【摘 要】
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目的 体外模拟HIV-1的逆转录起始过程,建立实时荧光定量PCR测定HIV-1逆转录(RT)酶活性的方法.方法 以人类基因组DNA为模板PCR扩增得到tRNALys+3基因,在其5'端加入T7转录启动
【机 构】
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首都医科大学附属北京佑安医院感染科
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目的 体外模拟HIV-1的逆转录起始过程,建立实时荧光定量PCR测定HIV-1逆转录(RT)酶活性的方法.方法 以人类基因组DNA为模板PCR扩增得到tRNALys+3基因,在其5'端加入T7转录启动子,应用T7 RNA聚合酶转录得到cRNA;以HIV-1感染性克隆为模板PCR扩增得到HIV的5'-LTR-PBS,将其克隆连接至pGEM-T easy载体上,利用SP6 RNA聚合酶转录得到SP6-5'-LTR-PBScRNA;分别应用两种标准RT酶(SuperScript Ⅲ和HIV-1标准RT酶)催化体外逆转录反应合成相应cDNA.实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,进而得出逆转录酶的相对活性.结果 成功获得长度为93 bp的tRNALys-3引物和872 bp的SP6-5'-LTR-PBS RNA模板.将SuperScriptⅢ和HIV-1标准RT酶分别按1:10、1:100、1:1 000、1:10 000比例稀释后催化逆转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的逆转录产物cDNA,其循环阈值分别为13.9、18.3、20.9、24.9和20.4、25.5、28.7、32.5.结论 成功模拟HIV-1逆转录的起始过程并建立了基于实时荧光定量PCR检测RT酶活性的新型方法,为临床治疗、新药筛选和耐药检测提供了参考指标.
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