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摘要：目的 探讨傣药豆腐渣果树皮和果实95%乙醇提取物对酒精引起的氧化应激损伤的抗氧化应激及抗炎活性。方法 采用采用56度北京红星二锅头白酒，以0.05mL/10 g.d给KM种小鼠连续灌胃4周，于模型复制的第2周开始，动物在造模的同时分别给予豆腐渣果树皮和果实95%乙醇提取物，连续给予3周，末次给药后，处死动物，检测动物血清中MDA、SOD、TNF-α的含量及脑匀浆中MDA、SOD的含量。结果 与正常组比较，模型组小鼠给予白酒后第4周即出现血清和脑组织中SOD水平明显下降（P<0.01），MDA水平明显升高（P<0.01），血清中炎症因子TNF-α水平明显升高（P<0.01）。与模型组相比，给予豆腐渣果树皮和果实的醇提取物3周后，均可降低血清中MDA水平和TNF-α水平（P<0.05），并可升高血清和脑中SOD水平（P<0.05）。结论 豆腐渣果树皮和果实的95%乙醇提取物可减轻酒精引起的氧化应激损伤及炎症因子释放。
关键词：豆腐渣果;抗氧化;抗炎;活性研究
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）10-0075-04
【Abstract】Objective： To study the anti-oxidative stress and anti-inflammatory activities of the 95% ethanol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook in Dai medicine on alcohol-induced oxidative stress damage. Methods： 56% degree of Beijing Hongxing Erguotou Liquor were used to give KM mice intragastrically with 0.05mL/10 god for 4 consecutive weeks. Starting from the second week of model replication， the animals were given the 95% ethanol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook for 3 weeks at the same time as the model was created. After the last administration， the animals were sacrificed to detect the contents of MDA， SOD， and TNF-α in the animal serum and the contents of MDA and SOD in the brain homogenate. Results： Compared with the normal group， the SOD level in serum and brain tissue of the model group decreased significantly （P<0.01）， the MDA level increased （P<0.01）， and the serum inflammatory factor TNF-α level in the 4th week after the administration of liquor was significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， after 3 weeks of alcohol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook， the levels of MDA and TNF-α in the serum could be reduced （P<0.05）， and the levels of SOD in the serum and brain could be increased （P<0.05）. Conclusion： The 95% ethanol extract from the bark and fruit of Helicia erratica Hook can reduce the oxidative stress damage and the release of inflammatory factors caused by alcohol.
