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摘 要：西罗莫司（sirolimus）又称雷帕霉素（rapamycin），是一种大环内酯抗生素类免疫抑制剂。本实验研究表明，在受试的55株小单孢菌中，16株小单孢菌具有转化西罗莫司的能力，其中12株小单孢菌可能产生相类似的酶。本实验采用55株小单孢菌对西罗莫司的微生物转化进行研究。
关键词：西罗莫司；微生物；转化
西罗莫司（sirolimus）又称雷帕霉素（rapamycin），是一种大环内酯抗生素类免疫抑制剂[1-4]。1975年，加拿大Ayerst实验室的Vezina等人从太平洋Easler岛土壤样品中分离到能产生西罗莫司的吸水链霉菌（Streptomyees hygroscopicus），1989年开始把西罗莫司作为治疗器官移植排斥反应的新药进行试用[5-8]。1999年10月惠氏制药研制的西罗莫司口服溶液在美国首次上市，用于使用鸡尾酒疗法病人中撤除环孢素（ciclosporin）后预防肾移植排斥的维持使用。西罗莫司作为免疫抑制剂的机制在于它能阻断T 淋巴细胞活化的后期反应（增殖）抑制细胞从G1期进入S期，使Tc、Td细胞不能成为具有免疫应答作用的致敏性T淋巴细胞，发挥其免疫作用。微生物转化是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰。本实验采用55株小单孢菌对西罗莫司的微生物转化进行研究。
1 材料与方法
1.1 转化菌株
不同生态土壤分离的小单孢菌55株。
1.2 转化底物与实验试剂
西罗莫司（上海谱振生物科技有限公司）、14-去氧雷帕霉素（上海谱振生物科技有限公司）、无水乙醇（天津化学试剂有限公司）、乙酸乙酯（天津化学试剂有限公司）、丙酮（嘉兴市吉拉特化工有限公司）、乙腈（天津化学试剂有限公司）、氯化钠（天津化学试剂有限公司）、葡萄糖（武汉兴银河化工有限公司）、酵母膏（四川省申联生物科技有限责任公司）、牛肉膏（四川省申联生物科技有限责任公司）、多胨（武汉兴银河化工有限公司）、琼脂（武汉兴银河化工有限公司）、可溶性淀粉（四川省申联生物科技有限责任公司）、蛋白胨（武汉兴银河化工有限公司）、硫酸镁（四川广汉西城生化有限公司）、碳酸钙（天津化学试剂有限公司）、磷酸氢二钾（嘉兴市吉拉特化工有限公司）。
1.3 仪器
UV2800紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；IS126经济型pH计（上海仪迈仪器科技有限公司）；瑞士梅特勒-托利多MS精密天平（梅特勒-托利多中国公司）；UltiMate3000高效液相色谱仪（上海仪先仪器有限公司）；E2000制冷色谱柱温箱（上海子期实验设备有限公司）；SCQ-1020超声波清洗器 （上海声彦超声仪器有限公司）；PWC 124艾德姆分析天平（上海析友分析仪器有限公司）；MP-TA-10L超纯水器（成都优越科技有限公司）。
1.4 培养基
斜面培养基：葡萄糖百分之一、酵母膏百分之零点一、牛肉膏百分之零点一、多胨百分之零点二、琼脂百分之一点五，pH值7.5。种子培养基：可溶性淀粉百分之一点五、葡萄糖百分之零点五、蛋白胨百分之零点五、酵母提取物百分之零点五、氯化钠百分之零点零五、氯酸铵百分之零点零五、磷酸氢二钾百分之零点零五、硫酸镁百分之零点零五、碳酸钙百分之零点零一，pH值7.5。转化培养基：可溶性淀粉百分之四、葡萄糖百分之零点五、黄豆粉百分之三、酵母提取物百分之五、碳酸钙百分之零点一、磷酸氢二钾百分之零点零五、硫酸镁百分之零点零五，pH值7.5。
