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摘要：应用直接竞争酶联免疫吸附试验方法（dcELISA）快速定量测定泥鳅、鲫鱼肌肉中氯霉素（CAP）残留量。氯霉素浓度在0.05～10ng/g范围内具有良好的线性关系，线性方程为y=-0.33-1.88x，r2=0.995，向样品中分别添加0.1、0.3、0.9ng/g三个浓度水平的氯霉素标准品，泥鳅样品的平均回收率分别为87.2%、88.9%、93.0%，鲫鱼样品的平均回收率分别为86.1%、79.9%、99.0%，最低检测限为0.05ng/g，批内变异系数为8.0%，批间变异系数为7.2%，结果表明该方法灵敏度高，重复性好，适合在泥鳅、鲫鱼肉样中氯霉素残留筛选检测。
关键词：氯霉素残留；直接竞争酶联免疫法；泥鳅；鲫鱼
氯霉素（Chloramphenicol，CAP）最初是从委内瑞拉链丝菌(Streptomyces Venezuela)的培养液中提取制得，是一类广谱抗生素。氯霉素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有明显的抑制作用，氯霉素由于其优良的抗菌性、稳定的药性和廉价，曾是我国水产养殖中常用的抗菌药之一，长期作为饲料添加剂和细菌性疾病的治疗用药[1]。近年来，研究发现氯霉素存在着严重的毒副作用，易引发再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症以及新生儿、早产儿灰色综合症等[2]。因此，动物性食品中的氯霉素残留问题一直备受关注，引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。中国农业部已将氯霉素从2000年版《中国兽药典》中删除列为禁药，而欧盟的进口食品卫生标准规定“氯霉素含量标准为不得检出。”[3]
目前，氯霉素残留分析主要采用气相色谱法和高效液相色谱法。高效液相色谱法虽然操作简单，但检出限较高，无法满足当前对氯霉素低残留限量的要求。气相色谱法灵敏度较高，但样品前处理过程复杂、分析速度慢、仪器价格昂贵，不适合在基层推广使用[3-4]。自1984年Campbell等建立检测CAP的ELISA以来，国外研究进展较快，国内研究相对滞后。随着ELISA技术的发展直接竞争酶联免疫吸附试验法（dcELISA）越来越体现出更多的优势，基于抗原抗体特异性反应建立起来的dcELISA，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点，可以直接用于生产实践，适用于大规模氯霉素残留筛选检测。
1材料与方法
1.1材料和仪器
Multiskan MK3酶标仪，产地：芬兰；AL104电子天平，产地：上海；FSH-2可调高速匀浆器，产地：常州；DT5-1离心机，产地：北京；乙酸乙酯、正己烷，分析纯，北京化学试剂公司；氯霉素、氯霉素碱、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考等标准品，北京兽药监察所；氯霉素ELISA快速检测试剂盒，北京中检维康技术有限公司；生物样品来源，市售。
1.2样品的前处理
实验所采用样品为泥鳅、鲫鱼，分别取肌肉充分剪切、混匀，用高速组织匀浆器破碎，密封袋密封，标记后－20℃保存。
称取制备的样品3g置50ml离心管中，加入6ml乙酸乙酯，用振荡器强烈混合10min；室温3000g离心10min；取2ml上清液（相当1g样品）在50℃氮气流下吹干；用1ml正己烷溶解干燥的残留物，加入1mlPBS缓冲液振荡混合10min，室温3000g离心10min；去上清液（正己烷），取100μl下层水相用于检测。
1.3抗体交叉反应的测定
抗CAP抗体抑制物分别采用倍比稀释的氯霉素碱、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考，计算各竞争物的IC50， 比较抗体对它们的亲合性。同时，用下式计算各竞争物与抗CAP 抗体的交叉反应。
交叉反应性（%）=IC50（CAP）×100/IC50（竞争物）
