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【摘要】 目的 用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测乙型肝炎患者血清中HBV-DNA的含量,了解其与酶联免疫吸附方法(ELISA)测定乙肝血清学标志物(乙肝两对半)的关系。方法 采用RT-PCR方法和ELISA方法,分別检测141例乙型肝炎患者血清中HBV-DNA含量和乙肝两对半指标。根据血清学标志物:乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒表面抗体(HBsAb)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)、乙肝病毒e抗体(HBeAb)、乙肝病毒核心抗体(HBcAb)结果的不同模式,将141例患者分组。结果 发现HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组患者血清中存在高水平HBV-DNA,阳性率达98.1%(51/52);HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组患者血清中HBV-DNA水平稍低,阳性率达80.8%(42/52);HBsAg、HBcAb阳性组患者血清中HBV-DNA水平阳性率也达到了82.4%(28/34)。结论 ELISA法检测乙肝两对半能提供乙肝感染的间接证据,而RT-PCR法检测HBV-DNA准确灵敏,能真实反映HBV感染、复制及病程变化,在乙肝诊断、治疗及药效评价方面有应用价值。
【关键词】 实时荧光定量PCR技术;HBV-DNA;乙肝血清学标志物
doi:10.3969/j.issn.1004-7484(x).2014.04.036
文章编号:1004-7484(2014)-04-1836-01
随着对乙型肝炎病毒(HBV)分子生物学研究的深入,以及实时荧光定量聚合酶链反应(RT—PCR)方法的普遍开展,目前对乙型肝炎血清学标志物的临床意义已有了新的认识。本文选取抚顺市中心医院分子生物学实验室2013年间的141例乙肝患者HBV-DNA检测结果,根据其血清学标志物不同模式将其分组进行比较,现将分析结果总结如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 为本院2013年1月至2013年11月住院及门诊的经临床确诊的乙型肝炎患者141例,男性87例.平均年龄46岁;女性54例,平均年龄44岁。
1.2 HBV血清学标志物 检测采用常规酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,ELISA试剂盒购自(上海科华生物工程实业有限公司),操作严格按说明书进行。
1.3 仪器设备 Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR分析仪(德国凯杰)。HBV-DNA提取和扩增试剂盒来自凯杰生物技术有限公司。
1.4 RT-PCR检测 HBV-DNA方法采用煮沸裂解法,从血清中提取HBV—DNA。同时做阴性、临界阳性、强阳性质控品。4个标准品均由试剂盒配置,HBV-DNA浓度依次为104lU/ml、105lU/ml、106lU/ml和107lU/ml。按下列条件进行扩增,93℃2min,然后按93℃45s-55℃60s10个环,93℃30s-55℃45s30个循环。反应结果由仪器自动分析得出血清标本的乙肝病毒量。该仪器检测灵敏度为5×102lU/ml,大于该浓度为阳性结果。
1.5 定量结果统计方法 将各组HBV-DNA定量结果分组统计,分为>106lU/ml组、103-106lU/ml组、<103lU/ml组和阴性组。计算各组样本比例数。
2 结 果
141例血清标本根据血清学标志物:乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒表面抗体(HBsAb)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)、乙肝病毒e抗体(HBeAb)、乙肝病毒核心抗体(HBcAb)结果的不同模式分组,其HBV-DNA检测结果见表1。
3 讨 论
