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【摘要】 目的 用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测乙型肝炎患者血清中HBV-DNA的含量，了解其与酶联免疫吸附方法（ELISA）测定乙肝血清学标志物（乙肝两对半）的关系。方法 采用RT-PCR方法和ELISA方法，分別检测141例乙型肝炎患者血清中HBV-DNA含量和乙肝两对半指标。根据血清学标志物：乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒表面抗体（HBsAb）、乙肝病毒e抗原（HBeAg）、乙肝病毒e抗体（HBeAb）、乙肝病毒核心抗体（HBcAb）结果的不同模式，将141例患者分组。结果 发现HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组患者血清中存在高水平HBV-DNA，阳性率达98.1%（51/52）；HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组患者血清中HBV-DNA水平稍低，阳性率达80.8%（42/52）；HBsAg、HBcAb阳性组患者血清中HBV-DNA水平阳性率也达到了82.4%（28/34）。结论 ELISA法检测乙肝两对半能提供乙肝感染的间接证据，而RT-PCR法检测HBV-DNA准确灵敏，能真实反映HBV感染、复制及病程变化，在乙肝诊断、治疗及药效评价方面有应用价值。
【关键词】 实时荧光定量PCR技术；HBV-DNA；乙肝血清学标志物
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.04.036
文章编号：1004-7484（2014）-04-1836-01
随着对乙型肝炎病毒（HBV）分子生物学研究的深入，以及实时荧光定量聚合酶链反应（RT—PCR）方法的普遍开展，目前对乙型肝炎血清学标志物的临床意义已有了新的认识。本文选取抚顺市中心医院分子生物学实验室2013年间的141例乙肝患者HBV-DNA检测结果，根据其血清学标志物不同模式将其分组进行比较，现将分析结果总结如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 为本院2013年1月至2013年11月住院及门诊的经临床确诊的乙型肝炎患者141例，男性87例.平均年龄46岁；女性54例，平均年龄44岁。
1.2 HBV血清学标志物 检测采用常规酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，ELISA试剂盒购自（上海科华生物工程实业有限公司），操作严格按说明书进行。
1.3 仪器设备 Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR分析仪（德国凯杰）。HBV-DNA提取和扩增试剂盒来自凯杰生物技术有限公司。
1.4 RT-PCR检测 HBV-DNA方法采用煮沸裂解法，从血清中提取HBV—DNA。同时做阴性、临界阳性、强阳性质控品。4个标准品均由试剂盒配置，HBV-DNA浓度依次为104lU/ml、105lU/ml、106lU/ml和107lU/ml。按下列条件进行扩增，93℃2min，然后按93℃45s-55℃60s10个环，93℃30s-55℃45s30个循环。反应结果由仪器自动分析得出血清标本的乙肝病毒量。该仪器检测灵敏度为5×102lU/ml，大于该浓度为阳性结果。
1.5 定量结果统计方法 将各组HBV-DNA定量结果分组统计，分为>106lU/ml组、103-106lU/ml组、<103lU/ml组和阴性组。计算各组样本比例数。
2 结 果
141例血清标本根据血清学标志物：乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒表面抗体（HBsAb）、乙肝病毒e抗原（HBeAg）、乙肝病毒e抗体（HBeAb）、乙肝病毒核心抗体（HBcAb）结果的不同模式分组，其HBV-DNA检测结果见表1。
3 讨 论