【Key words】Helicia erratica Hook; Antioxidant; Anti-inflammation; Activity Study
酒精中毒性腦病（Alcoholic Brain Disease，ABD）是酒精中毒最常见、也是最严重的并发症之一，是由于长时期大量酗酒引起人体营养代谢紊乱，导致中枢神经损害的一类疾病。肝脏是酒精代谢的主要器官，因此既往对酒精造成肝脏损伤的研究较为深入，但近年来的研究表明，过度饮酒可造成脑内炎症甚至是不可逆性脑组织损伤[1]，因此ABD的诊治越来越引起人们的关注。
豆腐渣果（深绿山龙眼，Helicia nilagirica Bedd）为山龙眼科Proteaceae山龙眼属Helicia植物，分布于云南产于云南西南部和南部（西双版纳、普洱、保山等地），是傣医用于解除农药中毒、食用野生菌中毒的常用民族药。课题组前期研究发现，豆腐渣果的乙醇提取物具有一定的解酒精中毒作用，并能减轻急性脑损伤动物脑组织炎症反应，故推测豆腐渣果可能对ABD具有潜在活性，本研究拟探讨豆腐渣果不同部位的95%乙醇提取物对酒精诱导的氧化应激反应和炎症因子释放的影响，为研究其对抗ABD的活性提供依据。 1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 试剂：红星二锅头（北京红星股份有限公司，批号：19212938102）;BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司，批号：063016161009）;小鼠TNF-α ELISA试剂盒、小鼠SOD、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20190109）;豆腐果苷（Heli）（东京化成工业株式会社，批号：41VZE-DG）。豆腐渣果果实95%乙醇提取物（自制，提取率6%，给药浓度7 mg/mL，相当于2.28 g生药/kg）;豆腐渣果树皮95%乙醇提取物（自制，提取率8%，给药浓度9 mg/mL，相当于2.28 g生药/kg）。
仪器：分析天平（XS125A，瑞士普利赛斯）;酶标仪（Infinite M200 PRO，瑞士Tecan公司）;低温高速离心机（cf16RX，Hitachi Koki公司）。
1.2 实验方法 昆明种小鼠100只，雌雄各半，体重18～22 g。随机分成5个组，分别为：正常组，模型组，树皮组，果实组，Heli组，每小组10只。药物的干预方案：正常组和模型组均经口给予等体积生理盐水，药物经口给予相应的药物：树皮组（2.28 g生药/kg）、果实组（2.28 g生药/kg）、Heli组（40 mg/kg）。除正常组外，其余各组用56度北京红星二锅头白酒，以0.05mL/10 g.d灌胃剂量灌胃1周后，于实验第2周起，每天上午正常组灌胃生理盐水，其它各组灌胃给予相应受试物，6 h后灌胃白酒，剂量同前，连续给药+白酒3周，实验过程每周称取小鼠体重并记录小鼠精神状态等一般情况，于第4周时，末次给酒后1h，所有动物过量麻醉后心脏取血，3000转/分离心20分钟，制备血清，检测血清中MDA、SOD、TNF-α含量，处死动物，冰上取脑，制备脑匀浆，置-80℃冰箱保存，用于检测脑组织MDA、SOD含量。
1.3 统计学方法 数据以均數±标准差（x[TX-*3/8]±s）表示。组间比较采用单因素方差分析法，方差齐者采用LSD法检验，方差不齐者采用Tamhane′s法检验。
2 结果
2.1 豆腐渣果不同提取物对小鼠体重的影响 结果显示，给予酒精灌胃4周，模型组动物体重明显降低，与正常组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）;给予豆腐渣果树皮和果实提取物后，动物体重较模型组呈上升趋势，实验第四周时，树皮组和果实组动物体重明显高于模型组，差异具有统计学意义（P<0.05）;豆腐渣果的活性成分豆腐果苷在整个给药过程均可明显升高动物的体重，与模型组相比差异具有统计学意义（P<0.05）详见表1。
