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摘要瓜类褪绿黄化病毒Cucurbits chlorotic yellows virus （CCYV）、甜瓜黄化斑点病毒Melon yellow spot virus （MYSV）及甜瓜坏死斑点病毒Melon necrotic spot virus （MNSV）是近年来报道侵染瓜类作物的新病毒，在个别种植区大面积发生，对生产构成严重威胁。为了解3种病毒在广西的发生情况，先后到各西甜瓜种植区进行了调查，并采集疑似CCYV、MYSV及MNSV的甜瓜病叶样品，提取病叶总RNA，通过特异性引物分别进行一步法RTPCR扩增，电泳结果显示RTPCR产物与预期大小一致的序列条带；将扩增产物分别连接到pMD19T克隆载体上，挑选阳性克隆子进行序列测定及比对分析。结果表明：CCYV、MYSV和MNSV广西分离物的CP基因序列与其他已报道核苷酸序列一致性分别达95.1%～100%、96.5%～99%和83.7%～92.5%。
关键词广西；瓜类褪绿黄化病毒；甜瓜黄化斑点病毒；甜瓜坏死斑点病毒；一步法RTPCR
中图分类号： S 436.5
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.03.014
Molecular detection and identification of three viruses isolated
from melons in Guangxi
Yang Shi’an1，2，Li Zhanbiao2，Qin Bixia2，Xie Huiting2，
Cui Lixian2，Su Qin2，Deng Tiejun2，Cai Jianhe2
（1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning530004， China； 2. Guangxi Key
Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests， Plant Protection Research
Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning530007， China）
Abstract
Cucurbit chlorotic yellows virus （CCYV）， Melon yellow spot virus （MYSV） and Melon necrotic spot virus （MNSV）， which were emerging threat to melon plantation， have recently been found infecting melons in some large melongrowing areas. In order to understand the incidences of these three viruses， a survey was conducted on these viruses on melons， and leaves infected by CCYV， MYSV and MNSV were collected from Nanning and Beihai， Guangxi. Total RNAs were extracted from these diseased samples and RTPCR was performed by using specific primers. The PCR products were purified and inserted into pMD19T cloning vector， and the expected DNA fragment were sequenced and analyzed by BLASTn in GenBank. The results showed that nucleocapsid protein gene sequences of CCYV， MYSV and MNSV isolates from Guangxi had 95.1%-100%， 96.5%-99% and 83.7%-92.5% identities with those of the isolates from other parts of China or some countries reported previously.
Key words
Guangxi；Cucurbit chlorotic yellows virus（CCYV）；Melon yellow spot virus（MYSV）；Melon necrotic spot virus（MNSV）；onestep RTPCR
