的条件培养基，在BHI液体培养基中分别加入半胱氨酸10mg/ml，蛋氨酸100μmol，SAM50mg/ml，SAH1mg/ml（sigma），10%标准株的无菌上清液。将两种菌株常规复苏，提纯鉴定为纯菌后，分别挑取单菌落转种于BHI液体培养基及BHI-Eymr液体培养基中，离心弃上清液，用PBS缓冲液混匀于紫外分光光度计600nm处调至A≈0.1备用。将已配制好的条件培养基一式六份每孔200μL加入到无菌96孔板中，以等量BHI液体培养基为空白对照组，在各种条件培养基中分别加入100μL两种菌株菌悬液，一式三份。厌氧条件下培养24h，48h后于紫外分光光度计600nm处测定吸光度值A并分别记录下来。
统计学分析应用SPSS13.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，两组间计量资料的比较采用t检验，P < 0.05有统计学意义。
2 结果
从表中可看出，加入半胱氨酸后突变株吸光度（A）明显增长，但仍未恢复至标准株水平（P < 0.05）;分别加入蛋氨酸及SAH后，突变株明显增长且达到标准株水平;当加入上清液时后突变株吸光度（A）有所增长并超过标准株水平（P < 0.05）;而加入SAM后两菌株均降低，生长受到明显抑制。
3 讨论
本实验通过加入标准株上清液发现突变株的生长吸光度值增长，弥补了因LuxS基因缺失引起的AI-2的表达缺陷，这与Yoshida等研究者们的发现类似。
通过外源性加入一定浓度的蛋氨酸及SAH培养24h后能部分弥补突变株的生长，48h后甚至超过标准株生长水平，这可能与LuxS基因缺失后干扰了AMC，突变株失去利用高半胱氨酸和潜在参与甲基化反应的能力相关[4]。已有研究证实LuxS基因在鼠李糖乳杆菌GG中发挥了重要的硫代谢功能，其基因序列表明LuxS是与硫氨酸代谢相关的主要代谢酶。在AMC中，蛋氨酸是细胞内生成甲基和循环利用高半胱氨酸的关键代谢物[5]，LuxS缺失使作为唯一硫源的蛋氨酸生成能力降低。营养补充实验表明LuxS基因缺失是造成变链菌代谢缺陷的原因，加入一定半胱氨酸可以不同程度补偿突变株的生长缺陷，添加该成分刺激突变株生长是由于LuxS基因缺失导致了变链菌对代谢循环中更多营养必需物质的需要。通过补充AMC中相关的代谢物对两菌株生长状况的分析表明LuxS在变链菌生长过程中发挥着重要的硫代谢作用。在本研究中，当加入一定浓度的SAM时，两菌株的生长受到抑制可能是由于外源性加入SAM不能渗透到变链菌细胞内，而LuxS基因缺失引起了SAM在细胞间积累加强，在其他菌种中还未见相关报道，其机制还有待于进一步研究。
参考文献：
[1]SHARMA A， AGARWAL N， ANAND A，et al. To compare the effectiveness of different mouthrinses on Streptococcus mutans count in caries active children[J].J Oral Biol Craniofac Res，2018 ，8（2）：113-117.
[2]ZHENG H M，MAO Y L，ZHU Q C，et al.The quorum sensing regulator CinR hierarchically regulates two other quorum sensing pathways in ligand-dependent and-independent fashions in Rhizobium etli[J].J Bacterial，2015，197（9）：1573-1581.
[3]张耀超，韩育植，韩福胜.变异链球菌LuxS基因缺陷突变株的构建及其生物膜结构的初步观察研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2012，22（6）：309-313.
[4]Bodor，A，B.Elxnat，Thiel V，et al.Wagner-Dobler I Potential for LuxS related signaling in marine bacteria and production of autoinducer-2 in the genus Shewanella[J].BMC Microbiol 2008，8：13.
[5]Deric R.Learman，Haakrho Yi，Steven D.Brown，et，al.Involvement of Shewanella oneidensis MR-1 LuxS in Biofilm Development and Sulfur Metabolism.[J].Appl Environ Microbiol.2009，75（5）：1301-1307.
基金項目：
陕西省教育厅专项科研计划项目， （项目编号： 18JK0656）