2.2 豆腐渣果不同提取物对小鼠血清中SOD、MDA水平的影响 结果显示，与正常组比较，模型组血清SOD水平显著降低（P<0.01）;与模型组相比，给予豆腐渣果的果实提取物可明显升高血清中SOD水平（P<0.05），但树皮提取物作用不明显;给予豆腐果苷的作用不明显;与正常组相比，模型组血清中MDA水平明显升高（P<0.01），与模型组比较，给予豆腐渣果的果实提取物可明显降低血清中MDA水平（P<0.05），但树皮提取物作用不明显;给予豆腐果苷的作用不明显。详见表2。
2.3 豆腐渣果不同提取物对小鼠脑组织中SOD、MDA水平的影响 结果显示，与正常组比较，模型组脑组织中SOD水平显著降低（P<0.01）;与模型组相比，给予豆腐渣果的果实提取物和树皮提取物均可显著升高血清中SOD水平（P<0.01或P<0.05），给予豆腐果苷也可明显升高血清中SOD水平（P<0.05）;与正常组相比，模型组脑组织中MDA水平明显升高（P<0.01），与模型组比较，给予豆腐渣果的果实提取物和树皮提取物均可明显降低血清中MDA水平（P<0.05）;给予豆腐果苷的作用不明显。详见表3。
2.4 豆腐渣果不同提取物对小鼠血清和脑组织中TNF-α水平的影响 结果显示，与正常组比较，模型组血清和脑组织中TNF-α水平显著升高（*[KG-*4]*P<0.01）;与模型组相比，给予豆腐渣果的果实提取物和树皮提取物均可明显降低血清和脑组织中TNF-α水平（#P<0.05）;给予豆腐果苷的作用不明显。详见表4。
3 讨论
慢性酒精中毒性脑病是全球常见疾病，可严重危害人类健康。饮酒是云南少数民族表达精神生活需要的重要载体，随着居民生活水平的逐渐提高，该病的发病率不断提高。但长期过量饮酒不仅是导致肝损伤的主要病因，也是诱发脑血管疾病及老年痴呆的重要危险因素。目前治疗慢性酒精中毒性脑病的措施包括了戒酒、解毒、病因治疗、神经保护和康复治疗等。戒酒是慢性酒精中毒性脑病最重要方法，但由于患者往往难以长期坚持而易造成再次酗酒的发生，苯二氮类解毒药物治疗对过度饮酒造成的癫痫发作、谵妄等症状具有显著疗效[2]。随着对慢性酒精中毒性脑病研究的深入，不断发现，该病不仅临床表现多样化，其分子机制也较为复杂。给临床治疗慢性酒精中毒性脑病患者带来巨大的挑战[3]。
云南少数民族在长期与疾病作斗争的过程中积累了很多行之有效、简便廉验的方药，傣医解药是其中最有代表性方药之一。豆腐渣果是傣医用于解酒毒、菌毒、农药中毒的一种解药[4]。豆腐渣果为山龙眼科山龙眼属（Helicia）植物深绿山龙眼（Helicia nilagirica Bedd）的种子，课题组前期研究显示豆腐渣果的活性成分豆腐果苷具有较强的抗血栓形成及降低脑组织炎症因子TNF-α和IL-1β释放的作用，在对豆腐渣果的醇提物进行解酒作用初步研究时发现其具有一定的解酒作用，故推测豆腐渣果可能对慢性酒精中毒性脑病有潜在的活性。为证实此假说，进行了本实验的研究。
本实验以豆腐渣果的果实及树皮95%乙醇提取物作为研究对象，考察了它们对小鼠长期灌胃白酒后血清和脑组织中氧化应激指标和炎症因子释放的影响，同时为了明确豆腐渣果提取物的作用是否为其已知的活性成分豆腐果苷发挥，故同时对豆腐果苷的作用进行了考察。实验结果显示，小鼠灌胃56度的食用白酒4周后，体重明显减轻，血清和脑组织中抗氧化因子SOD明显降低，氧化应激产物MDA水平显著升高，提示，长期饮酒引起了机体明显的氧化应激损伤，同时，小鼠血清和脑组织中炎症因子TNF-α释放增加，表明长期饮酒引起了机体炎症反应，同时也提示，长期饮酒造成的损伤可涉及多种病理环节。给予豆腐渣果的果实及树皮95%乙醇提取物后，可明显升高血清和脑组织中SOD水平，降低MDA水平，说明豆腐渣果的两种提取物均具有抗氧化应激活性;另外，给予豆腐渣果的果实及树皮95%乙醇提取物后，小鼠血清和脑组织中的炎症因子TNF-α释放减少，说明两种提取物具有减轻酒精引起的炎症反应。同时，本实验的结果还提示，豆腐渣果的果实及树皮95%乙醇提取物具有一定的阻止因过度饮酒造成的体重减轻。对豆腐渣果的已知活性成分豆腐果苷的研究结果提示，豆腐果苷可以阻止因过度饮酒造成的体重减轻，但对过度饮酒造成氧化应激损伤及炎症反应无明显的抑制作用。说明豆腐渣果的上述活性并非由豆腐果苷发挥，其活性成分另有它物。本实验的结果为后期解析豆腐渣果作为傣医解药解“酒毒”的物质基础及进行作用机制研究奠定了良好的基础。
参考文献：
[1]Obad A，Peeran A，Little JI，et al.Alcohol-Mediated Organ Damages[J].Heart and Brain，2018（9）：81.
