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摘要[目的] 建立高效液相色谱法测定番茄酱中八氢番茄红素的含量。[方法] 色谱条件为：色谱柱为Agilent AT C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇THF（75∶25）；检测波长为287 nm；流速为1.0 ml/min；温度为30 ℃；进样量为50 μl。[结果] 八氢番茄红素在0.186～1.116 μg 范围内线性关系良好（R=0.999 9），平均回收率为103.8%，RSD为1.47%；测得市售某品牌番茄酱中的八氢番茄红素含量为107.0 mg/kg。[结论] 该方法简单、准确、快速、可靠，可用于番茄酱中八氢番茄红素的含量测定。
关键词番茄；八氢番茄红素；高效液相色谱；含量测定
中图分类号R284.1；S641.2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04436-02
Determination of Phytoene in Tomato Ketchup by HLPC
WU Zengbao et al （Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832000）
Abstract [Objective] The aim was to establish a HPLC method for determination of phytoene in tomato ketchup. [Method] The Agilent AT C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm） was used， and mobile phase was MethanolTHF （75∶25）. Detection wavelength was at 287 nm， the flow rate was 1.0 ml/min， and the column temperature was at 30 ℃， the sample size was 50 μl. [Result] The linear response range from 0.186-1.116 μg，R=0.999 9. The average recovery rate was 103.8%， with RSD 1.47%， and the average content was 107.0 mg/kg. [Conclusion] The method is simple， accurate， rapid and convenient. It can be used for the determination of phytoene in tomato ketchup.
Key words Tomato； Phytoene； HPLC； Content determination
加工番茄是重要的保健和功能性蔬菜食品，又具有潛在的药用价值。现有研究表明，加工番茄中主要的保健功能性成分为类胡萝卜素。类胡萝卜素可以预防前列腺癌、乳腺癌及消化道器官包括结肠、直肠、胃的癌变，并可降低皮肤癌与膀胱癌的发病率，同时可以预防和治疗心脑血管、动脉硬化等疾病，增强机体免疫功能和抗衰老等重要作用[1-3]。番茄中主要的类胡萝卜素为番茄红素和八氢番茄红素，早在1982年就有报道八氢番茄红素的抗癌作用[4]。八氢番茄红素对皮肤癌具有预防作用[5]，能抑制乳腺癌细胞的分化和癌症的发生[6]，控制癌症的发展[7]，能有效清除体内的自由基，抑制LDL的氧化[8]，阻止紫外线对皮肤的损伤和抑制皮肤癌的发生，以及保护DNA免受损伤等作用[9]。
但是目前对八氢番茄红素的研究远远没有番茄红素研究的深入，关于采用HPLC法测定八氢番茄红素含量的研究更是鲜有报道。笔者以HPLC法测定番茄主要产品番茄酱中八氢番茄红素的含量，以期为番茄的开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。市售某品牌番茄酱，购自新疆石河子市。
1.1.2主要仪器。Shimazu高效液相色谱仪，配有Shimazu LC20AT四元泵，CMB20 A控制器，SPD20 A紫外检测器，SIL20A自动进样器，CTO10As柱温箱，LC Solution工作站。
1.1.3主要试剂。八氢番茄红素对照品为石河子大学药学院实验室通过液相制备纯化（面积归一法纯度>99%），通过1H NMR和质谱、UV光谱确定为八氢番茄红素；甲醇、四氢呋喃（THF）为色谱纯，购自Sigma公司；水为重蒸馏水；其他试剂为分析纯，购自天津富宇有机精细化工有限公司。
1.2方法
