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[摘要] 目的 通过对鲍曼不动杆菌的耐药基因和插入序列遗传标记进行研究来了解鲍曼不动杆菌的耐药机制，为临床治疗性用药、提供临床疗效提供实验依据。 方法 通过细菌药物敏感试验检测鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药情况，通过PCR方法检测鲍曼不动杆菌的携带β-内酰胺类药物耐药基因的状况以及插入序列遗传标记的情况。 结果 细菌药物敏感试验检测结果是鲍曼不动杆菌对多种抗菌药物均耐药，共检出TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24等耐药基因，插入序列遗传标记ISabal、IS26、tnp513检出率分别为80.43%和47.82%、52.17%。 结论 β-内酰胺酶基因广泛存在于鲍曼不动杆菌中，是鲍曼不动杆菌对目前临床常用的β-内酰胺类药物存在多重耐药的主要原因。多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药性与插入序列遗传标记有一定的相关性。
[关键词] 鲍曼不动杆菌；多重耐药；β-内酰胺类药物；插入序列
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）11-122-05
A study on drug resistance gene and genetic markers of insertion sequence of acinetobacter baumannii
CAO Xiaojun LI Xiaoyan
Clinical Laboratory,the Fourth Affiliated Hospital of GZMU,Guangzhou 511447,China
[Abstract] Objective To study the drug resistance gene and genetic markers of insertion sequence of acinetobacter baumannii,so as to understand the resistance mechanisms of acinetobacter baumannii and provide experimental evidence for clinical medication and clinical curative effect. Methods Drug sensitivity tests were carried out to test the drug resistance of acinetobacter baumannii towards anti-bacterial drugs. PCR was applied to test the drug resistance gene of β-lactam antibiotics carried by acinetobacter baumannii as well as test the genetic markers of insertion sequence. Results The results of drug sensitivity tests showed that acinetobacter baumannii is resistant to various kinds of anti-bacterial drugs.Drug resistance genes,such as TEM,OXA-2,ADC,CTX-M-1,CTX-M-2,IMP- OXA-24,were detected,and the detection rates of genetic marks of insertion sequence, including Isabal, IS26 and tnp513,were 80.43%,47.82% and 52.17% respectively. Conclusion β-lactamase gene is widely distributed in acinetobacter baumannii,which explains the main reason why acinetobacter baumannii has multi-drug resistance towards clinically commonly used β-lactam antibiotics.The drug resistance of acinetobacter baumannii has a certain correlation with the genetic markers of insertion sequence.
[Key words] Acinetobacter baumannii;Multi-drug resistance;β-lactam antibiotics;Insertion sequence