1.5 培养方法
1.5.1 斜面培养。小单孢菌接种于斜面培养基上，32℃培养一周，4℃保存。
1.5.2 生物转化培养。自小单孢菌琼脂斜面取一铂环的生长物接入种子培养基32℃，振荡培养三天，以10%的接种量接入转化培养基，32℃，振荡培养两天时添加西罗莫司乙醇溶液于发酵液中，继续振荡培养三天。
1.6 转化产物的分离纯化和结构鉴定
1.6.1 转化产物的提取。转化发酵液两倍体积的乙醇分别浸泡两次，过滤，合并滤液，减压浓缩去除乙醇，用相同体积的二氯甲烷萃取两次，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物溶于少量的二氯甲烷溶液中，通过硅胶柱层析，采用二氯甲烷和乙腈混合溶剂为洗脱剂，分部收集。
1.6.2 转化产物的波谱分析与结构鉴定。采用HPLC、UV、LC-MS和NMR分析小单孢菌转化西罗莫司转化液。
2 结果
2.1 小单孢菌转化西罗莫司的结果
来自不同生态土壤的55株小单孢菌对西罗莫司的生物转化研究结果表明：15株小单孢菌对西罗莫司具有转化作用。
2.2 棘孢小单孢菌FIM02-848对西罗莫司的微生物转化
2.2.1 HPLC分析[9-13]。棘孢小单孢菌FIM02-848H将西罗莫司转化产生7个转化产物。
2.2.2 uV分析。紫外扫描结果显示，它们与西罗莫司的紫外吸收行为一致。
3 讨论
西罗莫司是一种大环内酯类抗生素，为一种免疫抑制剂。近年来研究发现，它在抗移植排斥反应、作为药物涂层支架用于冠脉狭窄、抗肿瘤等方面均有作用，临床应用范围广。西罗莫司本身具有的强效免疫抑制作用限制了它在其它领域的应用，寻找低或无免疫抑制作用的西罗莫司新衍生物，我们应用了微生物转化进行西罗莫司的化学结构修饰，试图获得西罗莫司新的衍生物。本实验研究表明，在受试的55株小单孢菌中，16株小单孢菌具有转化西罗莫司的能力，其中12株小单孢菌转化西罗莫司的产物在HPLC图谱中的相对保留时间类似，说明这些小单孢菌可能产生类同的产物。
参考文献
[1]王宇皎.西罗莫司固体制剂在美国上市[J].国外医药（合成药生化药制剂分册），2002（3）.
[2]张在丽，郭燕萍，李中东，施孝金，钟明康.西罗莫司胶囊在人体内的生物等效性评价[J].中国药学杂志，2012（4）.
[3]余国膺.西罗莫司对循环中的血管祖细胞具有强大抑制作用[J].中国介入心脏病学杂志，2005（2）.
[4]吴亚铭，陈晓.新型免疫抑制剂——西罗莫司[J].天津药学，2003（2）.
[5]马林军，吴晖，诸敏，丁鼎乐.第三代免疫抑制剂——西罗莫司[J].上海医药，2002（6）.
[6]于兰，吴谧，王浩，李翠娟.西罗莫司应用的新进展[J].实用中西医结合临床，2014（3）.
[7]王倩，舒茂琴.西罗莫司对大鼠血管平滑肌细胞增殖、起始识别复合物1表达的影响及机制探讨[J].第二军医大学学报，2011（9）.
[8]胡平亚，方国英，史东明.西罗莫司的抗肿瘤应用及不良反应概述[J].中国药师，2014（1）.
[9]黎曙霞，任斌，王长希，洪晓丹.固相萃取-HPLC法测定西罗莫司的血药浓度及其临床应用研究[J].中国药房，2008（20）.
[10]仲伟潭，魏增辉，常亮，李卓.发酵液中西罗莫司含量的测定[J].河北化工，2009（3）.
[11]张东娣，范艳花.液-质联用在西罗莫司和依维莫司血药浓度监测中的应用进展[J].商丘师范学院学报，2007（12）.
[12]黄明珠，胡兴江，陈俊春，梁星光，刘健，吴国兰.西罗莫司全血浓度测定方法及临床应用[J].中国临床药理学杂志，2014（5）.