1.4分析程序
将所需的的微孔条插入微孔架，每个标准品和样品做2 个平行，记录标准品和样品的位置。加入100μl标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入50μl 稀释了的抗氯霉素抗体酶标记物于微孔内。充分混合，覆盖上薄膜，室温孵育1h。倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打3次，完全除去孔中的液体，每次用250μl洗涤液洗板4次、排干。洗板后加入100μl底物到每个微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15min。加入50μl，2M H2SO4终止液终止反应，用酶标仪在450nm处测量吸光度值（OD值）。
1.5标准曲线的制作及样品浓度的计算
将所获得的标准品和样品的OD值按下式折算成百分比吸光度值：
% 吸光度值 = 标准品或样品的OD值 × 100 / 空白标准品的OD值
以标准样品浓度为横坐标，标准样品的 % 吸光度值为纵坐标，绘制对应氯霉素浓度的半对数校正曲线，样品浓度根据测得的OD值从校正曲线上读出。
2结果
2.1标准曲线
按照1.4步骤，分别测定浓度为0、0.05、0.1、0.3、1、3、10ng/ml氯霉素标准液的OD值，采用RIDASCREEN 数据分析软件建立标准曲线（图1、图2），由图2曲线可知氯霉素浓度在0.05～10ng/ml范围内呈线性，线性方程为Y = -0.33-1.88X。相关系数：r = 0.997
2.2回收率
向样品中分别添加3个浓度水平的氯霉素标样：0.1、0.3、0.9ng/g，每个浓度做4个平行，同时做4个空白样。按1.2处理后测定氯霉素含量，计算回收率，结果如表1所示。
2.3灵敏度
按照1.4步骤同时测定10个“0”标准溶液的OD值，求出其平均值（X），再减去两倍标准差（SD），从标准曲线上查出对应于OD值为X－2SD的浓度，即为灵敏度。该方法的平均灵敏度为0.05ng/g。
2.4精密度
采用变异系数表示法，在同一次测定中对3个浓度水平的样品分别重复测定5次，计算批内变异系数。分别测定3个浓度水平的样品在3个不同批次测定之间的变异系数，即为批间变异系数。结果如表2所示。
2.5交叉反应
CAP抗体与结构类似物的交叉反应结果见表3
3讨论
目前文献报道的氯霉素的dcELISA针对水产品的检测的报道较少。本试验是参照“鸡肉和牛奶中氯霉素的提取方法”而建立的水产品中氯霉素提取方法[1-2]，结果表明dcELISA对水产品中氯霉素残留检测方法灵敏度高，重复性较好，与间接竞争ELISA（icELISA）相比缩短了检测时间和操作步骤，减少了操作误差，更适用于水产品中氯霉素残留的筛选[6]。与气相色谱法相比，ELISA方法样品处理简单方便，尤其适合大批量的检测，并且成本低。因此采用dcELISA方法既可减小实验室的劳动强度，又可节约检验费用，在现场监控和基层检测中有着广阔的推广应用前景，是药物残留检测发展的趋势。本方法在操作过程中应注意的是加入正己烷溶解残渣再与PBS混合时，剧烈的振荡，易产生乳化，从而导致分离不彻底。另外，洗板也是本试验成功与否的关键，如果是手工洗板，将洗板次数增加1～2 次，可提高检测准确度。ELISA方法检测结果往往会出现假阳性，因此，慎重起见，对检出的阳性结果还需用气相色谱法进行进一步验证。
参考文献
[1] 魏书林等.鸡肌肉组织中氯霉素残留ELSIA检测方法的研究[J].中国兽医杂志，2004，40(9):7-9.
[2] 石德时等.氯霉素间接竞争ELSIA(ciELSIA)检测方法的建立[J].中国兽医杂志，2002，22(1):77-79.
[3] Allen E H. Review of chromatographic methods for chloramphenicol residues in milk，egg and tissues from food producing animal[J]. J Assoc Of Anal Chem，1985，68:990-999.