鲍曼不动杆菌（acinetobacter baumannii，A baumannii），常寄居于人体的皮肤、口腔黏膜、呼吸道、泌尿道及自然界的水和土壤中，是惟一能在人类皮肤表面生存的革兰阴性杆菌，是医院感染的一种重要病原菌。该菌生存能力强，对消毒剂敏感率低，对抗生素耐药率高，极易播散流行，主要引起获得性肺炎，尤其是呼吸机相关性肺炎、尿路感染、菌血症、创口感染、继发性脑膜炎等，严重危害患者健康，给临床治疗带来极大困难。越来越多的由鲍曼不动杆菌引起的感染被报道，特别是多重耐药菌株引起的感染被越来越多的专家所关注[1-3]。本课题以多重耐药鲍曼不动杆菌为研究对象，了解其对临床常用抗生素的耐药情况及其可能的耐药基因，并对插入序列遗传标记在细菌耐药中的作用进行分析。旨在通过对多耐药鲍曼不动杆菌耐药机制的探究，为临床用药治疗多耐药鲍曼不动杆菌起到一定的指导作用，同时也为开发新的抗菌药物和发现新菌种拓展思路。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
全部菌株来源于我院2013年1～12月临床住院患者的痰液、脑脊液、尿液及血液等不重复标本中分离的鲍曼不动杆菌，共46株，所有的细菌经VITEK-2自动鉴定系统（BioMerieux）确认。
1.2 实验仪器和试剂
1.2.1 实验仪器 包括VITEK2-compact全自动微生物鉴定仪鉴定（法国生物梅里埃公司）、PCR扩增仪（Appiled Biosystem））、水平凝胶电泳仪（Bio-Rad）、凝胶成像及分析系统（北京赛智公司）、全自动ABl3070DNA测序仪（美国ABI公司）、低温冰箱（Thermo）、超纯水分离系统（Pall）、低温台式高速离心5810R（Eppendorf公司）等。
1.2.2 实验试剂 包括（1）药敏纸片、M-H琼脂（英国OXOID公司）；（2）TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、琼脂糖（日本TaKaRa公司）；（3）引物合成（上海生工生物有限公司）；（4）DNA分子量Marker（Fements公司）等。
1.3 方法
1.3.1 菌株鉴定 标本的采集与细菌分离培养严格按《全国临床检验操作规程》[4]进行。采用法国生物梅里埃公司VITEK2-compact进行菌株鉴定。
1.3.2 药物敏感试验 采用K-B纸片扩散法测定鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性。参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2010年的标准判断结果。12种抗菌药物分别为头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、亚胺培南、美洛培南、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星和四环素。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.3.3 制备DNA 将经过全自动细菌鉴定药敏分析系统鉴定后的鲍曼不动杆菌转入血平板，经24h培养后，挑纯培养菌落置入0.5mL离心管内（内预置200ng/mL蛋白酶K溶液200μL），充分震荡混匀后进行2h水浴（56℃），然后放入95℃水浴进行10min，离心半径15000r/min进行30s离心，获得的上清液作为基因检测的DNA模板液，放入-20℃冰箱内进行保存备用。
1.3.4 随机引物PCR扩增选用随机引物ERICIR（5’-ATGTA-AGCTCCTGGGGATTCAC-3’）和ERIC2（5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’）进行PCR反应扩增，在PCR反应扩增完成后在1.5%的琼脂糖凝胶中放入PCR产物，150V电泳20min后用凝胶成像仪观察DNA条带的分布并分析基因型。
1.3.5 扩增引物 应用上海生工生物工程有限公司合成的基因扩增引物[5]，各种靶基因引物序列和目的产物长度见表１。
1.3.6 基因检测 均为PCR法检测。PCR扩增体系为：每反应体系Pl、P2引物各lμmol/L，dNTPs各2μL KCL 10mmol/L，（NH4）2SO4是8mmol/L，
表1 PCR引物序列
扩增基因
名称 引物序列（5’→3’） 产物长度
（bp）
TEM F TTCGTGTCGCCCTTATTC 535
R TTCGTGTCGCCCTTATTC
SHV F TGCGCAAGCTGCTGACCAGC 305
R TTAGCGYTGCCAGTGCTCGA
OXA-1 F CTGTTGTTTGGGTTTCGCAAG 440
R CTTGGCTTTTATGCTTGATG
OXA-2 F CAGGCGCYGTTCGYGATGAGTT 233
R GCCYTCTATCCAGTAATCGCC
OXA-10 F GTCTTTCRAGTACGGCATTA 822