甜瓜Cucumis melo L.是世界上重要的葫芦科作物，起源于非洲、美洲和东南亚等热带地区，在热带地区、温带地区的温和气候季节广泛种植。在我国，甜瓜的种植几乎遍布大江南北。广西依其得天独厚的气候条件成为华南重要的甜瓜产区。甜瓜不仅种植面积广而且品种繁多，有包括‘广甜二号’、‘丰蜜三号’、‘金蜜宝’、‘翠蜜宝’、‘好运52’、‘广蜜1号’、‘好运11’、‘北甜1号’、‘京玉5号’、‘桂蜜12号’等在内的数十个品种[14]。近年来，各种病虫害，如细菌性果斑病、根结线虫病、蔓枯病和病毒病等，严重影响甜瓜的产量和品质，其中病毒病的危害尤为严重。瓜类褪绿黄化病毒、甜瓜黄斑病毒和甜瓜坏死斑点病毒是甜瓜上新发生的病毒病害，对甜瓜生产具有潜在的威胁。
瓜类褪绿黄化病毒Cucurbit chlorotic yellows virus （CCYV）属于长线病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus。病毒颗粒为长线形，基因组由双链RNA组成，即RNA1（8 607 nt）和RNA2（8 041 nt）。CCYV通過介体烟粉虱 Bemisia tabaci（Gennadius）进行半持久性传播，主要危害西瓜、甜瓜、黄瓜等，以大面积侵染甜瓜最为常见。该病最早于2004年在日本观察到，直至2010年其病原才被鉴定出来[5]。我国古勤生等[67]于2011年在宁波、上海等地观察报道了CCYV。随后海南、河南、北京和山东等地均报道了该病害[810]。 甜瓜黄化斑点病毒Melon yellow spot virus （MYSV），属于布尼亚病毒科Bunyaviridae番茄斑萎病毒属Tospovirus。病毒粒体为具有包膜的球体，基因组包括3个单链线性RNA片段，即L RNA、M RNA和S RNA。MYSV在植株间主要是通过节瓜蓟马Thrips palmi（又称棕榈蓟马）以持久增殖方式自然传播，也可通过汁液机械传播。MYSV主要危害甜瓜、西瓜、黄瓜和苦瓜等葫芦科作物，该病毒于2000年在日本首次发现并命名[11]。2008年发现我国台湾的西瓜受到该病毒侵染[12]，2009年海南省发现三亚市大棚甜瓜受到该病毒侵染[1314]。随后，在广东的西瓜和山东寿光的黄瓜上也发现了该病毒[1516]。
甜瓜坏死斑点病毒Melon necrotic spot virus（MNSV）属于番茄丛矮病毒科Tombusviridae香石竹斑驳病毒属Carmovirus，病毒粒体为球形，基因组为正义单链RNA，约4.3 kb。甜瓜坏死斑点病毒主要通过种子、土壤真菌瓜油壶菌Olpidium radicale和黄瓜黑头叶甲Diabrotica sp.进行自然传播，另外还可以通过机械摩擦传播。MNSV的寄主范围限于葫芦科植物西瓜、南瓜、葫芦、黄瓜、甜瓜等，其中甜瓜为系统侵染寄主。甜瓜坏死斑点病毒由日本最先报道，随后在美国、希腊、瑞典、意大利和突尼斯等国家出现[17]。我国于2007年在江苏省海门市温室甜瓜中发现该病毒[18]，2015年山东寿光也报道了该病毒[10]。
CCYV、MYSV和MNSV自发现报道以来，其危害范围不断扩大。CCYV与MYSV在广西虽有分布[6，14]，但未进行分子检测；MNSV在广西的研究更是空白。快速有效地檢测、鉴定是病毒病防治的基础，本研究采用一步RTPCR方法对具有典型CCYV、MYSV和MNSV症状的甜瓜病样进行检测，并对病毒的部分序列进行了测定与分析。研究结果对广西地区甜瓜上病毒的快速检测鉴定，综合防治措施拟定以及基因结构特征与变异、病害流行规律和抗病育种均具有重要的意义。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品来源
疑似CCYV、MYSV及MNSV病叶样品采集于广西甜瓜主产区南宁市和北海市，共采集37份样品，样品保存于-80℃待用。
1.1.2试剂
植物总RNA提取试剂盒、一步法RTPCR试剂盒和PCR产物回收试剂盒、pMD19T连接载体和大肠杆菌DH5α感受态细胞以及质粒提取试剂盒等均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2方法
1.2.1植物总RNA提取
称取甜瓜病叶、健叶各100 mg，参照植物RNA提取试剂盒说明书提取叶片组织总RNA。
1.2.2引物合成
根据NCBI上已报道的病毒序列，经过比对分析，选择各病毒基因保守区分别设计CCYV、MYSV及MNSV特异性引物，引物由立菲生物技术有限公司合成。引物序列见表1。
1.2.3RTPCR扩增
RTPCR反应体系：2.5 μL模板，2 μL PrimeScript 1 step Enzyme Mix，25 μL 2×1 step buffer，1 μL正/反向引物，18.5 μL RNasefree water，共50 μL。
RTPCR一步法反应条件：50℃ 30 min；94℃预变性2 min；94℃变性30 s，58/58/50℃退火30 s，延伸45 s（30个循环）；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.2.4RTPCR产物回收及克隆测序
