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目的：探讨氨甲环酸对中波紫外线照射后黑素细胞增殖及酪氨酸酶代谢的影响。方法：设立紫外线照射组和非照射组，以不同浓度的氨甲环酸作用于黑素细胞，cck-8法测定黑素细胞增殖；多巴氧化方法测定酪氨酸酶活性，RT-PCR方法测定酪氨酸酶mRNA表达水平。结果：氨甲环酸对两组黑素细胞的增殖均无明显抑制作用（P>0.05）；而对酪氨酸酶活性和酪氨酸酶的mRNA表达有抑制作用（P<0.05），两组结果比较无明显差异；结论：氨甲环酸对黑素细胞的酪氨酸酶的抑制作用与中波紫外线照射无直接关系。
[关键词]氨甲环酸；黑素细胞；紫外线；影响
[中图分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）20-1708-03
Study on the impact of tranexamic acid in cultured human melanocytes after ultraviolet irradiation
AN Cai-xia1，2，ZHAO Ya-nan2，WANG Hong-juan2， PU Xiong-ming2
（1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830001，Xinjiang，China；2.The Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumqi 830001，Xinjiang，China）
Abstract： Objective To study the impact of tranexamic acid on cell proliferation and tyrosinase activity in cultured human melanocytes after ultraviolet irradiation. Methods To set up the ultraviolet irradiation and irradiation group， melanocytes was incubated different concentrations of tranexamic acid.Cell proliferation was measured with cck-8 assay；The tyrosinase activity was detected by DOPA-oxidation；Tyrosinase mRNA level was detected by RT-PCR method. Results Melanocytes proliferation was not significantly inhibitted by tranexamic acid compared with the untreated control（P>0.05）；but tyrosinase activity and tyrosinase mRNA level was restrained respectively（P<0.05）.The conclution was similary. Conclusion The tyrosinase activity was directly inhibitted by tranexamic acid，thereby melanogenesis was reduced，This result is not affected by ultraviolet irradiation.
Key words：tranexamic acid；melanocytes； ultraviolet；effect
氨甲环酸（Tranexamic acid，TA）是临床常用的抗纤溶止血药物。近年来，经临床研究报道治疗黄褐斑安全有效，而且能减少紫外线或激光治疗后的反应性色素沉着。对其具体治疗机制尚在探讨之中，我们此次进行实验对比观察氨甲环酸对于中波紫外线照射和非照射的黑素细胞影响方面有何差异，以进一步探讨药物发挥作用的机制。
1 材料和方法
1.1 主要材料与试剂：氨甲环酸粉剂：中国食品药品检定研究院；胎牛血清，胰蛋白酶（Trypsin，Gibco公司，美国）；黑素细胞培养基（M2），CCK-8试剂，TritonX-100，左旋多巴（L-D0PA，Sigma公司，美国）；窄频中波紫外线灯管：飞利浦9w；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本），二氧化碳培养箱（上海力申科学仪器有限公司），全自动酶标仪（Bio-Rad公司，美国）；凝胶成相系统（Bio-Rad公司，美国）；PCR仪为MJReseareh公司；TIAN script CDNA：天根生物制品公司；PCR试剂盒：购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。引物由上海生工生物有限公司合成。