1.2.1色谱条件。色谱柱为Agilent AT C18 （250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相为甲醇THF（75∶25），流速为1 ml/min，温度为30 ℃，检测波长287 nm，该波长为八氢番茄红素的最大吸收波长，进样量为50 μl，理论板数按八氢番茄红素峰计算不低于3 000。
1.2.2溶液的制备。
1.2.2.1对照品溶液的制备。精密称取真空干燥后的八氢番茄红素对照品0.93 mg溶解于丙酮中，定容至10 ml，此时标准液的浓度为93 μg/ml。经微孔滤膜滤过，滤液作为对照品溶液备用。
1.2.2.2供试品溶液的制备。精密称取番茄酱约1 g，精密称重1.005 74 g，置50 ml容量瓶中，加入丙酮适量，超声提取15 min，将上清液吸入另一个50 ml容量瓶，多次，至最后上清液及番茄酱均接近无色，用丙酮定容至50 ml，摇匀，微孔滤膜过滤即得。
1.2.3系统适应性试验。取制备的对照品和供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件进行测定，考察系统的适应性。 1.2.4方法学考察。
1.2.4.1线性关系的考察。分别精密量取2、4、6、8、10、12 μl对照品溶液，注入高效液相色谱仪中，测定，以对照品量浓度（X，μg）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，建立标准曲线。
1.2.4.2精密度试验。取“1.2.2.2”中供试样品溶液，连续进样6次，每次50 μl，记录峰面积，并计算RSD。
1.2.4.3稳定性试验。取同一批样品提取的提取液，分别于0、2、4、8、12、18、24 h进行测定，计算RSD。
1.2.4.4重现性试验。取同批次样品6份，按照“1.2.2.2”方法制备供试品溶液，按样品分析方法测定峰面积，计算RSD。
1.2.4.5加样回收率试验。分别取该品6份，精密称定每份0.5 g，置于6个50 ml的容量瓶中，加入含八氢番茄红素510 μg的八氢番茄红素对照液，按“1.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下的色谱条件测定，进样量为50 μl，计算平均回收率和RSD。
1.2.5样品的含量测定。精密吸取按“1.2.2.2”方法制备的供试品溶液，进样50 μl（3次平行），按“1.2.1”项下的色谱条件进行测定。
2结果与分析
2.1系统性试验试验得出，对照品保留时间为11.8 min，样品中的八氢番茄红素与其他各峰之间分离良好（图1）。图1八氢番茄红素对照品与番茄酱样品HPLC色谱2.2方法学考察
2.2.1线性关系考察。试验计算得回归方程为Y=352 934x-1 626.7（R=1.000 0），结果表明八氢番茄红素在0.186～1.116 μg范围内线性关系良好。
2.2.2精密度试验。试验测定并记录峰面积，计算得RSD为0.66% （n=6），表明仪器精密度良好。
2.2.3穩定性试验。试验计算RSD为0.78%（n=6），结果表明该样品在24 h内稳定性良好。
2.2.4重现性试验。试验计算得RSD为2.56%，表明重现性良好。
2.2.5加样回收率试验。试验计算得到平均回收率为103.8%，RSD为1.47%（表1）；加样回收率试验合格。
2.3样品的含量测定取“1.2.2.2”中番茄酱提取液50 μl（ 经0.22 μm滤膜过滤） ，平行进样3次，按外标法计算样品中八氢番茄红素的含量，用以上方法测得市售某品牌番茄酱中八氢番茄红素的含量为107.0 mg/kg。
3结论与讨论
目前关于番茄中八氢番茄红素的含量测定鲜有报道，试验为进一步研究番茄中八氢番茄红素的含量测定提供了依据。因为八氢番茄红素为脂溶性色素，可溶于其他脂类和非极性溶剂，不溶于水，曾选用正己烷、正戊烷和丙酮作为浸提剂，结果发现正己烷和正戊烷对八氢番茄红素几乎没有提取，而丙酮作为浸提剂溶解色素的能力较强，易于回收，所以最后选用丙酮作为提取剂。
用高效液谱法测定番茄样品时，流动相曾选甲醇∶乙腈（3∶7），所得色谱峰严重拖后，在60 min内，番茄红素及八氢番茄红素均不出峰。选用甲醇∶乙腈（1∶9），能观察到番茄红素及八氢番茄红素色谱峰，但保留时间过长，不符合含量测定快速的要求；选四氢呋喃∶乙腈（1∶3），八氢番茄红素出峰时间为11.8 min，且达到基线分离。所以最后选定25%四氢呋喃∶75%乙腈作为流动相。
参考文献
[1] 宋飞翔.果蔬中的抗癌明星——西红柿[J].药物与人，2005（2）：37.
[2] 方留民.番茄可防前列腺癌[J].食品与生活，2002（5）：23.
[3] 徐晋，徐贵发.番茄红素对心血管疾病的预防作用[J].卫生研究，2008，37（3）：381-382.