[2]李艺，彭英.《慢性酒精中毒性脑病诊治中国专家共识》解读[J].中国现代神经疾病杂志，2019，19（1）：1-4.
[3]曾玉娥，吴晓牧，杨海玉.慢性酒精中毒性脑病的临床与病理机制研究进展[J].中风与神经疾病杂志，2013，30（5）：475-477.
[4]彭朝忠，段立胜，李学兰.傣族民间解毒药物收集[J].中国民族医药杂志，2005，2：16-16.
（收稿日期：2021-07-16）
关键词：豆腐渣果;抗氧化;抗炎;活性研究
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）10-0075-04
【Abstract】Objective： To study the anti-oxidative stress and anti-inflammatory activities of the 95% ethanol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook in Dai medicine on alcohol-induced oxidative stress damage. Methods： 56% degree of Beijing Hongxing Erguotou Liquor were used to give KM mice intragastrically with 0.05mL/10 god for 4 consecutive weeks. Starting from the second week of model replication， the animals were given the 95% ethanol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook for 3 weeks at the same time as the model was created. After the last administration， the animals were sacrificed to detect the contents of MDA， SOD， and TNF-α in the animal serum and the contents of MDA and SOD in the brain homogenate. Results： Compared with the normal group， the SOD level in serum and brain tissue of the model group decreased significantly （P<0.01）， the MDA level increased （P<0.01）， and the serum inflammatory factor TNF-α level in the 4th week after the administration of liquor was significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， after 3 weeks of alcohol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook， the levels of MDA and TNF-α in the serum could be reduced （P<0.05）， and the levels of SOD in the serum and brain could be increased （P<0.05）. Conclusion： The 95% ethanol extract from the bark and fruit of Helicia erratica Hook can reduce the oxidative stress damage and the release of inflammatory factors caused by alcohol.
【Key words】Helicia erratica Hook; Antioxidant; Anti-inflammation; Activity Study