R GATTTTCTTAGCGGCAACTTA
OXA-20 F TTGATAATCCGATTTCTAGCAC 801
R CTAGTTGGGTGGCAAAGCAT
PER F AGTCAGCGGCTTAGATA 978
R CGTATGAAAAGGACAATC
VEB F GCGGTAATTTAACCAGA 961
R GCCTATGAGCCAGTGTT
GES F ATGCGCTTCATTCACGCAC 846
R CTATTTGTCCGTGCTCAGG
CARB F AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC 588
R TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC
CTX-M-1 F ATGGTTAAAAAATCACTGCGYCAGTTC 876
R TCACAAACCGTYGGTGACGATTTTAGCCGC
CTX-M-2 F ATGATGACGCAGAGCATTCGCCGCTCA 876
R TCAGAAACCGTGGGTTACGATTTTCGC
CTX-M-9 F ATGATGAGACATCGCGTTAAGCGG 876
R TTAATAACCGTCGGTGACGATTTTCGCG
IMP F CGGCCKCAGGAGMGKCTTT 587
R AACCAGTTTTGCYTTACYAT
ADC F GGTATGGCYGTGGGBGTYATTC 739
R CTAAGASTTGGTCRAARGGT
DHA F AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT 405
R CCGTACGCATACTGGCTTTGC
OXA-24群 F CAAGAGCTTGCAAGACGGACT 420
R TCCAAGATTTTCTAGCRACTTATA
ISabal P1：AATGATTGGTGACAATGAAG 372
P2：ATGCAGCGCTTCTTTGCAGG
IS26 P1：ATGAACCCATTCAAAGGCCGGCAT 387
P2：CCGTCGTAACAGCAAAGCTGCATA
Tnp513 P1：ATGTCGCTGGCAAGGAACGC 240
P2：GGGTTCGCTGCGAGGATTGT
MgCL22mmol/L，Tris-HCL（pH9.0）10mmol/L，NP400.5%，BSA0.02%，Taq DNA pol 1U。总反应体积20μL（其中模板液5μL）。PCR扩增热循环参数为：93℃预变性2min，然后94℃60s、55℃45s、72℃60s，以上反应循环35个周期，最后一个周期时72℃延长2min。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳（110V）20min后在紫外凝胶电泳成像仪下观察，并记录结果。
1.3.7 耐药基因序列分析取PCR产物在美国应用生物系统公司提供的ABl3730型毛细管全自动测序仪上进行测序，由上海生工生物工程有限公司协助完成。
2 结果
2.1 药物敏感试验的结果
46株鲍曼不动杆菌中对12种抗生素耐药率为69.57%~100.00%，全部鲍曼不动杆菌对头孢噻肟、庆大霉素和环丙沙星耐药，对全部的抗生素均耐药的31株，对第三、四代头孢菌素的耐药率最低为89.13%，对美罗培南和亚胺培南的耐药率最低为69.57%。46株鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药性见表2。
表2 鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药性
抗菌药物 敏感株数 耐药株数 耐药率（％）
头孢噻肟 0 46 100.00
头孢他啶 4 42 91.30
头孢吡肟 5 41 89.13
头孢西丁 2 44 95.65
亚胺培南 14 32 69.57
美洛培南 12 34 73.91
氨苄西林/舒巴坦 9 37 80.43
阿莫西林/克拉维酸 10 36 78.26
阿米卡星 3 43 93.48
庆大霉素 0 46 100.00
环丙沙星 0 46 100.00
四环素 1 45 97.83
2.2 基因检测结果
46株鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶的基因PCR扩增结果显示，TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24、ADC均为阳性。TEM阳性45株，阳性率97.83%（45/46）；OXA-2阳性42株，阳性率91.30%（42/46）；ADC阳性46株，阳性率100%（46/46）；CTX-M-1阳性42株，阳性率91.30%（42/46）；CTX-M-2阳性44株，阳性率95.65%（44/46）；IMP阳性43株，阳性率93.48%（43/46）；OXA-24阳性44株，阳性率95.65%（44/46）；ADC阳性42株，阳性率91.30%（42/46）。对鲍曼不动杆菌PCR产物随机进行序列测试，并在国际互联网上对结果进行检索分析证明基因测序结果与Genbank的序列一致。