[13]陈宏林，尤庆生，孟小勇.HPLC法测定组织中雷帕霉素的含量[J].實用医药杂志，2008（7）.
关键词：西罗莫司；微生物；转化
西罗莫司（sirolimus）又称雷帕霉素（rapamycin），是一种大环内酯抗生素类免疫抑制剂[1-4]。1975年，加拿大Ayerst实验室的Vezina等人从太平洋Easler岛土壤样品中分离到能产生西罗莫司的吸水链霉菌（Streptomyees hygroscopicus），1989年开始把西罗莫司作为治疗器官移植排斥反应的新药进行试用[5-8]。1999年10月惠氏制药研制的西罗莫司口服溶液在美国首次上市，用于使用鸡尾酒疗法病人中撤除环孢素（ciclosporin）后预防肾移植排斥的维持使用。西罗莫司作为免疫抑制剂的机制在于它能阻断T 淋巴细胞活化的后期反应（增殖）抑制细胞从G1期进入S期，使Tc、Td细胞不能成为具有免疫应答作用的致敏性T淋巴细胞，发挥其免疫作用。微生物转化是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰。本实验采用55株小单孢菌对西罗莫司的微生物转化进行研究。
1 材料与方法
1.1 转化菌株
不同生态土壤分离的小单孢菌55株。
1.2 转化底物与实验试剂
西罗莫司（上海谱振生物科技有限公司）、14-去氧雷帕霉素（上海谱振生物科技有限公司）、无水乙醇（天津化学试剂有限公司）、乙酸乙酯（天津化学试剂有限公司）、丙酮（嘉兴市吉拉特化工有限公司）、乙腈（天津化学试剂有限公司）、氯化钠（天津化学试剂有限公司）、葡萄糖（武汉兴银河化工有限公司）、酵母膏（四川省申联生物科技有限责任公司）、牛肉膏（四川省申联生物科技有限责任公司）、多胨（武汉兴银河化工有限公司）、琼脂（武汉兴银河化工有限公司）、可溶性淀粉（四川省申联生物科技有限责任公司）、蛋白胨（武汉兴银河化工有限公司）、硫酸镁（四川广汉西城生化有限公司）、碳酸钙（天津化学试剂有限公司）、磷酸氢二钾（嘉兴市吉拉特化工有限公司）。
1.3 仪器
UV2800紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；IS126经济型pH计（上海仪迈仪器科技有限公司）；瑞士梅特勒-托利多MS精密天平（梅特勒-托利多中国公司）；UltiMate3000高效液相色谱仪（上海仪先仪器有限公司）；E2000制冷色谱柱温箱（上海子期实验设备有限公司）；SCQ-1020超声波清洗器 （上海声彦超声仪器有限公司）；PWC 124艾德姆分析天平（上海析友分析仪器有限公司）；MP-TA-10L超纯水器（成都优越科技有限公司）。
1.4 培养基
斜面培养基：葡萄糖百分之一、酵母膏百分之零点一、牛肉膏百分之零点一、多胨百分之零点二、琼脂百分之一点五，pH值7.5。种子培养基：可溶性淀粉百分之一点五、葡萄糖百分之零点五、蛋白胨百分之零点五、酵母提取物百分之零点五、氯化钠百分之零点零五、氯酸铵百分之零点零五、磷酸氢二钾百分之零点零五、硫酸镁百分之零点零五、碳酸钙百分之零点零一，pH值7.5。转化培养基：可溶性淀粉百分之四、葡萄糖百分之零点五、黄豆粉百分之三、酵母提取物百分之五、碳酸钙百分之零点一、磷酸氢二钾百分之零点零五、硫酸镁百分之零点零五，pH值7.5。
1.5 培养方法
1.5.1 斜面培养。小单孢菌接种于斜面培养基上，32℃培养一周，4℃保存。