根据PCR产物回收试剂盒说明，对PCR产物进行相应目的片段的快速回收，并将其分别与pMD19T克隆载体连接，连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中，经PCR鉴定的阳性菌落进行接种培养和质粒提取。测序由上海立菲生物科技有限公司完成。
1.2.5序列分析
测序结果利用Vector NTI 11.5.1软件进行序列的拼接和比对分析；利用MEGA 6.0软件通过邻近相邻法（neighbourjoining）和最大似然组成模型法（maximum composite likelihood method）构建系统发育树。构建系统发育树所用到的各病毒分离株信息（基因登录号、名称、寄主、其来源地及参考文献）见表2。
2结果与分析
2.1RTPCR检测与鉴定
于广西壮族自治区南宁市和北海市的甜瓜种植区采集有褪绿黄化、黄色斑点和褪绿坏死斑症状的甜瓜病叶，进行分子检测。分别提取不同症状表现的甜瓜病叶样品总RNA作为RTPCR的模板，用3种病毒的特异性引物进行RTPCR扩增，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，疑似感病样品扩增产物的电泳条带如图1～3，大小与所设计引物的目标片段大小（CCYV 877 bp、MYSV 840 bp和MNSV 651 bp）基本一致。由于缺少阳性对照，为了证实检测结果的可靠性，我们将RTPCR产物纯化后进行直接测序，序列经NCBI的Blastn比对，结果显示，所扩增的产物序列与NCBI上CCYV、MYSV、MNSV的序列相似性分别达95%～100%、96～99%和85%～92%。经RTPCR方法对样品进行检测，CCYV、MYSV和MNSV检出率分别为68.7%、72.7%和70%。
2.2CCYV、MYSV和MNSV广西分离物序列分析
将3种病毒的RTPCR纯化产物克隆至pMD19T载体，挑选阳性克隆进行测序，经Vector NTI 11.5.1拼接，CCYV、MYSV和MNSV广西分离物的CP基因特异性引物的扩增产物序列分别由877、840和651 bp核苷酸组成。分别通过NCBI Blastn和GenBank序列对比，下载我国其他省份以及世界其他国家和地区已上传的分离株序列进行分析。 通过Vector NTI 11.5.1的AlignX将所得的CCYV广西分离物（CCYVGX）与我国及其他国家或地区分离物的核苷酸序列进行两两比对。结果发现：CCYV广西分离物（CCYVGX）与中国大陆分离物（JQ904629.1、HM581658.1、KJ735450.1、KJ149806.1、KP896506.1和KU507602.1）、中国台湾分离物（JN126046.1、JF502222.1）等地区分离物的核苷酸相似性达99.6%～100%；与沙特阿拉伯分离物（KT946811.1）核苷酸相似性为98.0%；与伊朗分离物（KC577202.1）核苷酸相似性仅95.1%。利用MEGA 6.06软件对CCYV广西分离物（CCYVGX）与我国及其他国家或地区相应分离物的核苷酸序列构建系统发育树（图4），结果表明：CCYV广西分离物（CCYVGX）与沙特阿拉伯分离物（KT946811.1）和伊朗分离物（KC577202.1）在不同分支上，亲缘关系较远；与其他13个分离物，其中包括6个中国大陆分离物（JQ904629.1、HM581658.1、KJ735450.1、KJ149806.1、K和KP896506.1）和2个中国台湾分离物（JN126046.1、JF502222.1）在同一支上，亲缘关系最近。
通过Vector NTI 11.5.1的AlignX将所得的MYSV广西分离物（MYSVGX）与我国及其他国家或地区分离物核苷酸序列进行两两比对分析。结果发现：中国广西分离物（MYSVGX）与中国三亚分离物（GQ397254.2）、中国上海分离物（KP247476.1）、中国广州分离物（HQ711861.1）核苷酸相似性达99.6%以上；与日本分离物（AB038343.1、AB024332.1）、泰国分离物（AF067151.1）、厄瓜多尔分离物（KJ196383.1）、中国台湾分离物（FJ386391.1）、印度分离物（HM590470.1）等14个分离物核苷酸相似性达96.5%～98.6%。利用MEGA 6.06软件对MYSV广西分离物（MYSVGX）与我国及其他国家或地区相应分离物的核苷酸序列构建系统发育树（图5），结果表明：MYSV广西分离物（MYSVGX）与中国三亚、上海、广州（GQ397254.2、KP247476.1、HQ711861.1）以及泰国分离物（AF067151.1）和厄瓜多尔分离物（KJ196383.1）在一个分支上，亲缘关系最近；与泰国分离物（AY673636.1、AY673635.1、FR714507.1、AM087021.1）、日本分离物（AB038343.1、AB024332.1）和中国台湾分离物（FJ386391.1）亲缘关系较近；与日本分离物（AB076250.1、AB453910.1和AB453911.1）、印度分离物（HM590470.1）、泰国分离物（AM087020.1）处于不同分支，亲缘关系较远。