2.3 插入序列遗传标记检测结果
46株鲍曼不动杆菌的插入序列遗传标记检测结果为插入序列遗传标记ISabal、IS26、tnp513检出率分别为80.43%和47.82%、52.17%。PCR阳性产物测得序列经BLAST比对，与已在GenBank登录的序列均相同。见图1～3。
图1 ISabal基因部分测序图
图2 IS26基因部分测序图
图3 tnp513基因部分测序图
3 讨论
鲍曼不动杆菌是医院获得性感染的重要病原菌之一[6-8]。该菌生存能力强，对消毒剂敏感率低，对抗生素耐药率高，极易播散流行。目前，鲍曼不动杆菌的耐药情况已经十分严峻[9-12]。1991年美国报道了对碳青霉烯类药物耐药的鲍曼不动杆菌称之为全球性的标志性事件，之后在世界各地不断出现。鲍曼不动杆菌耐药株不断增多，对临床常用的抗菌药物出现多重耐药性，使临床的感染率和死亡率不断上升，给抗生素临床应用带来了极大的困难，给临床感染性疾病的治疗带来极大的困难[13]。因此，了解它的流行现状、致病性、药物敏感性及耐药机制，对于指导临床治疗显得非常重要。本组药物敏感结显示，46株鲍曼不动杆菌中对12种抗生素耐药率为69.57%~100%，全部鲍曼不动杆菌对头孢噻肟、庆大霉素和环丙沙星耐药，对全部的抗生素均耐药的31株，对第三、四代头孢菌素的耐药率最低为89.13%，对美罗培南和亚胺培南的耐药率最低为69.57%。结果提示：鲍曼不动杆菌对多种抗生素呈现多重重度耐药，对机体的危害形势比较严峻。临床治疗鲍曼不动杆菌所致的感染性疾病时应注意根据药物敏感试验结果选择敏感的抗生素以提高临床疗效，同时降低抗生素不当应用所导致的鲍曼不动杆菌的耐药性。
鲍曼不动杆菌耐药机制[4-16]极其复杂，其耐药的生化机制主要包括产生金属氨基糖甙类药物修饰酶、β-内酰胺酶、青霉素结合蛋白的改变和外排泵出机制、代谢途径的改变、外膜蛋白的丢失或膜孔蛋白的缺损等。这些细菌耐药生化机制的产生，主要是因为细菌的耐药相关基因改变。这种耐药发生的遗传基础大多是可移动遗传基因片段，如耐药质粒、插入序列、整合子和转座子等水平传播造成的。这些外源性的DNA片段常带有耐药基因，可以从一个细菌体转移至另一个菌体，可以是同菌属，也可以是异菌属之间相互传播，这种转移可使耐药菌不断增多并易于传递播散。本组基因检测结果显示，46株鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶的基因PCR扩增结果显示，TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24、ADC均为阳性，且阳性率均大于90%。结果提示：本组鲍曼不动杆菌呈现多重耐药可能与带有这些可移动遗传基因片段有关，可移动遗传基因片段的阳性存在使得鲍曼不动杆菌对多种抗生素呈现多重重度耐药，增加了临床对鲍曼不动杆菌所致的感染性疾病的治疗难度，降低了临床疗效，带给患者机体方面的伤害，甚至死亡。
从DNA的原位上单独复制或断裂形成的DNA顺序片段，环化改变后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，这就是转座过程。转座子（transposons，Tn）是指一类在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，能将自身基因插入基因组中任何一个在序列上与己无关的新位点的DNA序列。转座子存在于染色体DNA，是可自主复制和移位的基本基因单位，可导致细菌耐药性的多样化，并且易于传递散播。最简单的转座子不带有任何宿主基因而常被称为插入序列，它们是细菌染色体DNA或质粒DNA的正常组成部分。插入序列（IS）是作为最简单的转座元件，是细菌染色体和质粒的正常组成成分，为一种可编码转座所需酶的转座子。插入序列不仅移动基因，并可导致被插入基因失活[17-18]。如：ISabl插入至鲍曼不动杆菌碳青霉烯类药物特异性通道蛋白编码基因中时，可导致该通道蛋白编码基因失活而耐碳青霉烯类药物。转座子不仅有传播耐药基因的功能，而且有使细菌已有耐药基因高表达能力或破坏细菌本身结构基因而使细菌耐药。近年已有众多文献报道，处于ISabal、IS26、trip513下游的基因可出现高表达现象。近年国内对耐药菌的整合子研究报道较多，但对转座子、插入序列的研究报道鲜见。本组插入序列遗传标记检测结果显示，46株鲍曼不动杆菌的插入序列遗传标记ISabal的检出率为80.43%，IS26的检出率为47.82%，tnp513的检出率为52.17%。结果提示：插入序列的广泛存在，使得鲍曼不动杆菌的染色体DNA具有较强的自主复制和移位能力，可导致细菌耐药性的多样化，也可以通过破坏原有的正常基因而使鲍曼不动杆菌发生变异，以及通过提高细菌已有耐药基因的表达能力，进一步增加了鲍曼不动杆菌对抗生素的耐药性，从而导致鲍曼不动杆菌出现易于传递散播的多重耐药的特点。