1.5.2 生物转化培养。自小单孢菌琼脂斜面取一铂环的生长物接入种子培养基32℃，振荡培养三天，以10%的接种量接入转化培养基，32℃，振荡培养两天时添加西罗莫司乙醇溶液于发酵液中，继续振荡培养三天。
1.6 转化产物的分离纯化和结构鉴定
1.6.1 转化产物的提取。转化发酵液两倍体积的乙醇分别浸泡两次，过滤，合并滤液，减压浓缩去除乙醇，用相同体积的二氯甲烷萃取两次，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物溶于少量的二氯甲烷溶液中，通过硅胶柱层析，采用二氯甲烷和乙腈混合溶剂为洗脱剂，分部收集。
1.6.2 转化产物的波谱分析与结构鉴定。采用HPLC、UV、LC-MS和NMR分析小单孢菌转化西罗莫司转化液。
2 结果
2.1 小单孢菌转化西罗莫司的结果
来自不同生态土壤的55株小单孢菌对西罗莫司的生物转化研究结果表明：15株小单孢菌对西罗莫司具有转化作用。
2.2 棘孢小单孢菌FIM02-848对西罗莫司的微生物转化
2.2.1 HPLC分析[9-13]。棘孢小单孢菌FIM02-848H将西罗莫司转化产生7个转化产物。
2.2.2 uV分析。紫外扫描结果显示，它们与西罗莫司的紫外吸收行为一致。
3 讨论
西罗莫司是一种大环内酯类抗生素，为一种免疫抑制剂。近年来研究发现，它在抗移植排斥反应、作为药物涂层支架用于冠脉狭窄、抗肿瘤等方面均有作用，临床应用范围广。西罗莫司本身具有的强效免疫抑制作用限制了它在其它领域的应用，寻找低或无免疫抑制作用的西罗莫司新衍生物，我们应用了微生物转化进行西罗莫司的化学结构修饰，试图获得西罗莫司新的衍生物。本实验研究表明，在受试的55株小单孢菌中，16株小单孢菌具有转化西罗莫司的能力，其中12株小单孢菌转化西罗莫司的产物在HPLC图谱中的相对保留时间类似，说明这些小单孢菌可能产生类同的产物。
参考文献
[1]王宇皎.西罗莫司固体制剂在美国上市[J].国外医药（合成药生化药制剂分册），2002（3）.
[2]张在丽，郭燕萍，李中东，施孝金，钟明康.西罗莫司胶囊在人体内的生物等效性评价[J].中国药学杂志，2012（4）.
[3]余国膺.西罗莫司对循环中的血管祖细胞具有强大抑制作用[J].中国介入心脏病学杂志，2005（2）.
[4]吴亚铭，陈晓.新型免疫抑制剂——西罗莫司[J].天津药学，2003（2）.
[5]马林军，吴晖，诸敏，丁鼎乐.第三代免疫抑制剂——西罗莫司[J].上海医药，2002（6）.
[6]于兰，吴谧，王浩，李翠娟.西罗莫司应用的新进展[J].实用中西医结合临床，2014（3）.
[7]王倩，舒茂琴.西罗莫司对大鼠血管平滑肌细胞增殖、起始识别复合物1表达的影响及机制探讨[J].第二军医大学学报，2011（9）.
[8]胡平亚，方国英，史东明.西罗莫司的抗肿瘤应用及不良反应概述[J].中国药师，2014（1）.
[9]黎曙霞，任斌，王长希，洪晓丹.固相萃取-HPLC法测定西罗莫司的血药浓度及其临床应用研究[J].中国药房，2008（20）.
[10]仲伟潭，魏增辉，常亮，李卓.发酵液中西罗莫司含量的测定[J].河北化工，2009（3）.
[11]张东娣，范艳花.液-质联用在西罗莫司和依维莫司血药浓度监测中的应用进展[J].商丘师范学院学报，2007（12）.
[12]黄明珠，胡兴江，陈俊春，梁星光，刘健，吴国兰.西罗莫司全血浓度测定方法及临床应用[J].中国临床药理学杂志，2014（5）.
[13]陈宏林，尤庆生，孟小勇.HPLC法测定组织中雷帕霉素的含量[J].實用医药杂志，2008（7）.