通过Vector NTI 11.5.1的AlignX将所得的MNSV广西分离物（MNSVGX）与我国及其他国家或地区分离物核苷酸序列进行两两比对分析，结果发现：中国广西分离物（MNSVGX）与中国海门分离物（GU480022.1）、中国新疆分离物（KP406627.1）等分离物的核苷酸序列相似性达91.4%～92.5%；与洪都拉斯分离物（EU848551.1）、美国分离物（KT923150.1）等分离物的核苷酸序列相似性达89.1%～90.8%；与日本分离物（D29663.1）和西班牙分离物（AY122286.1）核苷酸序列相似性仅为84.6%和83.7%。利用MEGA 6.06软件对MNSV广西分离物（MNSVGX）与我国及其他国家或地区相应分离物的核苷酸序列构建系统发育树（图6），结果表明：MNSV广西分离物（MNSVGX）处于一个小支上，但与中国新疆分离物（KP406627.1）、中国海门分离物（EU016217.1）、洪都拉斯分离物（EU848551.1）、巴拿马分离物（DQ443546.1）等处于一个大分支上，亲缘关系最近；其次是日本分离物（AB007001.1、AB044292.2、AB189943.1）及韩国分离物（AB106106.1）；与日本分离物（D29663.1）和西班牙分离物（AY122286.1）亲缘关系相对较远。
3讨论与结论
瓜类褪绿黄化病毒、甜瓜黄斑病毒以及甜瓜坏死斑点病毒是近年来新发现的病毒，尽管没有在各省区大范围发生，但局部发生情况比较严重。据报道，2009年海南三亚保护地甜瓜上甜瓜黃斑病毒的发病率为30%～100%，给甜瓜生产造成了严重的经济损失[14]。据本课题组2014—2015年调查发现，这3种病毒在广西南宁市和北海市的甜瓜种植区有不同程度的发生，其中CCYV在北海、南宁的发病率在20%～70%。随着甜瓜栽培规模和范围的不断扩大，烟粉虱和蓟马等传播媒介种群暴发，这3种病毒病的发生范围将越来越广泛，危害程度日趋严重，及时有效的诊断方法对病害防治尤其重要。
本研究从疑似病毒病的样品中挑选不同症状的样本分别进行3种病毒检测，把检测结果对应其症状，瓜类褪绿黄化病毒（CCYV）引起的是褪绿黄化症状，但类似症状存在未检出现象，可能是缺素引起抑或是其他病毒比如瓜类黄矮失调病毒（CYSDV）[39]引起，有待于进一步研究；甜瓜黄斑病毒（MYSV）引起黄色不规则斑点症状，后期黄斑中间会形成枯死斑，与古勤生[13]等报道的症状表现基本一致；甜瓜坏死斑点病毒（MNSV）引起不规则白色坏死斑沿叶脉分布，叶片还有褪绿症状，与乔宁等[10]描述症状“叶片上产生许多‘米黄点’”相异，可能由于寄主和发病时期不同或其他因素所致。病毒在不同寄主以及寄主不同生长期所表现的症状有差别，同时，各个地域的气候条件和病原群落的构成差异也会影响病毒在寄主上的表征，所以在把握症状的同时需建立快速有效的检测技术，为有效的甜瓜病毒病防治打下基础。CCYV和MYSV分别通过烟粉虱和棕榈蓟马传播，加强栽培管理，治虫防病是防治病毒病的关键；MNSV不仅能通过土壤真菌瓜油壶菌Olpidium radicale和黄瓜叶甲Diabrotica sp.进行自然传播，而且能经种子及水体传播，防治更加困难。了解病害症状和明确病原、传播方式及寄主范围（特别是中间寄主）是防治甜瓜病毒病的关键，快速有效的检测鉴定方法是病毒病防治的基础。刘珊珊等[9]采用两步法RTPCR对海南省和河南省瓜类褪绿黄化病病原进行分子鉴定，乔宁等[10，16]也运用两步法RTPCR对山东寿光CCYV、MYSV和MNSV病毒分离物进行分子鉴定，刘勇等[15]运用一步法RTPCR在广东西瓜上检测到MYSV。此外施艳等[4041]还针对CCYV外壳蛋白基因和P22基因制备检测病毒的抗血清，曾蓉等[42]也针对CCYV上海分离物外壳蛋白制备检测病毒的抗血清。梁相志等[43]利用环介导等温扩增技术检测介体烟粉虱体内的瓜类褪绿黄化病毒。本研究采用一步RTPCR方法对为害甜瓜的3种病毒进行检测鉴定，进一步提高了病毒病的检测效率。 通过序列比对和系统发育树分析，CCYV、MYSV和MNSV广西分离物核酸序列与已报道序列相似性达90%以上，属于同种病毒。CCYV广西分离物与伊朗分离物核苷酸相似性只有95.1%，与其他分离物序列相似性均达99%以上，系统发育树分析与乔宁等[10]的报道基本一致，说明CCYV来源基本相同，变异发生率较低。MYSV广西分离物与中国其他分离物核苷酸一致性高达99.5%以上，广西分离物与中国三亚、广州、上海分离物处于同一分支、与乔宁等[16]构建的系统发育树各分离物分布基本一致，说明中国分离物来源基本相同。MNSV广西分离物与其他分离物核苷酸序列一致性仅为83.7%～92.5%，差异稍大，系统发育树分析MNSV广西分离物单独处于一个分支上，与中国海门分离物、中国新疆分离物等处于一个大分支，亲缘关系最近；其次与日本分离物及韩国分离物亲缘关系较近，亲缘关系较远的是日本分离物（D29663.1）和西班牙分离物（AY122286.1），推测MNSV广西分离物可能与日本韩国分离物来源相同。温少华[44]对MNSV中国海门分离物（GU480022.1）的全基因组进行克隆测序与结构分析，MNSV在广西为首次报道，与其他分离物存在一定差异，有必要对MNSV广西分离物的全基因组进行序列结构分析，以便了解各个分离物分子结构特征及基因变异情况。