β-内酰胺酶基因广泛存在于鲍曼不动杆菌中，是鲍曼不动杆菌对目前临床常用的β-内酰胺类药物存在多重耐药的主要原因。多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药性与插入序列遗传标记有一定的相关性。为减少多重耐药鲍曼不动杆菌株的数量，临床上应根据药敏结果有针对性地选择抗菌药物，同时应加强抗菌药物的监管，保护抗生素资源，做到合理用药，减少盲目用药，同时为了防止耐药菌株的传播应加强消毒隔离管理制度，以达到提高治疗疾病的水平的目的。
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（收稿日期：2014-03-18）
[关键词] 鲍曼不动杆菌；多重耐药；β-内酰胺类药物；插入序列
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）11-122-05
A study on drug resistance gene and genetic markers of insertion sequence of acinetobacter baumannii
CAO Xiaojun LI Xiaoyan
Clinical Laboratory,the Fourth Affiliated Hospital of GZMU,Guangzhou 511447,China
[Abstract] Objective To study the drug resistance gene and genetic markers of insertion sequence of acinetobacter baumannii,so as to understand the resistance mechanisms of acinetobacter baumannii and provide experimental evidence for clinical medication and clinical curative effect. Methods Drug sensitivity tests were carried out to test the drug resistance of acinetobacter baumannii towards anti-bacterial drugs. PCR was applied to test the drug resistance gene of β-lactam antibiotics carried by acinetobacter baumannii as well as test the genetic markers of insertion sequence. Results The results of drug sensitivity tests showed that acinetobacter baumannii is resistant to various kinds of anti-bacterial drugs.Drug resistance genes,such as TEM,OXA-2,ADC,CTX-M-1,CTX-M-2,IMP- OXA-24,were detected,and the detection rates of genetic marks of insertion sequence, including Isabal, IS26 and tnp513,were 80.43%,47.82% and 52.17% respectively. Conclusion β-lactamase gene is widely distributed in acinetobacter baumannii,which explains the main reason why acinetobacter baumannii has multi-drug resistance towards clinically commonly used β-lactam antibiotics.The drug resistance of acinetobacter baumannii has a certain correlation with the genetic markers of insertion sequence.
[Key words] Acinetobacter baumannii;Multi-drug resistance;β-lactam antibiotics;Insertion sequence
鲍曼不动杆菌（acinetobacter baumannii，A baumannii），常寄居于人体的皮肤、口腔黏膜、呼吸道、泌尿道及自然界的水和土壤中，是惟一能在人类皮肤表面生存的革兰阴性杆菌，是医院感染的一种重要病原菌。该菌生存能力强，对消毒剂敏感率低，对抗生素耐药率高，极易播散流行，主要引起获得性肺炎，尤其是呼吸机相关性肺炎、尿路感染、菌血症、创口感染、继发性脑膜炎等，严重危害患者健康，给临床治疗带来极大困难。越来越多的由鲍曼不动杆菌引起的感染被报道，特别是多重耐药菌株引起的感染被越来越多的专家所关注[1-3]。本课题以多重耐药鲍曼不动杆菌为研究对象，了解其对临床常用抗生素的耐药情况及其可能的耐药基因，并对插入序列遗传标记在细菌耐药中的作用进行分析。旨在通过对多耐药鲍曼不动杆菌耐药机制的探究，为临床用药治疗多耐药鲍曼不动杆菌起到一定的指导作用，同时也为开发新的抗菌药物和发现新菌种拓展思路。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