结果发现第一组HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组患者血清中存在高水平HBV-DNA,阳性率达98.1%(51/52);第二组HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组患者血清中HBV-DNA水平稍低,阳性率达80.8%(42/52);HBsAg、HBcAb阳性组患者血清中HBV—DNA水平阳性率也达到了82.4%(28/34)。但各个组中HBV-DNA定量水平分布情况存在很大差别。第-组94.2%的患者HBV-DNA定量在106lU/ml以上,提示HBeAg与HBV-DNA的存在是完全-致的,二者具有相似的流行病学意义[1]。如此高的病毒载量,证明了乙肝两对半呈大三阳模式的乙肝患者具有很强的传染性。
HBcAb过去-直被认为对乙肝病毒感染有保护作用,是预后良好的征象。本研究中第二组患者血清中HBV-DNA阳性率达80.8%,说明HBeAb的出现仍有病毒的复制。但HBV-DNA定量集中在103-106lU/ml,说明随着HBeAg转阴,病毒复制减少。有资料认为,这种情况的复制是免疫清除不全和乙肝病毒毒株变异所致,多发生在慢性肝炎[2]。第三组HBV-DNA阳性率与第二组相似,但HBV-DNA定量结果比第二组低,目前认为是处于乙肝病毒感染恢复期或基因突变[3]。单项HBcAb阳性提示机体既往感染或急性感染的“窗口期”,出现这种模式时应作RT-PCR进行病毒定量加以区分。以上分析表明,血清乙肝两对半阳性者,无论何种组合模式均存在病毒复制的可能[4]。
在技术上,RT-PCR采用荧光标记和闭管检测,克服了常规PCR扩增产物污染所致假阳性的缺点,使结果具有极高的特异性和敏感性[5]。但在分析RT-PCR结果时,还应考虑以下因素:①RT-PCR的反应体系复杂,易受多种因素影响。待测标本的溶血、脂血、处理不当都会导致其假阳性或假阴性;②RT-PCR只能检测血中游离的HBV-DNA,当病毒整合到肝细胞染色体上,随同肝细胞一起复制、表达时,ELISA可出现阳性反应,但血清中已没有HBV颗粒存在,此时RT-PCR可为阴性;③当患者感染的HBV-DNA发生突变,不能与荧光探针结合,RT-PCR为阴性,而ELISA可为阳性。ELISA法检测乙肝两对半的影响因素也较多,只能反映机体对乙肝病毒的免疫反应状态,不能直接反映血清中的病毒含量。当患者处于恢复期或既往感染,ELlSA检测乙肝两对半可有多种模式,是否有乙肝需做RT-PCR进行病毒定量。因此,在乙肝病毒感染的诊断上,二者有各自的优点,不可互相替代。两者相互结合,能为临床诊断、治疗方案的选择及疗效观察提供更可靠的依据。
参考文献
[1] 张健,李宁,吕维红,等.HBV-DNA定量测定对乙肝五项的评价意义[J].华中医学杂志,2001,25(1):15-17.
[2] 骆抗先.乙型肝炎的基础和临床[M].北京:人民卫生出版社,1997:1-6.
[3] 彭晓谋.利用免疫聚合酶链反应探讨HBgAb阴性/HBV—DNA阳性的形成原因[J].中华传染病杂志,1999,17(1):54-55.
[4] 谢志贤,谭爱国,何美懿,等.血清中乙型肝炎5项标志表现模式与乙型肝炎病毒-DNA含量的关系.中华医院感染学杂志[J].2002,12(2):81-83.
[5] 赖宏芳,付晓野,董玉琳,等.荧光探针定量PCR检测HBV—DNA[J].上海医学检验杂志,2000,15(1):18-19.
【关键词】 实时荧光定量PCR技术;HBV-DNA;乙肝血清学标志物
doi:10.3969/j.issn.1004-7484(x).2014.04.036
文章编号:1004-7484(2014)-04-1836-01
随着对乙型肝炎病毒(HBV)分子生物学研究的深入,以及实时荧光定量聚合酶链反应(RT—PCR)方法的普遍开展,目前对乙型肝炎血清学标志物的临床意义已有了新的认识。本文选取抚顺市中心医院分子生物学实验室2013年间的141例乙肝患者HBV-DNA检测结果,根据其血清学标志物不同模式将其分组进行比较,现将分析结果总结如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 为本院2013年1月至2013年11月住院及门诊的经临床确诊的乙型肝炎患者141例,男性87例.平均年龄46岁;女性54例,平均年龄44岁。
1.2 HBV血清学标志物 检测采用常规酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,ELISA试剂盒购自(上海科华生物工程实业有限公司),操作严格按说明书进行。
1.3 仪器设备 Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR分析仪(德国凯杰)。HBV-DNA提取和扩增试剂盒来自凯杰生物技术有限公司。