TYR基因引物序列为：
F 5’-TTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGCT-3’
R 5’-TCATCTCCTGTCAGCTTCTGGA-3’bp：705bp
GAPDH基因引物序列为：
F 5’- TCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3’
R 5’-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3’bp：363bp
1.2研究方法
1.2.1 正常人黑素细胞的培养：取正常人包皮皮肤，剪成碎块后以0.25%胰酶冷消化12～15h，胎牛血清终止消化后离心并收集细胞，M1培养基中培养原代。每2～3天换一次液，待出现大量典型梭形黑素细胞后（约10天），再行胰酶消化，离心收集黑素细胞，置于M2培养基中，换瓶培养（T1代）。培养至3～4代，选择对数生长期的黑素细胞进行实验。 1.2.2 黑素细胞增殖的测定：将传代细胞的浓度调整至5×104个/孔后加入96孔培养板。24h细胞贴壁后设中波紫外线照射组（40mJ/cm2）和非紫外线照射组，用含不同浓度氨甲环酸的新鲜培养液换液1次，并设立药物阴性对照组，每一处理因素设立4个复孔，继续培养24h。于结束前4h，加入cck-8液50μl/孔，置酶标仪450nm波长测吸收光光度值。
1.2.3 酪氨酸酶活性的测定：96孔培养板加入细胞浓度为5×104个/孔的黑素细胞悬液，24h细胞贴壁后设中波紫外线照射组（40mJ/cm2）和非紫外线照射组，再用含不同浓度氨甲环酸的新鲜培养液换液1次，并设立药物阴性对照组，继续培养48h。48h后弃去上清液，PBS洗2次，每孔加0.1%的TritonX-100溶液100μl，振荡15min，使细胞完全破裂，加入0.1%L-DOPA溶液50μl/孔，37℃反应过夜，于酶标仪450nm波长处行吸收光光度值测定。
1.2.4 反转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）方法测定酪氨酸酶的mRNA表达首先收集培养皿里的细胞（经紫外线和氨甲环酸药物的处理，处理方法同前）再行RNA的提取，电泳察看RNA的浓度和完整性；按反转录试剂盒的说明进行RNA的反转录，cDNA进行定量后置于-70℃保存，进行后续PCR实验。PCR扩增条件按以下设置：Tyr：预变性94℃5min 94℃60s-55℃60s-72℃60s，30个循环，末次循环结束后72℃延伸10min。GAPDH预变性94℃5min94℃60s-56℃60s-72℃60s，30个循环，末次循环结束后72℃延伸10min。PCR结果分析采用凝胶成像仪和Quantity one l-D软件采集和分析数据。
1.3 统计学方法：所测数据均以表示，应用SPSS17.0软件分析，对实验结果进行单因素方差分析，P<0.05表明差异有统计学意义。
2 结果
2.1实验前经多巴染色阳性证实为黑素细胞（如图1）。
2.2 不同浓度的氨甲环酸对中波紫外线照射组和非紫外线照射组的黑素细胞增殖的影响：0.05～1mg/ml浓度范围内的氨甲环酸对两组体外培养的黑素细胞增殖均无明显抑制作用（P>0.05），见表1。
2.3 不同浓度氨甲环酸对中波紫外线照射组和非紫外线照射组的体外培养黑素细胞酪氨酸酶活性的影响：与药物阴性对照组比较，0.5mg/ml和1mg/ml浓度的氨甲环酸对两组黑素细胞的酪氨酸酶活性均具有明显抑制作用（P<0.05），见表2。
2.4氨甲环酸对酪氨酸酶mRNA表达的影响：给以0.05～1mg/ml浓度的氨甲环酸处理后，中波紫外线照射组和非紫外线照射组的黑素细胞的酪氨酸酶的mRNA表达均有下调，可见氨甲环酸对于酪氨酸酶的mRNA有抑制作用，且抑制作用随着浓度增加而增大（如图2）。
3 讨论