酒精中毒性腦病（Alcoholic Brain Disease，ABD）是酒精中毒最常见、也是最严重的并发症之一，是由于长时期大量酗酒引起人体营养代谢紊乱，导致中枢神经损害的一类疾病。肝脏是酒精代谢的主要器官，因此既往对酒精造成肝脏损伤的研究较为深入，但近年来的研究表明，过度饮酒可造成脑内炎症甚至是不可逆性脑组织损伤[1]，因此ABD的诊治越来越引起人们的关注。
豆腐渣果（深绿山龙眼，Helicia nilagirica Bedd）为山龙眼科Proteaceae山龙眼属Helicia植物，分布于云南产于云南西南部和南部（西双版纳、普洱、保山等地），是傣医用于解除农药中毒、食用野生菌中毒的常用民族药。课题组前期研究发现，豆腐渣果的乙醇提取物具有一定的解酒精中毒作用，并能减轻急性脑损伤动物脑组织炎症反应，故推测豆腐渣果可能对ABD具有潜在活性，本研究拟探讨豆腐渣果不同部位的95%乙醇提取物对酒精诱导的氧化应激反应和炎症因子释放的影响，为研究其对抗ABD的活性提供依据。 1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 试剂：红星二锅头（北京红星股份有限公司，批号：19212938102）;BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司，批号：063016161009）;小鼠TNF-α ELISA试剂盒、小鼠SOD、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20190109）;豆腐果苷（Heli）（东京化成工业株式会社，批号：41VZE-DG）。豆腐渣果果实95%乙醇提取物（自制，提取率6%，给药浓度7 mg/mL，相当于2.28 g生药/kg）;豆腐渣果树皮95%乙醇提取物（自制，提取率8%，给药浓度9 mg/mL，相当于2.28 g生药/kg）。
仪器：分析天平（XS125A，瑞士普利赛斯）;酶标仪（Infinite M200 PRO，瑞士Tecan公司）;低温高速离心机（cf16RX，Hitachi Koki公司）。
1.2 实验方法 昆明种小鼠100只，雌雄各半，体重18～22 g。随机分成5个组，分别为：正常组，模型组，树皮组，果实组，Heli组，每小组10只。药物的干预方案：正常组和模型组均经口给予等体积生理盐水，药物经口给予相应的药物：树皮组（2.28 g生药/kg）、果实组（2.28 g生药/kg）、Heli组（40 mg/kg）。除正常组外，其余各组用56度北京红星二锅头白酒，以0.05mL/10 g.d灌胃剂量灌胃1周后，于实验第2周起，每天上午正常组灌胃生理盐水，其它各组灌胃给予相应受试物，6 h后灌胃白酒，剂量同前，连续给药+白酒3周，实验过程每周称取小鼠体重并记录小鼠精神状态等一般情况，于第4周时，末次给酒后1h，所有动物过量麻醉后心脏取血，3000转/分离心20分钟，制备血清，检测血清中MDA、SOD、TNF-α含量，处死动物，冰上取脑，制备脑匀浆，置-80℃冰箱保存，用于检测脑组织MDA、SOD含量。
1.3 统计学方法 数据以均數±标准差（x[TX-*3/8]±s）表示。组间比较采用单因素方差分析法，方差齐者采用LSD法检验，方差不齐者采用Tamhane′s法检验。
2 结果
2.1 豆腐渣果不同提取物对小鼠体重的影响 结果显示，给予酒精灌胃4周，模型组动物体重明显降低，与正常组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）;给予豆腐渣果树皮和果实提取物后，动物体重较模型组呈上升趋势，实验第四周时，树皮组和果实组动物体重明显高于模型组，差异具有统计学意义（P<0.05）;豆腐渣果的活性成分豆腐果苷在整个给药过程均可明显升高动物的体重，与模型组相比差异具有统计学意义（P<0.05）详见表1。
2.2 豆腐渣果不同提取物对小鼠血清中SOD、MDA水平的影响 结果显示，与正常组比较，模型组血清SOD水平显著降低（P<0.01）;与模型组相比，给予豆腐渣果的果实提取物可明显升高血清中SOD水平（P<0.05），但树皮提取物作用不明显;给予豆腐果苷的作用不明显;与正常组相比，模型组血清中MDA水平明显升高（P<0.01），与模型组比较，给予豆腐渣果的果实提取物可明显降低血清中MDA水平（P<0.05），但树皮提取物作用不明显;给予豆腐果苷的作用不明显。详见表2。