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（责任编辑：田喆）
关键词广西；瓜类褪绿黄化病毒；甜瓜黄化斑点病毒；甜瓜坏死斑点病毒；一步法RTPCR
中图分类号： S 436.5
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.03.014
Molecular detection and identification of three viruses isolated
from melons in Guangxi
Yang Shi’an1，2，Li Zhanbiao2，Qin Bixia2，Xie Huiting2，
Cui Lixian2，Su Qin2，Deng Tiejun2，Cai Jianhe2
（1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning530004， China； 2. Guangxi Key
Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests， Plant Protection Research
Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning530007， China）
Abstract
Cucurbit chlorotic yellows virus （CCYV）， Melon yellow spot virus （MYSV） and Melon necrotic spot virus （MNSV）， which were emerging threat to melon plantation， have recently been found infecting melons in some large melongrowing areas. In order to understand the incidences of these three viruses， a survey was conducted on these viruses on melons， and leaves infected by CCYV， MYSV and MNSV were collected from Nanning and Beihai， Guangxi. Total RNAs were extracted from these diseased samples and RTPCR was performed by using specific primers. The PCR products were purified and inserted into pMD19T cloning vector， and the expected DNA fragment were sequenced and analyzed by BLASTn in GenBank. The results showed that nucleocapsid protein gene sequences of CCYV， MYSV and MNSV isolates from Guangxi had 95.1%-100%， 96.5%-99% and 83.7%-92.5% identities with those of the isolates from other parts of China or some countries reported previously.
Key words
Guangxi；Cucurbit chlorotic yellows virus（CCYV）；Melon yellow spot virus（MYSV）；Melon necrotic spot virus（MNSV）；onestep RTPCR
甜瓜Cucumis melo L.是世界上重要的葫芦科作物，起源于非洲、美洲和东南亚等热带地区，在热带地区、温带地区的温和气候季节广泛种植。在我国，甜瓜的种植几乎遍布大江南北。广西依其得天独厚的气候条件成为华南重要的甜瓜产区。甜瓜不仅种植面积广而且品种繁多，有包括‘广甜二号’、‘丰蜜三号’、‘金蜜宝’、‘翠蜜宝’、‘好运52’、‘广蜜1号’、‘好运11’、‘北甜1号’、‘京玉5号’、‘桂蜜12号’等在内的数十个品种[14]。近年来，各种病虫害，如细菌性果斑病、根结线虫病、蔓枯病和病毒病等，严重影响甜瓜的产量和品质，其中病毒病的危害尤为严重。瓜类褪绿黄化病毒、甜瓜黄斑病毒和甜瓜坏死斑点病毒是甜瓜上新发生的病毒病害，对甜瓜生产具有潜在的威胁。