结果发现第一组HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组患者血清中存在高水平HBV-DNA，阳性率达98.1%（51/52）；第二组HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组患者血清中HBV-DNA水平稍低，阳性率达80.8%（42/52）；HBsAg、HBcAb阳性组患者血清中HBV—DNA水平阳性率也达到了82.4%（28/34）。但各个组中HBV-DNA定量水平分布情况存在很大差别。第-组94.2%的患者HBV-DNA定量在106lU/ml以上，提示HBeAg与HBV-DNA的存在是完全-致的，二者具有相似的流行病学意义[1]。如此高的病毒载量，证明了乙肝两对半呈大三阳模式的乙肝患者具有很强的传染性。
HBcAb过去-直被认为对乙肝病毒感染有保护作用，是预后良好的征象。本研究中第二组患者血清中HBV-DNA阳性率达80.8%，说明HBeAb的出现仍有病毒的复制。但HBV-DNA定量集中在103-106lU/ml，说明随着HBeAg转阴，病毒复制减少。有资料认为，这种情况的复制是免疫清除不全和乙肝病毒毒株变异所致，多发生在慢性肝炎[2]。第三组HBV-DNA阳性率与第二组相似，但HBV-DNA定量结果比第二组低，目前认为是处于乙肝病毒感染恢复期或基因突变[3]。单项HBcAb阳性提示机体既往感染或急性感染的“窗口期”，出现这种模式时应作RT-PCR进行病毒定量加以区分。以上分析表明，血清乙肝两对半阳性者，无论何种组合模式均存在病毒复制的可能[4]。
在技术上，RT-PCR采用荧光标记和闭管检测，克服了常规PCR扩增产物污染所致假阳性的缺点，使结果具有极高的特异性和敏感性[5]。但在分析RT-PCR结果时，还应考虑以下因素：①RT-PCR的反应体系复杂，易受多种因素影响。待测标本的溶血、脂血、处理不当都会导致其假阳性或假阴性；②RT-PCR只能检测血中游离的HBV-DNA，当病毒整合到肝细胞染色体上，随同肝细胞一起复制、表达时，ELISA可出现阳性反应，但血清中已没有HBV颗粒存在，此时RT-PCR可为阴性；③当患者感染的HBV-DNA发生突变，不能与荧光探针结合，RT-PCR为阴性，而ELISA可为阳性。ELISA法检测乙肝两对半的影响因素也较多，只能反映机体对乙肝病毒的免疫反应状态，不能直接反映血清中的病毒含量。当患者处于恢复期或既往感染，ELlSA检测乙肝两对半可有多种模式，是否有乙肝需做RT-PCR进行病毒定量。因此，在乙肝病毒感染的诊断上，二者有各自的优点，不可互相替代。两者相互结合，能为临床诊断、治疗方案的选择及疗效观察提供更可靠的依据。
参考文献
[1] 张健，李宁，吕维红，等.HBV-DNA定量测定对乙肝五项的评价意义[J].华中医学杂志，2001，25（1）：15-17.
[2] 骆抗先.乙型肝炎的基础和临床[M].北京：人民卫生出版社，1997：1-6.
[3] 彭晓谋.利用免疫聚合酶链反应探讨HBgAb阴性/HBV—DNA阳性的形成原因[J].中华传染病杂志，1999，17（1）：54-55.
[4] 谢志贤，谭爱国，何美懿，等.血清中乙型肝炎5项标志表现模式与乙型肝炎病毒-DNA含量的关系.中华医院感染学杂志[J].2002，12（2）：81-83.
[5] 赖宏芳，付晓野，董玉琳，等.荧光探针定量PCR检测HBV—DNA[J].上海医学检验杂志，2000，15（1）：18-19.
【关键词】 实时荧光定量PCR技术；HBV-DNA；乙肝血清学标志物
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.04.036
文章编号：1004-7484（2014）-04-1836-01
随着对乙型肝炎病毒（HBV）分子生物学研究的深入，以及实时荧光定量聚合酶链反应（RT—PCR）方法的普遍开展，目前对乙型肝炎血清学标志物的临床意义已有了新的认识。本文选取抚顺市中心医院分子生物学实验室2013年间的141例乙肝患者HBV-DNA检测结果，根据其血清学标志物不同模式将其分组进行比较，现将分析结果总结如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 为本院2013年1月至2013年11月住院及门诊的经临床确诊的乙型肝炎患者141例，男性87例.平均年龄46岁；女性54例，平均年龄44岁。
1.2 HBV血清学标志物 检测采用常规酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，ELISA试剂盒购自（上海科华生物工程实业有限公司），操作严格按说明书进行。
1.3 仪器设备 Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR分析仪（德国凯杰）。HBV-DNA提取和扩增试剂盒来自凯杰生物技术有限公司。