[4] Wal J M. High performance liquid chromatographic determination of chloramphenicol in mink [J].J Assoc Of Anal Chem，1980，63(5):1044-1048.
[5] 蒋定国等.高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素残留量的研究[J].中国食品卫生杂志，2003，15(1):36-38.
[6] 沈美芳等.用酶联免疫法测定水产品中氯霉素的残留量[J].南京师范大学学报，2003，3(2):1-4.
关键词：氯霉素残留；直接竞争酶联免疫法；泥鳅；鲫鱼
氯霉素（Chloramphenicol，CAP）最初是从委内瑞拉链丝菌(Streptomyces Venezuela)的培养液中提取制得，是一类广谱抗生素。氯霉素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有明显的抑制作用，氯霉素由于其优良的抗菌性、稳定的药性和廉价，曾是我国水产养殖中常用的抗菌药之一，长期作为饲料添加剂和细菌性疾病的治疗用药[1]。近年来，研究发现氯霉素存在着严重的毒副作用，易引发再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症以及新生儿、早产儿灰色综合症等[2]。因此，动物性食品中的氯霉素残留问题一直备受关注，引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。中国农业部已将氯霉素从2000年版《中国兽药典》中删除列为禁药，而欧盟的进口食品卫生标准规定“氯霉素含量标准为不得检出。”[3]
目前，氯霉素残留分析主要采用气相色谱法和高效液相色谱法。高效液相色谱法虽然操作简单，但检出限较高，无法满足当前对氯霉素低残留限量的要求。气相色谱法灵敏度较高，但样品前处理过程复杂、分析速度慢、仪器价格昂贵，不适合在基层推广使用[3-4]。自1984年Campbell等建立检测CAP的ELISA以来，国外研究进展较快，国内研究相对滞后。随着ELISA技术的发展直接竞争酶联免疫吸附试验法（dcELISA）越来越体现出更多的优势，基于抗原抗体特异性反应建立起来的dcELISA，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点，可以直接用于生产实践，适用于大规模氯霉素残留筛选检测。
1材料与方法
1.1材料和仪器
Multiskan MK3酶标仪，产地：芬兰；AL104电子天平，产地：上海；FSH-2可调高速匀浆器，产地：常州；DT5-1离心机，产地：北京；乙酸乙酯、正己烷，分析纯，北京化学试剂公司；氯霉素、氯霉素碱、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考等标准品，北京兽药监察所；氯霉素ELISA快速检测试剂盒，北京中检维康技术有限公司；生物样品来源，市售。
1.2样品的前处理
实验所采用样品为泥鳅、鲫鱼，分别取肌肉充分剪切、混匀，用高速组织匀浆器破碎，密封袋密封，标记后－20℃保存。
称取制备的样品3g置50ml离心管中，加入6ml乙酸乙酯，用振荡器强烈混合10min；室温3000g离心10min；取2ml上清液（相当1g样品）在50℃氮气流下吹干；用1ml正己烷溶解干燥的残留物，加入1mlPBS缓冲液振荡混合10min，室温3000g离心10min；去上清液（正己烷），取100μl下层水相用于检测。
1.3抗体交叉反应的测定
抗CAP抗体抑制物分别采用倍比稀释的氯霉素碱、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考，计算各竞争物的IC50， 比较抗体对它们的亲合性。同时，用下式计算各竞争物与抗CAP 抗体的交叉反应。
交叉反应性（%）=IC50（CAP）×100/IC50（竞争物）
1.4分析程序