瓜类褪绿黄化病毒Cucurbit chlorotic yellows virus （CCYV）属于长线病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus。病毒颗粒为长线形，基因组由双链RNA组成，即RNA1（8 607 nt）和RNA2（8 041 nt）。CCYV通過介体烟粉虱 Bemisia tabaci（Gennadius）进行半持久性传播，主要危害西瓜、甜瓜、黄瓜等，以大面积侵染甜瓜最为常见。该病最早于2004年在日本观察到，直至2010年其病原才被鉴定出来[5]。我国古勤生等[67]于2011年在宁波、上海等地观察报道了CCYV。随后海南、河南、北京和山东等地均报道了该病害[810]。 甜瓜黄化斑点病毒Melon yellow spot virus （MYSV），属于布尼亚病毒科Bunyaviridae番茄斑萎病毒属Tospovirus。病毒粒体为具有包膜的球体，基因组包括3个单链线性RNA片段，即L RNA、M RNA和S RNA。MYSV在植株间主要是通过节瓜蓟马Thrips palmi（又称棕榈蓟马）以持久增殖方式自然传播，也可通过汁液机械传播。MYSV主要危害甜瓜、西瓜、黄瓜和苦瓜等葫芦科作物，该病毒于2000年在日本首次发现并命名[11]。2008年发现我国台湾的西瓜受到该病毒侵染[12]，2009年海南省发现三亚市大棚甜瓜受到该病毒侵染[1314]。随后，在广东的西瓜和山东寿光的黄瓜上也发现了该病毒[1516]。
甜瓜坏死斑点病毒Melon necrotic spot virus（MNSV）属于番茄丛矮病毒科Tombusviridae香石竹斑驳病毒属Carmovirus，病毒粒体为球形，基因组为正义单链RNA，约4.3 kb。甜瓜坏死斑点病毒主要通过种子、土壤真菌瓜油壶菌Olpidium radicale和黄瓜黑头叶甲Diabrotica sp.进行自然传播，另外还可以通过机械摩擦传播。MNSV的寄主范围限于葫芦科植物西瓜、南瓜、葫芦、黄瓜、甜瓜等，其中甜瓜为系统侵染寄主。甜瓜坏死斑点病毒由日本最先报道，随后在美国、希腊、瑞典、意大利和突尼斯等国家出现[17]。我国于2007年在江苏省海门市温室甜瓜中发现该病毒[18]，2015年山东寿光也报道了该病毒[10]。
CCYV、MYSV和MNSV自发现报道以来，其危害范围不断扩大。CCYV与MYSV在广西虽有分布[6，14]，但未进行分子检测；MNSV在广西的研究更是空白。快速有效地檢测、鉴定是病毒病防治的基础，本研究采用一步RTPCR方法对具有典型CCYV、MYSV和MNSV症状的甜瓜病样进行检测，并对病毒的部分序列进行了测定与分析。研究结果对广西地区甜瓜上病毒的快速检测鉴定，综合防治措施拟定以及基因结构特征与变异、病害流行规律和抗病育种均具有重要的意义。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品来源
疑似CCYV、MYSV及MNSV病叶样品采集于广西甜瓜主产区南宁市和北海市，共采集37份样品，样品保存于-80℃待用。
1.1.2试剂
植物总RNA提取试剂盒、一步法RTPCR试剂盒和PCR产物回收试剂盒、pMD19T连接载体和大肠杆菌DH5α感受态细胞以及质粒提取试剂盒等均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2方法
1.2.1植物总RNA提取
称取甜瓜病叶、健叶各100 mg，参照植物RNA提取试剂盒说明书提取叶片组织总RNA。
1.2.2引物合成
根据NCBI上已报道的病毒序列，经过比对分析，选择各病毒基因保守区分别设计CCYV、MYSV及MNSV特异性引物，引物由立菲生物技术有限公司合成。引物序列见表1。
1.2.3RTPCR扩增
RTPCR反应体系：2.5 μL模板，2 μL PrimeScript 1 step Enzyme Mix，25 μL 2×1 step buffer，1 μL正/反向引物，18.5 μL RNasefree water，共50 μL。
RTPCR一步法反应条件：50℃ 30 min；94℃预变性2 min；94℃变性30 s，58/58/50℃退火30 s，延伸45 s（30个循环）；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.2.4RTPCR产物回收及克隆测序
根据PCR产物回收试剂盒说明，对PCR产物进行相应目的片段的快速回收，并将其分别与pMD19T克隆载体连接，连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中，经PCR鉴定的阳性菌落进行接种培养和质粒提取。测序由上海立菲生物科技有限公司完成。
1.2.5序列分析