氨甲环酸是一种临床常用的抗纤溶止血药物[1-2]。近年来，国内外大量临床研究报道，氨甲环酸治疗黄褐斑安全有效，无明显并发症[3-6]。黄褐斑是一种由于黑素细胞合成黑素的功能增加引起的损容性皮肤病，而且紫外线照射已证实是黄褐斑形成的独立危险因素[7]。既往实验研究认为，氨甲环酸化学结构与酪氨酸部分相似，可通过和酪氨酸竞争，抑制酪氨酸酶活性最终抑制了黑色素合成[8]。Maeda K等[9]的体外实验提示，氨甲环酸对黑素合成产生的抑制作用是通过角质细胞介导的，通过抑制角质细胞分泌的单链尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激活剂（sc-UPA）的作用，减少黑素颗粒从黑素细胞向角质细胞转运而产生的。他们进行动物研究还发现氨甲环酸可以减轻紫外线照射后引起的色素沉着，并减少皮损处的红斑反应[10]。Na JI[11]对比观察氨甲环酸局部注射治疗后黄褐斑的皮损组织内黑素细胞的数量并无明显变化，而黑素含量较治疗前有所减少。J.I. Na等[12]通过临床研究发现，氨甲环酸对于黄褐斑皮损有治疗作用，而对正常皮肤则无作用。氨甲环酸究竟是如何发挥治疗黄褐斑作用的，其作用机制和紫外线照射有无关联，尚需我们进一步探讨。为了更加全面的了解氨甲环酸对于黑素细胞的影响研究，本研究设置了中波紫外线照射和非照射组，观察氨甲环酸对于体外培养的黑素细胞的增殖和对酪氨酸酶的影响在两组间有无差异。实验结果表明，不同剂量的氨甲环酸对于两组黑素细胞的增殖均未见明显抑制作用（P>0.05），提示氨甲环酸在治疗黄褐斑的过程中，并不是减少了色素沉着部位的黑素细胞数量发挥作用，这与先前有研究显示在氨甲环酸注射的皮损内，黑素细胞的数量无明显变化的结论相符。而氨甲环酸对于两组的黑素细胞酪氨酸酶和酪氨酸酶的基因表达均有抑制作用，这说明氨甲环酸对于酪氨酸酶的抑制作用不仅仅是与酪氨酸结构相似产生竞争性抑制的结果，而且这种作用与中波紫外线照射似乎并无直接关系，提示氨甲环酸对紫外线照射后的炎性色素沉着的治疗作用或有其他条件的参与。
综上所述，氨甲环酸不仅可直接作用于黑素细胞，降低酪氨酸酶的含量，而且对于酪氨酸酶的基因表达亦有抑制作用，由此发挥减淡色斑的作用，而这种作用与中波紫外线的直接照射并无明显关系，其对于黄褐斑的作用机制和抑制紫外线照射后的色素沉着的原因尚需进一步研究。
[参考文献]
[1]Shimizu M，Naito T，Okano A，et al. Trans-4-Aminomethylcyclohexanecarboxylic acid as a potent antiplasmin agent[J].Chem Pharm Bull，1965，13：1012-1014.
[2]Dung CJ，Goa KL.Tranexamic Acid：a review of its use in surgery and other indications[J].Drugs，1999，57（6）：1005-1032. [3]刘红，顾仲朝，杨希濂.止血环酸治疗黄褐斑的疗效及安全性观察[J].中华医学美学美容杂志，2005，11（6）：361-362.
[4]徐萍，单敏洁.氨甲环酸联合中药治疗女性黄褐斑疗效观察[J].中国美容医学，2014，23（9）：758-760.
[5]Shin JW，Huh SY，Jeong JB，et al.Efficacy of tranexamic acid containing oral medication on melasma[J].Korean J Dermatol，2011，49：565-571.
[6]韦洁，黎冻，周翔，等.Q开关Nd：YAG1064nm激光联合口服氨甲环酸片治疗黄褐斑疗效观察[J].中国美容医学，2013，22（9）：965-969.
[7]Passeron T.Melasma pathogenesis and influencing factors-an overview of the latest research[J].Dermatol，2012，27：5-6.
[8]杨希惠，魏骏，徐菱，等.止血环酸对酪氨酸代谢影响的临床与实验研究[J].中华医学美容杂志，1998，4（2）：71-75.
[9]Maeda K，Tomitab Y.Mechanism of the inhibitory effect of tranexamic acid on melanogenesis in cultured human melanocytes in the presence of keratinocyte-conditioned medium[J].Health Sci，2007，53：389-396.
[10]Maeda K，Naganuma M. Topicaltrans-4-aminomethyl- cyclohexacarboxylic acid prevents ultraviolet radiation- induced pigmentation[J].Photochem Photobiol Biol，1998，47：136-141.
[11]Na JI，Choi SY，Yang SH，et al.Effect of tranexamic acid on melasma：a clinical trial with histological evaluation[J].Eur Acad Dermatol Venereol，2012，10（2）：1468-3083.