将所需的的微孔条插入微孔架，每个标准品和样品做2 个平行，记录标准品和样品的位置。加入100μl标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入50μl 稀释了的抗氯霉素抗体酶标记物于微孔内。充分混合，覆盖上薄膜，室温孵育1h。倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打3次，完全除去孔中的液体，每次用250μl洗涤液洗板4次、排干。洗板后加入100μl底物到每个微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15min。加入50μl，2M H2SO4终止液终止反应，用酶标仪在450nm处测量吸光度值（OD值）。
1.5标准曲线的制作及样品浓度的计算
将所获得的标准品和样品的OD值按下式折算成百分比吸光度值：
% 吸光度值 = 标准品或样品的OD值 × 100 / 空白标准品的OD值
以标准样品浓度为横坐标，标准样品的 % 吸光度值为纵坐标，绘制对应氯霉素浓度的半对数校正曲线，样品浓度根据测得的OD值从校正曲线上读出。
2结果
2.1标准曲线
按照1.4步骤，分别测定浓度为0、0.05、0.1、0.3、1、3、10ng/ml氯霉素标准液的OD值，采用RIDASCREEN 数据分析软件建立标准曲线（图1、图2），由图2曲线可知氯霉素浓度在0.05～10ng/ml范围内呈线性，线性方程为Y = -0.33-1.88X。相关系数：r = 0.997
2.2回收率
向样品中分别添加3个浓度水平的氯霉素标样：0.1、0.3、0.9ng/g，每个浓度做4个平行，同时做4个空白样。按1.2处理后测定氯霉素含量，计算回收率，结果如表1所示。
2.3灵敏度
按照1.4步骤同时测定10个“0”标准溶液的OD值，求出其平均值（X），再减去两倍标准差（SD），从标准曲线上查出对应于OD值为X－2SD的浓度，即为灵敏度。该方法的平均灵敏度为0.05ng/g。
2.4精密度
采用变异系数表示法，在同一次测定中对3个浓度水平的样品分别重复测定5次，计算批内变异系数。分别测定3个浓度水平的样品在3个不同批次测定之间的变异系数，即为批间变异系数。结果如表2所示。
2.5交叉反应
CAP抗体与结构类似物的交叉反应结果见表3
3讨论
目前文献报道的氯霉素的dcELISA针对水产品的检测的报道较少。本试验是参照“鸡肉和牛奶中氯霉素的提取方法”而建立的水产品中氯霉素提取方法[1-2]，结果表明dcELISA对水产品中氯霉素残留检测方法灵敏度高，重复性较好，与间接竞争ELISA（icELISA）相比缩短了检测时间和操作步骤，减少了操作误差，更适用于水产品中氯霉素残留的筛选[6]。与气相色谱法相比，ELISA方法样品处理简单方便，尤其适合大批量的检测，并且成本低。因此采用dcELISA方法既可减小实验室的劳动强度，又可节约检验费用，在现场监控和基层检测中有着广阔的推广应用前景，是药物残留检测发展的趋势。本方法在操作过程中应注意的是加入正己烷溶解残渣再与PBS混合时，剧烈的振荡，易产生乳化，从而导致分离不彻底。另外，洗板也是本试验成功与否的关键，如果是手工洗板，将洗板次数增加1～2 次，可提高检测准确度。ELISA方法检测结果往往会出现假阳性，因此，慎重起见，对检出的阳性结果还需用气相色谱法进行进一步验证。
参考文献
[1] 魏书林等.鸡肌肉组织中氯霉素残留ELSIA检测方法的研究[J].中国兽医杂志，2004，40(9):7-9.
[2] 石德时等.氯霉素间接竞争ELSIA(ciELSIA)检测方法的建立[J].中国兽医杂志，2002，22(1):77-79.
[3] Allen E H. Review of chromatographic methods for chloramphenicol residues in milk，egg and tissues from food producing animal[J]. J Assoc Of Anal Chem，1985，68:990-999.
[4] Wal J M. High performance liquid chromatographic determination of chloramphenicol in mink [J].J Assoc Of Anal Chem，1980，63(5):1044-1048.
[5] 蒋定国等.高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素残留量的研究[J].中国食品卫生杂志，2003，15(1):36-38.
[6] 沈美芳等.用酶联免疫法测定水产品中氯霉素的残留量[J].南京师范大学学报，2003，3(2):1-4.