测序结果利用Vector NTI 11.5.1软件进行序列的拼接和比对分析；利用MEGA 6.0软件通过邻近相邻法（neighbourjoining）和最大似然组成模型法（maximum composite likelihood method）构建系统发育树。构建系统发育树所用到的各病毒分离株信息（基因登录号、名称、寄主、其来源地及参考文献）见表2。
2结果与分析
2.1RTPCR检测与鉴定
于广西壮族自治区南宁市和北海市的甜瓜种植区采集有褪绿黄化、黄色斑点和褪绿坏死斑症状的甜瓜病叶，进行分子检测。分别提取不同症状表现的甜瓜病叶样品总RNA作为RTPCR的模板，用3种病毒的特异性引物进行RTPCR扩增，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，疑似感病样品扩增产物的电泳条带如图1～3，大小与所设计引物的目标片段大小（CCYV 877 bp、MYSV 840 bp和MNSV 651 bp）基本一致。由于缺少阳性对照，为了证实检测结果的可靠性，我们将RTPCR产物纯化后进行直接测序，序列经NCBI的Blastn比对，结果显示，所扩增的产物序列与NCBI上CCYV、MYSV、MNSV的序列相似性分别达95%～100%、96～99%和85%～92%。经RTPCR方法对样品进行检测，CCYV、MYSV和MNSV检出率分别为68.7%、72.7%和70%。
2.2CCYV、MYSV和MNSV广西分离物序列分析
将3种病毒的RTPCR纯化产物克隆至pMD19T载体，挑选阳性克隆进行测序，经Vector NTI 11.5.1拼接，CCYV、MYSV和MNSV广西分离物的CP基因特异性引物的扩增产物序列分别由877、840和651 bp核苷酸组成。分别通过NCBI Blastn和GenBank序列对比，下载我国其他省份以及世界其他国家和地区已上传的分离株序列进行分析。 通过Vector NTI 11.5.1的AlignX将所得的CCYV广西分离物（CCYVGX）与我国及其他国家或地区分离物的核苷酸序列进行两两比对。结果发现：CCYV广西分离物（CCYVGX）与中国大陆分离物（JQ904629.1、HM581658.1、KJ735450.1、KJ149806.1、KP896506.1和KU507602.1）、中国台湾分离物（JN126046.1、JF502222.1）等地区分离物的核苷酸相似性达99.6%～100%；与沙特阿拉伯分离物（KT946811.1）核苷酸相似性为98.0%；与伊朗分离物（KC577202.1）核苷酸相似性仅95.1%。利用MEGA 6.06软件对CCYV广西分离物（CCYVGX）与我国及其他国家或地区相应分离物的核苷酸序列构建系统发育树（图4），结果表明：CCYV广西分离物（CCYVGX）与沙特阿拉伯分离物（KT946811.1）和伊朗分离物（KC577202.1）在不同分支上，亲缘关系较远；与其他13个分离物，其中包括6个中国大陆分离物（JQ904629.1、HM581658.1、KJ735450.1、KJ149806.1、K和KP896506.1）和2个中国台湾分离物（JN126046.1、JF502222.1）在同一支上，亲缘关系最近。
通过Vector NTI 11.5.1的AlignX将所得的MYSV广西分离物（MYSVGX）与我国及其他国家或地区分离物核苷酸序列进行两两比对分析。结果发现：中国广西分离物（MYSVGX）与中国三亚分离物（GQ397254.2）、中国上海分离物（KP247476.1）、中国广州分离物（HQ711861.1）核苷酸相似性达99.6%以上；与日本分离物（AB038343.1、AB024332.1）、泰国分离物（AF067151.1）、厄瓜多尔分离物（KJ196383.1）、中国台湾分离物（FJ386391.1）、印度分离物（HM590470.1）等14个分离物核苷酸相似性达96.5%～98.6%。利用MEGA 6.06软件对MYSV广西分离物（MYSVGX）与我国及其他国家或地区相应分离物的核苷酸序列构建系统发育树（图5），结果表明：MYSV广西分离物（MYSVGX）与中国三亚、上海、广州（GQ397254.2、KP247476.1、HQ711861.1）以及泰国分离物（AF067151.1）和厄瓜多尔分离物（KJ196383.1）在一个分支上，亲缘关系最近；与泰国分离物（AY673636.1、AY673635.1、FR714507.1、AM087021.1）、日本分离物（AB038343.1、AB024332.1）和中国台湾分离物（FJ386391.1）亲缘关系较近；与日本分离物（AB076250.1、AB453910.1和AB453911.1）、印度分离物（HM590470.1）、泰国分离物（AM087020.1）处于不同分支，亲缘关系较远。