[12]Lee JH，Park JG，Lim SH，et al.Localized intradermal microinjection of tranexamic acid for treatment of melasma in Asian patients：a preliminary clinical trial[J]Dermatol Surg，2006，32：626-631.
[收稿日期]2014-08-12 [修回日期]2014-09-15
编辑/何志斌
[关键词]氨甲环酸；黑素细胞；紫外线；影响
[中图分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）20-1708-03
Study on the impact of tranexamic acid in cultured human melanocytes after ultraviolet irradiation
AN Cai-xia1，2，ZHAO Ya-nan2，WANG Hong-juan2， PU Xiong-ming2
（1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830001，Xinjiang，China；2.The Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumqi 830001，Xinjiang，China）
Abstract： Objective To study the impact of tranexamic acid on cell proliferation and tyrosinase activity in cultured human melanocytes after ultraviolet irradiation. Methods To set up the ultraviolet irradiation and irradiation group， melanocytes was incubated different concentrations of tranexamic acid.Cell proliferation was measured with cck-8 assay；The tyrosinase activity was detected by DOPA-oxidation；Tyrosinase mRNA level was detected by RT-PCR method. Results Melanocytes proliferation was not significantly inhibitted by tranexamic acid compared with the untreated control（P>0.05）；but tyrosinase activity and tyrosinase mRNA level was restrained respectively（P<0.05）.The conclution was similary. Conclusion The tyrosinase activity was directly inhibitted by tranexamic acid，thereby melanogenesis was reduced，This result is not affected by ultraviolet irradiation.
Key words：tranexamic acid；melanocytes； ultraviolet；effect
氨甲环酸（Tranexamic acid，TA）是临床常用的抗纤溶止血药物。近年来，经临床研究报道治疗黄褐斑安全有效，而且能减少紫外线或激光治疗后的反应性色素沉着。对其具体治疗机制尚在探讨之中，我们此次进行实验对比观察氨甲环酸对于中波紫外线照射和非照射的黑素细胞影响方面有何差异，以进一步探讨药物发挥作用的机制。
1 材料和方法
1.1 主要材料与试剂：氨甲环酸粉剂：中国食品药品检定研究院；胎牛血清，胰蛋白酶（Trypsin，Gibco公司，美国）；黑素细胞培养基（M2），CCK-8试剂，TritonX-100，左旋多巴（L-D0PA，Sigma公司，美国）；窄频中波紫外线灯管：飞利浦9w；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本），二氧化碳培养箱（上海力申科学仪器有限公司），全自动酶标仪（Bio-Rad公司，美国）；凝胶成相系统（Bio-Rad公司，美国）；PCR仪为MJReseareh公司；TIAN script CDNA：天根生物制品公司；PCR试剂盒：购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。引物由上海生工生物有限公司合成。