2.3 豆腐渣果不同提取物对小鼠脑组织中SOD、MDA水平的影响 结果显示，与正常组比较，模型组脑组织中SOD水平显著降低（P<0.01）;与模型组相比，给予豆腐渣果的果实提取物和树皮提取物均可显著升高血清中SOD水平（P<0.01或P<0.05），给予豆腐果苷也可明显升高血清中SOD水平（P<0.05）;与正常组相比，模型组脑组织中MDA水平明显升高（P<0.01），与模型组比较，给予豆腐渣果的果实提取物和树皮提取物均可明显降低血清中MDA水平（P<0.05）;给予豆腐果苷的作用不明显。详见表3。
2.4 豆腐渣果不同提取物对小鼠血清和脑组织中TNF-α水平的影响 结果显示，与正常组比较，模型组血清和脑组织中TNF-α水平显著升高（*[KG-*4]*P<0.01）;与模型组相比，给予豆腐渣果的果实提取物和树皮提取物均可明显降低血清和脑组织中TNF-α水平（#P<0.05）;给予豆腐果苷的作用不明显。详见表4。
3 讨论
慢性酒精中毒性脑病是全球常见疾病，可严重危害人类健康。饮酒是云南少数民族表达精神生活需要的重要载体，随着居民生活水平的逐渐提高，该病的发病率不断提高。但长期过量饮酒不仅是导致肝损伤的主要病因，也是诱发脑血管疾病及老年痴呆的重要危险因素。目前治疗慢性酒精中毒性脑病的措施包括了戒酒、解毒、病因治疗、神经保护和康复治疗等。戒酒是慢性酒精中毒性脑病最重要方法，但由于患者往往难以长期坚持而易造成再次酗酒的发生，苯二氮类解毒药物治疗对过度饮酒造成的癫痫发作、谵妄等症状具有显著疗效[2]。随着对慢性酒精中毒性脑病研究的深入，不断发现，该病不仅临床表现多样化，其分子机制也较为复杂。给临床治疗慢性酒精中毒性脑病患者带来巨大的挑战[3]。
云南少数民族在长期与疾病作斗争的过程中积累了很多行之有效、简便廉验的方药，傣医解药是其中最有代表性方药之一。豆腐渣果是傣医用于解酒毒、菌毒、农药中毒的一种解药[4]。豆腐渣果为山龙眼科山龙眼属（Helicia）植物深绿山龙眼（Helicia nilagirica Bedd）的种子，课题组前期研究显示豆腐渣果的活性成分豆腐果苷具有较强的抗血栓形成及降低脑组织炎症因子TNF-α和IL-1β释放的作用，在对豆腐渣果的醇提物进行解酒作用初步研究时发现其具有一定的解酒作用，故推测豆腐渣果可能对慢性酒精中毒性脑病有潜在的活性。为证实此假说，进行了本实验的研究。
本实验以豆腐渣果的果实及树皮95%乙醇提取物作为研究对象，考察了它们对小鼠长期灌胃白酒后血清和脑组织中氧化应激指标和炎症因子释放的影响，同时为了明确豆腐渣果提取物的作用是否为其已知的活性成分豆腐果苷发挥，故同时对豆腐果苷的作用进行了考察。实验结果显示，小鼠灌胃56度的食用白酒4周后，体重明显减轻，血清和脑组织中抗氧化因子SOD明显降低，氧化应激产物MDA水平显著升高，提示，长期饮酒引起了机体明显的氧化应激损伤，同时，小鼠血清和脑组织中炎症因子TNF-α释放增加，表明长期饮酒引起了机体炎症反应，同时也提示，长期饮酒造成的损伤可涉及多种病理环节。给予豆腐渣果的果实及树皮95%乙醇提取物后，可明显升高血清和脑组织中SOD水平，降低MDA水平，说明豆腐渣果的两种提取物均具有抗氧化应激活性;另外，给予豆腐渣果的果实及树皮95%乙醇提取物后，小鼠血清和脑组织中的炎症因子TNF-α释放减少，说明两种提取物具有减轻酒精引起的炎症反应。同时，本实验的结果还提示，豆腐渣果的果实及树皮95%乙醇提取物具有一定的阻止因过度饮酒造成的体重减轻。对豆腐渣果的已知活性成分豆腐果苷的研究结果提示，豆腐果苷可以阻止因过度饮酒造成的体重减轻，但对过度饮酒造成氧化应激损伤及炎症反应无明显的抑制作用。说明豆腐渣果的上述活性并非由豆腐果苷发挥，其活性成分另有它物。本实验的结果为后期解析豆腐渣果作为傣医解药解“酒毒”的物质基础及进行作用机制研究奠定了良好的基础。
参考文献：
[1]Obad A，Peeran A，Little JI，et al.Alcohol-Mediated Organ Damages[J].Heart and Brain，2018（9）：81.
[2]李艺，彭英.《慢性酒精中毒性脑病诊治中国专家共识》解读[J].中国现代神经疾病杂志，2019，19（1）：1-4.
[3]曾玉娥，吴晓牧，杨海玉.慢性酒精中毒性脑病的临床与病理机制研究进展[J].中风与神经疾病杂志，2013，30（5）：475-477.
[4]彭朝忠，段立胜，李学兰.傣族民间解毒药物收集[J].中国民族医药杂志，2005，2：16-16.
（收稿日期：2021-07-16）