通过Vector NTI 11.5.1的AlignX将所得的MNSV广西分离物（MNSVGX）与我国及其他国家或地区分离物核苷酸序列进行两两比对分析，结果发现：中国广西分离物（MNSVGX）与中国海门分离物（GU480022.1）、中国新疆分离物（KP406627.1）等分离物的核苷酸序列相似性达91.4%～92.5%；与洪都拉斯分离物（EU848551.1）、美国分离物（KT923150.1）等分离物的核苷酸序列相似性达89.1%～90.8%；与日本分离物（D29663.1）和西班牙分离物（AY122286.1）核苷酸序列相似性仅为84.6%和83.7%。利用MEGA 6.06软件对MNSV广西分离物（MNSVGX）与我国及其他国家或地区相应分离物的核苷酸序列构建系统发育树（图6），结果表明：MNSV广西分离物（MNSVGX）处于一个小支上，但与中国新疆分离物（KP406627.1）、中国海门分离物（EU016217.1）、洪都拉斯分离物（EU848551.1）、巴拿马分离物（DQ443546.1）等处于一个大分支上，亲缘关系最近；其次是日本分离物（AB007001.1、AB044292.2、AB189943.1）及韩国分离物（AB106106.1）；与日本分离物（D29663.1）和西班牙分离物（AY122286.1）亲缘关系相对较远。
3讨论与结论
瓜类褪绿黄化病毒、甜瓜黄斑病毒以及甜瓜坏死斑点病毒是近年来新发现的病毒，尽管没有在各省区大范围发生，但局部发生情况比较严重。据报道，2009年海南三亚保护地甜瓜上甜瓜黃斑病毒的发病率为30%～100%，给甜瓜生产造成了严重的经济损失[14]。据本课题组2014—2015年调查发现，这3种病毒在广西南宁市和北海市的甜瓜种植区有不同程度的发生，其中CCYV在北海、南宁的发病率在20%～70%。随着甜瓜栽培规模和范围的不断扩大，烟粉虱和蓟马等传播媒介种群暴发，这3种病毒病的发生范围将越来越广泛，危害程度日趋严重，及时有效的诊断方法对病害防治尤其重要。
本研究从疑似病毒病的样品中挑选不同症状的样本分别进行3种病毒检测，把检测结果对应其症状，瓜类褪绿黄化病毒（CCYV）引起的是褪绿黄化症状，但类似症状存在未检出现象，可能是缺素引起抑或是其他病毒比如瓜类黄矮失调病毒（CYSDV）[39]引起，有待于进一步研究；甜瓜黄斑病毒（MYSV）引起黄色不规则斑点症状，后期黄斑中间会形成枯死斑，与古勤生[13]等报道的症状表现基本一致；甜瓜坏死斑点病毒（MNSV）引起不规则白色坏死斑沿叶脉分布，叶片还有褪绿症状，与乔宁等[10]描述症状“叶片上产生许多‘米黄点’”相异，可能由于寄主和发病时期不同或其他因素所致。病毒在不同寄主以及寄主不同生长期所表现的症状有差别，同时，各个地域的气候条件和病原群落的构成差异也会影响病毒在寄主上的表征，所以在把握症状的同时需建立快速有效的检测技术，为有效的甜瓜病毒病防治打下基础。CCYV和MYSV分别通过烟粉虱和棕榈蓟马传播，加强栽培管理，治虫防病是防治病毒病的关键；MNSV不仅能通过土壤真菌瓜油壶菌Olpidium radicale和黄瓜叶甲Diabrotica sp.进行自然传播，而且能经种子及水体传播，防治更加困难。了解病害症状和明确病原、传播方式及寄主范围（特别是中间寄主）是防治甜瓜病毒病的关键，快速有效的检测鉴定方法是病毒病防治的基础。刘珊珊等[9]采用两步法RTPCR对海南省和河南省瓜类褪绿黄化病病原进行分子鉴定，乔宁等[10，16]也运用两步法RTPCR对山东寿光CCYV、MYSV和MNSV病毒分离物进行分子鉴定，刘勇等[15]运用一步法RTPCR在广东西瓜上检测到MYSV。此外施艳等[4041]还针对CCYV外壳蛋白基因和P22基因制备检测病毒的抗血清，曾蓉等[42]也针对CCYV上海分离物外壳蛋白制备检测病毒的抗血清。梁相志等[43]利用环介导等温扩增技术检测介体烟粉虱体内的瓜类褪绿黄化病毒。本研究采用一步RTPCR方法对为害甜瓜的3种病毒进行检测鉴定，进一步提高了病毒病的检测效率。 通过序列比对和系统发育树分析，CCYV、MYSV和MNSV广西分离物核酸序列与已报道序列相似性达90%以上，属于同种病毒。CCYV广西分离物与伊朗分离物核苷酸相似性只有95.1%，与其他分离物序列相似性均达99%以上，系统发育树分析与乔宁等[10]的报道基本一致，说明CCYV来源基本相同，变异发生率较低。MYSV广西分离物与中国其他分离物核苷酸一致性高达99.5%以上，广西分离物与中国三亚、广州、上海分离物处于同一分支、与乔宁等[16]构建的系统发育树各分离物分布基本一致，说明中国分离物来源基本相同。MNSV广西分离物与其他分离物核苷酸序列一致性仅为83.7%～92.5%，差异稍大，系统发育树分析MNSV广西分离物单独处于一个分支上，与中国海门分离物、中国新疆分离物等处于一个大分支，亲缘关系最近；其次与日本分离物及韩国分离物亲缘关系较近，亲缘关系较远的是日本分离物（D29663.1）和西班牙分离物（AY122286.1），推测MNSV广西分离物可能与日本韩国分离物来源相同。温少华[44]对MNSV中国海门分离物（GU480022.1）的全基因组进行克隆测序与结构分析，MNSV在广西为首次报道，与其他分离物存在一定差异，有必要对MNSV广西分离物的全基因组进行序列结构分析，以便了解各个分离物分子结构特征及基因变异情况。
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（责任编辑：田喆）