TYR基因引物序列为：
F 5’-TTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGCT-3’
R 5’-TCATCTCCTGTCAGCTTCTGGA-3’bp：705bp
GAPDH基因引物序列为：
F 5’- TCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3’
R 5’-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3’bp：363bp
1.2研究方法
1.2.1 正常人黑素细胞的培养：取正常人包皮皮肤，剪成碎块后以0.25%胰酶冷消化12～15h，胎牛血清终止消化后离心并收集细胞，M1培养基中培养原代。每2～3天换一次液，待出现大量典型梭形黑素细胞后（约10天），再行胰酶消化，离心收集黑素细胞，置于M2培养基中，换瓶培养（T1代）。培养至3～4代，选择对数生长期的黑素细胞进行实验。 1.2.2 黑素细胞增殖的测定：将传代细胞的浓度调整至5×104个/孔后加入96孔培养板。24h细胞贴壁后设中波紫外线照射组（40mJ/cm2）和非紫外线照射组，用含不同浓度氨甲环酸的新鲜培养液换液1次，并设立药物阴性对照组，每一处理因素设立4个复孔，继续培养24h。于结束前4h，加入cck-8液50μl/孔，置酶标仪450nm波长测吸收光光度值。
1.2.3 酪氨酸酶活性的测定：96孔培养板加入细胞浓度为5×104个/孔的黑素细胞悬液，24h细胞贴壁后设中波紫外线照射组（40mJ/cm2）和非紫外线照射组，再用含不同浓度氨甲环酸的新鲜培养液换液1次，并设立药物阴性对照组，继续培养48h。48h后弃去上清液，PBS洗2次，每孔加0.1%的TritonX-100溶液100μl，振荡15min，使细胞完全破裂，加入0.1%L-DOPA溶液50μl/孔，37℃反应过夜，于酶标仪450nm波长处行吸收光光度值测定。
1.2.4 反转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）方法测定酪氨酸酶的mRNA表达首先收集培养皿里的细胞（经紫外线和氨甲环酸药物的处理，处理方法同前）再行RNA的提取，电泳察看RNA的浓度和完整性；按反转录试剂盒的说明进行RNA的反转录，cDNA进行定量后置于-70℃保存，进行后续PCR实验。PCR扩增条件按以下设置：Tyr：预变性94℃5min 94℃60s-55℃60s-72℃60s，30个循环，末次循环结束后72℃延伸10min。GAPDH预变性94℃5min94℃60s-56℃60s-72℃60s，30个循环，末次循环结束后72℃延伸10min。PCR结果分析采用凝胶成像仪和Quantity one l-D软件采集和分析数据。
1.3 统计学方法：所测数据均以表示，应用SPSS17.0软件分析，对实验结果进行单因素方差分析，P<0.05表明差异有统计学意义。
2 结果
2.1实验前经多巴染色阳性证实为黑素细胞（如图1）。
2.2 不同浓度的氨甲环酸对中波紫外线照射组和非紫外线照射组的黑素细胞增殖的影响：0.05～1mg/ml浓度范围内的氨甲环酸对两组体外培养的黑素细胞增殖均无明显抑制作用（P>0.05），见表1。
2.3 不同浓度氨甲环酸对中波紫外线照射组和非紫外线照射组的体外培养黑素细胞酪氨酸酶活性的影响：与药物阴性对照组比较，0.5mg/ml和1mg/ml浓度的氨甲环酸对两组黑素细胞的酪氨酸酶活性均具有明显抑制作用（P<0.05），见表2。
2.4氨甲环酸对酪氨酸酶mRNA表达的影响：给以0.05～1mg/ml浓度的氨甲环酸处理后，中波紫外线照射组和非紫外线照射组的黑素细胞的酪氨酸酶的mRNA表达均有下调，可见氨甲环酸对于酪氨酸酶的mRNA有抑制作用，且抑制作用随着浓度增加而增大（如图2）。
3 讨论
氨甲环酸是一种临床常用的抗纤溶止血药物[1-2]。近年来，国内外大量临床研究报道，氨甲环酸治疗黄褐斑安全有效，无明显并发症[3-6]。黄褐斑是一种由于黑素细胞合成黑素的功能增加引起的损容性皮肤病，而且紫外线照射已证实是黄褐斑形成的独立危险因素[7]。既往实验研究认为，氨甲环酸化学结构与酪氨酸部分相似，可通过和酪氨酸竞争，抑制酪氨酸酶活性最终抑制了黑色素合成[8]。Maeda K等[9]的体外实验提示，氨甲环酸对黑素合成产生的抑制作用是通过角质细胞介导的，通过抑制角质细胞分泌的单链尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激活剂（sc-UPA）的作用，减少黑素颗粒从黑素细胞向角质细胞转运而产生的。他们进行动物研究还发现氨甲环酸可以减轻紫外线照射后引起的色素沉着，并减少皮损处的红斑反应[10]。Na JI[11]对比观察氨甲环酸局部注射治疗后黄褐斑的皮损组织内黑素细胞的数量并无明显变化，而黑素含量较治疗前有所减少。