1.4 RT-PCR检测 HBV-DNA方法采用煮沸裂解法,从血清中提取HBV—DNA。同时做阴性、临界阳性、强阳性质控品。4个标准品均由试剂盒配置,HBV-DNA浓度依次为104lU/ml、105lU/ml、106lU/ml和107lU/ml。按下列条件进行扩增,93℃2min,然后按93℃45s-55℃60s10个环,93℃30s-55℃45s30个循环。反应结果由仪器自动分析得出血清标本的乙肝病毒量。该仪器检测灵敏度为5×102lU/ml,大于该浓度为阳性结果。
1.5 定量结果统计方法 将各组HBV-DNA定量结果分组统计,分为>106lU/ml组、103-106lU/ml组、<103lU/ml组和阴性组。计算各组样本比例数。
2 结 果
141例血清标本根据血清学标志物:乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒表面抗体(HBsAb)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)、乙肝病毒e抗体(HBeAb)、乙肝病毒核心抗体(HBcAb)结果的不同模式分组,其HBV-DNA检测结果见表1。
3 讨 论
结果发现第一组HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组患者血清中存在高水平HBV-DNA,阳性率达98.1%(51/52);第二组HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组患者血清中HBV-DNA水平稍低,阳性率达80.8%(42/52);HBsAg、HBcAb阳性组患者血清中HBV—DNA水平阳性率也达到了82.4%(28/34)。但各个组中HBV-DNA定量水平分布情况存在很大差别。第-组94.2%的患者HBV-DNA定量在106lU/ml以上,提示HBeAg与HBV-DNA的存在是完全-致的,二者具有相似的流行病学意义[1]。如此高的病毒载量,证明了乙肝两对半呈大三阳模式的乙肝患者具有很强的传染性。
HBcAb过去-直被认为对乙肝病毒感染有保护作用,是预后良好的征象。本研究中第二组患者血清中HBV-DNA阳性率达80.8%,说明HBeAb的出现仍有病毒的复制。但HBV-DNA定量集中在103-106lU/ml,说明随着HBeAg转阴,病毒复制减少。有资料认为,这种情况的复制是免疫清除不全和乙肝病毒毒株变异所致,多发生在慢性肝炎[2]。第三组HBV-DNA阳性率与第二组相似,但HBV-DNA定量结果比第二组低,目前认为是处于乙肝病毒感染恢复期或基因突变[3]。单项HBcAb阳性提示机体既往感染或急性感染的“窗口期”,出现这种模式时应作RT-PCR进行病毒定量加以区分。以上分析表明,血清乙肝两对半阳性者,无论何种组合模式均存在病毒复制的可能[4]。
在技术上,RT-PCR采用荧光标记和闭管检测,克服了常规PCR扩增产物污染所致假阳性的缺点,使结果具有极高的特异性和敏感性[5]。但在分析RT-PCR结果时,还应考虑以下因素:①RT-PCR的反应体系复杂,易受多种因素影响。待测标本的溶血、脂血、处理不当都会导致其假阳性或假阴性;②RT-PCR只能检测血中游离的HBV-DNA,当病毒整合到肝细胞染色体上,随同肝细胞一起复制、表达时,ELISA可出现阳性反应,但血清中已没有HBV颗粒存在,此时RT-PCR可为阴性;③当患者感染的HBV-DNA发生突变,不能与荧光探针结合,RT-PCR为阴性,而ELISA可为阳性。ELISA法检测乙肝两对半的影响因素也较多,只能反映机体对乙肝病毒的免疫反应状态,不能直接反映血清中的病毒含量。当患者处于恢复期或既往感染,ELlSA检测乙肝两对半可有多种模式,是否有乙肝需做RT-PCR进行病毒定量。因此,在乙肝病毒感染的诊断上,二者有各自的优点,不可互相替代。两者相互结合,能为临床诊断、治疗方案的选择及疗效观察提供更可靠的依据。
参考文献
[1] 张健,李宁,吕维红,等.HBV-DNA定量测定对乙肝五项的评价意义[J].华中医学杂志,2001,25(1):15-17.
[2] 骆抗先.乙型肝炎的基础和临床[M].北京:人民卫生出版社,1997:1-6.
[3] 彭晓谋.利用免疫聚合酶链反应探讨HBgAb阴性/HBV—DNA阳性的形成原因[J].中华传染病杂志,1999,17(1):54-55.
[4] 谢志贤,谭爱国,何美懿,等.血清中乙型肝炎5项标志表现模式与乙型肝炎病毒-DNA含量的关系.中华医院感染学杂志[J].2002,12(2):81-83.
[5] 赖宏芳,付晓野,董玉琳,等.荧光探针定量PCR检测HBV—DNA[J].上海医学检验杂志,2000,15(1):18-19.