1.4 RT-PCR检测 HBV-DNA方法采用煮沸裂解法，从血清中提取HBV—DNA。同时做阴性、临界阳性、强阳性质控品。4个标准品均由试剂盒配置，HBV-DNA浓度依次为104lU/ml、105lU/ml、106lU/ml和107lU/ml。按下列条件进行扩增，93℃2min，然后按93℃45s-55℃60s10个环，93℃30s-55℃45s30个循环。反应结果由仪器自动分析得出血清标本的乙肝病毒量。该仪器检测灵敏度为5×102lU/ml，大于该浓度为阳性结果。
1.5 定量结果统计方法 将各组HBV-DNA定量结果分组统计，分为>106lU/ml组、103-106lU/ml组、<103lU/ml组和阴性组。计算各组样本比例数。
2 结 果
141例血清标本根据血清学标志物：乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒表面抗体（HBsAb）、乙肝病毒e抗原（HBeAg）、乙肝病毒e抗体（HBeAb）、乙肝病毒核心抗体（HBcAb）结果的不同模式分组，其HBV-DNA检测结果见表1。
3 讨 论
结果发现第一组HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组患者血清中存在高水平HBV-DNA，阳性率达98.1%（51/52）；第二组HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组患者血清中HBV-DNA水平稍低，阳性率达80.8%（42/52）；HBsAg、HBcAb阳性组患者血清中HBV—DNA水平阳性率也达到了82.4%（28/34）。但各个组中HBV-DNA定量水平分布情况存在很大差别。第-组94.2%的患者HBV-DNA定量在106lU/ml以上，提示HBeAg与HBV-DNA的存在是完全-致的，二者具有相似的流行病学意义[1]。如此高的病毒载量，证明了乙肝两对半呈大三阳模式的乙肝患者具有很强的传染性。
HBcAb过去-直被认为对乙肝病毒感染有保护作用，是预后良好的征象。本研究中第二组患者血清中HBV-DNA阳性率达80.8%，说明HBeAb的出现仍有病毒的复制。但HBV-DNA定量集中在103-106lU/ml，说明随着HBeAg转阴，病毒复制减少。有资料认为，这种情况的复制是免疫清除不全和乙肝病毒毒株变异所致，多发生在慢性肝炎[2]。第三组HBV-DNA阳性率与第二组相似，但HBV-DNA定量结果比第二组低，目前认为是处于乙肝病毒感染恢复期或基因突变[3]。单项HBcAb阳性提示机体既往感染或急性感染的“窗口期”，出现这种模式时应作RT-PCR进行病毒定量加以区分。以上分析表明，血清乙肝两对半阳性者，无论何种组合模式均存在病毒复制的可能[4]。
在技术上，RT-PCR采用荧光标记和闭管检测，克服了常规PCR扩增产物污染所致假阳性的缺点，使结果具有极高的特异性和敏感性[5]。但在分析RT-PCR结果时，还应考虑以下因素：①RT-PCR的反应体系复杂，易受多种因素影响。待测标本的溶血、脂血、处理不当都会导致其假阳性或假阴性；②RT-PCR只能检测血中游离的HBV-DNA，当病毒整合到肝细胞染色体上，随同肝细胞一起复制、表达时，ELISA可出现阳性反应，但血清中已没有HBV颗粒存在，此时RT-PCR可为阴性；③当患者感染的HBV-DNA发生突变，不能与荧光探针结合，RT-PCR为阴性，而ELISA可为阳性。ELISA法检测乙肝两对半的影响因素也较多，只能反映机体对乙肝病毒的免疫反应状态，不能直接反映血清中的病毒含量。当患者处于恢复期或既往感染，ELlSA检测乙肝两对半可有多种模式，是否有乙肝需做RT-PCR进行病毒定量。因此，在乙肝病毒感染的诊断上，二者有各自的优点，不可互相替代。两者相互结合，能为临床诊断、治疗方案的选择及疗效观察提供更可靠的依据。
参考文献
[1] 张健，李宁，吕维红，等.HBV-DNA定量测定对乙肝五项的评价意义[J].华中医学杂志，2001，25（1）：15-17.
[2] 骆抗先.乙型肝炎的基础和临床[M].北京：人民卫生出版社，1997：1-6.
[3] 彭晓谋.利用免疫聚合酶链反应探讨HBgAb阴性/HBV—DNA阳性的形成原因[J].中华传染病杂志，1999，17（1）：54-55.
[4] 谢志贤，谭爱国，何美懿，等.血清中乙型肝炎5项标志表现模式与乙型肝炎病毒-DNA含量的关系.中华医院感染学杂志[J].2002，12（2）：81-83.
[5] 赖宏芳，付晓野，董玉琳，等.荧光探针定量PCR检测HBV—DNA[J].上海医学检验杂志，2000，15（1）：18-19.