全部菌株来源于我院2013年1～12月临床住院患者的痰液、脑脊液、尿液及血液等不重复标本中分离的鲍曼不动杆菌，共46株，所有的细菌经VITEK-2自动鉴定系统（BioMerieux）确认。
1.2 实验仪器和试剂
1.2.1 实验仪器 包括VITEK2-compact全自动微生物鉴定仪鉴定（法国生物梅里埃公司）、PCR扩增仪（Appiled Biosystem））、水平凝胶电泳仪（Bio-Rad）、凝胶成像及分析系统（北京赛智公司）、全自动ABl3070DNA测序仪（美国ABI公司）、低温冰箱（Thermo）、超纯水分离系统（Pall）、低温台式高速离心5810R（Eppendorf公司）等。
1.2.2 实验试剂 包括（1）药敏纸片、M-H琼脂（英国OXOID公司）；（2）TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、琼脂糖（日本TaKaRa公司）；（3）引物合成（上海生工生物有限公司）；（4）DNA分子量Marker（Fements公司）等。
1.3 方法
1.3.1 菌株鉴定 标本的采集与细菌分离培养严格按《全国临床检验操作规程》[4]进行。采用法国生物梅里埃公司VITEK2-compact进行菌株鉴定。
1.3.2 药物敏感试验 采用K-B纸片扩散法测定鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性。参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2010年的标准判断结果。12种抗菌药物分别为头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、亚胺培南、美洛培南、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星和四环素。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.3.3 制备DNA 将经过全自动细菌鉴定药敏分析系统鉴定后的鲍曼不动杆菌转入血平板，经24h培养后，挑纯培养菌落置入0.5mL离心管内（内预置200ng/mL蛋白酶K溶液200μL），充分震荡混匀后进行2h水浴（56℃），然后放入95℃水浴进行10min，离心半径15000r/min进行30s离心，获得的上清液作为基因检测的DNA模板液，放入-20℃冰箱内进行保存备用。
1.3.4 随机引物PCR扩增选用随机引物ERICIR（5’-ATGTA-AGCTCCTGGGGATTCAC-3’）和ERIC2（5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’）进行PCR反应扩增，在PCR反应扩增完成后在1.5%的琼脂糖凝胶中放入PCR产物，150V电泳20min后用凝胶成像仪观察DNA条带的分布并分析基因型。
1.3.5 扩增引物 应用上海生工生物工程有限公司合成的基因扩增引物[5]，各种靶基因引物序列和目的产物长度见表１。
1.3.6 基因检测 均为PCR法检测。PCR扩增体系为：每反应体系Pl、P2引物各lμmol/L，dNTPs各2μL KCL 10mmol/L，（NH4）2SO4是8mmol/L，
表1 PCR引物序列
扩增基因
名称 引物序列（5’→3’） 产物长度
（bp）
TEM F TTCGTGTCGCCCTTATTC 535
R TTCGTGTCGCCCTTATTC
SHV F TGCGCAAGCTGCTGACCAGC 305
R TTAGCGYTGCCAGTGCTCGA
OXA-1 F CTGTTGTTTGGGTTTCGCAAG 440
R CTTGGCTTTTATGCTTGATG
OXA-2 F CAGGCGCYGTTCGYGATGAGTT 233
R GCCYTCTATCCAGTAATCGCC
OXA-10 F GTCTTTCRAGTACGGCATTA 822
R GATTTTCTTAGCGGCAACTTA
OXA-20 F TTGATAATCCGATTTCTAGCAC 801
R CTAGTTGGGTGGCAAAGCAT
PER F AGTCAGCGGCTTAGATA 978
R CGTATGAAAAGGACAATC
VEB F GCGGTAATTTAACCAGA 961
R GCCTATGAGCCAGTGTT
GES F ATGCGCTTCATTCACGCAC 846
R CTATTTGTCCGTGCTCAGG
CARB F AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC 588
R TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC
CTX-M-1 F ATGGTTAAAAAATCACTGCGYCAGTTC 876
R TCACAAACCGTYGGTGACGATTTTAGCCGC
CTX-M-2 F ATGATGACGCAGAGCATTCGCCGCTCA 876
R TCAGAAACCGTGGGTTACGATTTTCGC
CTX-M-9 F ATGATGAGACATCGCGTTAAGCGG 876
R TTAATAACCGTCGGTGACGATTTTCGCG
IMP F CGGCCKCAGGAGMGKCTTT 587
R AACCAGTTTTGCYTTACYAT
ADC F GGTATGGCYGTGGGBGTYATTC 739
R CTAAGASTTGGTCRAARGGT
DHA F AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT 405
R CCGTACGCATACTGGCTTTGC
OXA-24群 F CAAGAGCTTGCAAGACGGACT 420
R TCCAAGATTTTCTAGCRACTTATA
ISabal P1：AATGATTGGTGACAATGAAG 372
P2：ATGCAGCGCTTCTTTGCAGG
IS26 P1：ATGAACCCATTCAAAGGCCGGCAT 387
P2：CCGTCGTAACAGCAAAGCTGCATA
Tnp513 P1：ATGTCGCTGGCAAGGAACGC 240
P2：GGGTTCGCTGCGAGGATTGT
MgCL22mmol/L，Tris-HCL（pH9.0）10mmol/L，NP400.5%，BSA0.02%，Taq DNA pol 1U。总反应体积20μL（其中模板液5μL）。PCR扩增热循环参数为：93℃预变性2min，然后94℃60s、55℃45s、72℃60s，以上反应循环35个周期，最后一个周期时72℃延长2min。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳（110V）20min后在紫外凝胶电泳成像仪下观察，并记录结果。
1.3.7 耐药基因序列分析取PCR产物在美国应用生物系统公司提供的ABl3730型毛细管全自动测序仪上进行测序，由上海生工生物工程有限公司协助完成。
2 结果
2.1 药物敏感试验的结果
46株鲍曼不动杆菌中对12种抗生素耐药率为69.57%~100.00%，全部鲍曼不动杆菌对头孢噻肟、庆大霉素和环丙沙星耐药，对全部的抗生素均耐药的31株，对第三、四代头孢菌素的耐药率最低为89.13%，对美罗培南和亚胺培南的耐药率最低为69.57%。46株鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药性见表2。
表2 鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药性
抗菌药物 敏感株数 耐药株数 耐药率（％）
头孢噻肟 0 46 100.00
头孢他啶 4 42 91.30
头孢吡肟 5 41 89.13
头孢西丁 2 44 95.65
亚胺培南 14 32 69.57
美洛培南 12 34 73.91
氨苄西林/舒巴坦 9 37 80.43
阿莫西林/克拉维酸 10 36 78.26
阿米卡星 3 43 93.48
庆大霉素 0 46 100.00
环丙沙星 0 46 100.00
四环素 1 45 97.83
2.2 基因检测结果
46株鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶的基因PCR扩增结果显示，TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24、ADC均为阳性。TEM阳性45株，阳性率97.83%（45/46）；OXA-2阳性42株，阳性率91.30%（42/46）；ADC阳性46株，阳性率100%（46/46）；CTX-M-1阳性42株，阳性率91.30%（42/46）；CTX-M-2阳性44株，阳性率95.65%（44/46）；IMP阳性43株，阳性率93.48%（43/46）；OXA-24阳性44株，阳性率95.65%（44/46）；ADC阳性42株，阳性率91.30%（42/46）。对鲍曼不动杆菌PCR产物随机进行序列测试，并在国际互联网上对结果进行检索分析证明基因测序结果与Genbank的序列一致。
2.3 插入序列遗传标记检测结果
46株鲍曼不动杆菌的插入序列遗传标记检测结果为插入序列遗传标记ISabal、IS26、tnp513检出率分别为80.43%和47.82%、52.17%。PCR阳性产物测得序列经BLAST比对，与已在GenBank登录的序列均相同。见图1～3。
图1 ISabal基因部分测序图
图2 IS26基因部分测序图
图3 tnp513基因部分测序图
3 讨论