J.I. Na等[12]通过临床研究发现，氨甲环酸对于黄褐斑皮损有治疗作用，而对正常皮肤则无作用。氨甲环酸究竟是如何发挥治疗黄褐斑作用的，其作用机制和紫外线照射有无关联，尚需我们进一步探讨。为了更加全面的了解氨甲环酸对于黑素细胞的影响研究，本研究设置了中波紫外线照射和非照射组，观察氨甲环酸对于体外培养的黑素细胞的增殖和对酪氨酸酶的影响在两组间有无差异。实验结果表明，不同剂量的氨甲环酸对于两组黑素细胞的增殖均未见明显抑制作用（P>0.05），提示氨甲环酸在治疗黄褐斑的过程中，并不是减少了色素沉着部位的黑素细胞数量发挥作用，这与先前有研究显示在氨甲环酸注射的皮损内，黑素细胞的数量无明显变化的结论相符。而氨甲环酸对于两组的黑素细胞酪氨酸酶和酪氨酸酶的基因表达均有抑制作用，这说明氨甲环酸对于酪氨酸酶的抑制作用不仅仅是与酪氨酸结构相似产生竞争性抑制的结果，而且这种作用与中波紫外线照射似乎并无直接关系，提示氨甲环酸对紫外线照射后的炎性色素沉着的治疗作用或有其他条件的参与。
综上所述，氨甲环酸不仅可直接作用于黑素细胞，降低酪氨酸酶的含量，而且对于酪氨酸酶的基因表达亦有抑制作用，由此发挥减淡色斑的作用，而这种作用与中波紫外线的直接照射并无明显关系，其对于黄褐斑的作用机制和抑制紫外线照射后的色素沉着的原因尚需进一步研究。
[参考文献]
[1]Shimizu M，Naito T，Okano A，et al. Trans-4-Aminomethylcyclohexanecarboxylic acid as a potent antiplasmin agent[J].Chem Pharm Bull，1965，13：1012-1014.
[2]Dung CJ，Goa KL.Tranexamic Acid：a review of its use in surgery and other indications[J].Drugs，1999，57（6）：1005-1032. [3]刘红，顾仲朝，杨希濂.止血环酸治疗黄褐斑的疗效及安全性观察[J].中华医学美学美容杂志，2005，11（6）：361-362.
[4]徐萍，单敏洁.氨甲环酸联合中药治疗女性黄褐斑疗效观察[J].中国美容医学，2014，23（9）：758-760.
[5]Shin JW，Huh SY，Jeong JB，et al.Efficacy of tranexamic acid containing oral medication on melasma[J].Korean J Dermatol，2011，49：565-571.
[6]韦洁，黎冻，周翔，等.Q开关Nd：YAG1064nm激光联合口服氨甲环酸片治疗黄褐斑疗效观察[J].中国美容医学，2013，22（9）：965-969.
[7]Passeron T.Melasma pathogenesis and influencing factors-an overview of the latest research[J].Dermatol，2012，27：5-6.
[8]杨希惠，魏骏，徐菱，等.止血环酸对酪氨酸代谢影响的临床与实验研究[J].中华医学美容杂志，1998，4（2）：71-75.
[9]Maeda K，Tomitab Y.Mechanism of the inhibitory effect of tranexamic acid on melanogenesis in cultured human melanocytes in the presence of keratinocyte-conditioned medium[J].Health Sci，2007，53：389-396.
[10]Maeda K，Naganuma M. Topicaltrans-4-aminomethyl- cyclohexacarboxylic acid prevents ultraviolet radiation- induced pigmentation[J].Photochem Photobiol Biol，1998，47：136-141.
[11]Na JI，Choi SY，Yang SH，et al.Effect of tranexamic acid on melasma：a clinical trial with histological evaluation[J].Eur Acad Dermatol Venereol，2012，10（2）：1468-3083.
[12]Lee JH，Park JG，Lim SH，et al.Localized intradermal microinjection of tranexamic acid for treatment of melasma in Asian patients：a preliminary clinical trial[J]Dermatol Surg，2006，32：626-631.
[收稿日期]2014-08-12 [修回日期]2014-09-15
编辑/何志斌