鲍曼不动杆菌是医院获得性感染的重要病原菌之一[6-8]。该菌生存能力强，对消毒剂敏感率低，对抗生素耐药率高，极易播散流行。目前，鲍曼不动杆菌的耐药情况已经十分严峻[9-12]。1991年美国报道了对碳青霉烯类药物耐药的鲍曼不动杆菌称之为全球性的标志性事件，之后在世界各地不断出现。鲍曼不动杆菌耐药株不断增多，对临床常用的抗菌药物出现多重耐药性，使临床的感染率和死亡率不断上升，给抗生素临床应用带来了极大的困难，给临床感染性疾病的治疗带来极大的困难[13]。因此，了解它的流行现状、致病性、药物敏感性及耐药机制，对于指导临床治疗显得非常重要。本组药物敏感结显示，46株鲍曼不动杆菌中对12种抗生素耐药率为69.57%~100%，全部鲍曼不动杆菌对头孢噻肟、庆大霉素和环丙沙星耐药，对全部的抗生素均耐药的31株，对第三、四代头孢菌素的耐药率最低为89.13%，对美罗培南和亚胺培南的耐药率最低为69.57%。结果提示：鲍曼不动杆菌对多种抗生素呈现多重重度耐药，对机体的危害形势比较严峻。临床治疗鲍曼不动杆菌所致的感染性疾病时应注意根据药物敏感试验结果选择敏感的抗生素以提高临床疗效，同时降低抗生素不当应用所导致的鲍曼不动杆菌的耐药性。
鲍曼不动杆菌耐药机制[4-16]极其复杂，其耐药的生化机制主要包括产生金属氨基糖甙类药物修饰酶、β-内酰胺酶、青霉素结合蛋白的改变和外排泵出机制、代谢途径的改变、外膜蛋白的丢失或膜孔蛋白的缺损等。这些细菌耐药生化机制的产生，主要是因为细菌的耐药相关基因改变。这种耐药发生的遗传基础大多是可移动遗传基因片段，如耐药质粒、插入序列、整合子和转座子等水平传播造成的。这些外源性的DNA片段常带有耐药基因，可以从一个细菌体转移至另一个菌体，可以是同菌属，也可以是异菌属之间相互传播，这种转移可使耐药菌不断增多并易于传递播散。本组基因检测结果显示，46株鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶的基因PCR扩增结果显示，TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24、ADC均为阳性，且阳性率均大于90%。结果提示：本组鲍曼不动杆菌呈现多重耐药可能与带有这些可移动遗传基因片段有关，可移动遗传基因片段的阳性存在使得鲍曼不动杆菌对多种抗生素呈现多重重度耐药，增加了临床对鲍曼不动杆菌所致的感染性疾病的治疗难度，降低了临床疗效，带给患者机体方面的伤害，甚至死亡。
从DNA的原位上单独复制或断裂形成的DNA顺序片段，环化改变后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，这就是转座过程。转座子（transposons，Tn）是指一类在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，能将自身基因插入基因组中任何一个在序列上与己无关的新位点的DNA序列。转座子存在于染色体DNA，是可自主复制和移位的基本基因单位，可导致细菌耐药性的多样化，并且易于传递散播。最简单的转座子不带有任何宿主基因而常被称为插入序列，它们是细菌染色体DNA或质粒DNA的正常组成部分。插入序列（IS）是作为最简单的转座元件，是细菌染色体和质粒的正常组成成分，为一种可编码转座所需酶的转座子。插入序列不仅移动基因，并可导致被插入基因失活[17-18]。如：ISabl插入至鲍曼不动杆菌碳青霉烯类药物特异性通道蛋白编码基因中时，可导致该通道蛋白编码基因失活而耐碳青霉烯类药物。转座子不仅有传播耐药基因的功能，而且有使细菌已有耐药基因高表达能力或破坏细菌本身结构基因而使细菌耐药。近年已有众多文献报道，处于ISabal、IS26、trip513下游的基因可出现高表达现象。近年国内对耐药菌的整合子研究报道较多，但对转座子、插入序列的研究报道鲜见。本组插入序列遗传标记检测结果显示，46株鲍曼不动杆菌的插入序列遗传标记ISabal的检出率为80.43%，IS26的检出率为47.82%，tnp513的检出率为52.17%。结果提示：插入序列的广泛存在，使得鲍曼不动杆菌的染色体DNA具有较强的自主复制和移位能力，可导致细菌耐药性的多样化，也可以通过破坏原有的正常基因而使鲍曼不动杆菌发生变异，以及通过提高细菌已有耐药基因的表达能力，进一步增加了鲍曼不动杆菌对抗生素的耐药性，从而导致鲍曼不动杆菌出现易于传递散播的多重耐药的特点。
β-内酰胺酶基因广泛存在于鲍曼不动杆菌中，是鲍曼不动杆菌对目前临床常用的β-内酰胺类药物存在多重耐药的主要原因。多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药性与插入序列遗传标记有一定的相关性。为减少多重耐药鲍曼不动杆菌株的数量，临床上应根据药敏结果有针对性地选择抗菌药物，同时应加强抗菌药物的监管，保护抗生素资源，做到合理用药，减少盲目用药，同时为了防止耐药菌株的传播应加强消毒隔离管理制度，以达到提高治疗疾病的水平的目的。
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（收稿日期：2014-03-18）