[4] MATHEWSROTH M M.Antitumor activity of βCarotene，canthaxanthin and phytoene[J].Oncology，1982，39（1）：33-37.
[5] SHAAISH A，HARARI A，KAMARI Y，et al.A carotenoid algal preparation containing phytoene and phytofluene inhibited LDL oxidation in vitro[J].Plant Foods and Human Nutrition，2008，63（2）：83-86.
[6] NISHINO H，MURAKOSH M，LI H，et al.Carotenoids in cancer chemoprevention[J].Cancer and Metastasis Reviews，2002，21（3/4）：257-264.
[7] NISHINO H，SATOMI Y，TOKUDA H，et al.Cancer control by phytochemicals[J].Current Pharmaceutical Design，2007，13（33）：3394-3399.
[8] OM PRAKASH，GYANENDRA NATH SINGH，RAMAN MOHAN SINGH.Interactions of herbal extract combinations against free radical scavenging activity[J].Pharmaceutical Biology，2009，47（8）：729-733.
[9] FU FENG KUO.Multicarotenoids compositions and methods：United States ，20090312287[P].2009-12-17.
关键词番茄；八氢番茄红素；高效液相色谱；含量测定
中图分类号R284.1；S641.2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04436-02
Determination of Phytoene in Tomato Ketchup by HLPC
WU Zengbao et al （Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832000）
Abstract [Objective] The aim was to establish a HPLC method for determination of phytoene in tomato ketchup. [Method] The Agilent AT C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm） was used， and mobile phase was MethanolTHF （75∶25）. Detection wavelength was at 287 nm， the flow rate was 1.0 ml/min， and the column temperature was at 30 ℃， the sample size was 50 μl. [Result] The linear response range from 0.186-1.116 μg，R=0.999 9. The average recovery rate was 103.8%， with RSD 1.47%， and the average content was 107.0 mg/kg. [Conclusion] The method is simple， accurate， rapid and convenient. It can be used for the determination of phytoene in tomato ketchup.
Key words Tomato； Phytoene； HPLC； Content determination
加工番茄是重要的保健和功能性蔬菜食品，又具有潛在的药用价值。现有研究表明，加工番茄中主要的保健功能性成分为类胡萝卜素。类胡萝卜素可以预防前列腺癌、乳腺癌及消化道器官包括结肠、直肠、胃的癌变，并可降低皮肤癌与膀胱癌的发病率，同时可以预防和治疗心脑血管、动脉硬化等疾病，增强机体免疫功能和抗衰老等重要作用[1-3]。番茄中主要的类胡萝卜素为番茄红素和八氢番茄红素，早在1982年就有报道八氢番茄红素的抗癌作用[4]。八氢番茄红素对皮肤癌具有预防作用[5]，能抑制乳腺癌细胞的分化和癌症的发生[6]，控制癌症的发展[7]，能有效清除体内的自由基，抑制LDL的氧化[8]，阻止紫外线对皮肤的损伤和抑制皮肤癌的发生，以及保护DNA免受损伤等作用[9]。
但是目前对八氢番茄红素的研究远远没有番茄红素研究的深入，关于采用HPLC法测定八氢番茄红素含量的研究更是鲜有报道。笔者以HPLC法测定番茄主要产品番茄酱中八氢番茄红素的含量，以期为番茄的开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。市售某品牌番茄酱，购自新疆石河子市。
1.1.2主要仪器。Shimazu高效液相色谱仪，配有Shimazu LC20AT四元泵，CMB20 A控制器，SPD20 A紫外检测器，SIL20A自动进样器，CTO10As柱温箱，LC Solution工作站。
1.1.3主要试剂。八氢番茄红素对照品为石河子大学药学院实验室通过液相制备纯化（面积归一法纯度>99%），通过1H NMR和质谱、UV光谱确定为八氢番茄红素；甲醇、四氢呋喃（THF）为色谱纯，购自Sigma公司；水为重蒸馏水；其他试剂为分析纯，购自天津富宇有机精细化工有限公司。
1.2方法
1.2.1色谱条件。色谱柱为Agilent AT C18 （250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相为甲醇THF（75∶25），流速为1 ml/min，温度为30 ℃，检测波长287 nm，该波长为八氢番茄红素的最大吸收波长，进样量为50 μl，理论板数按八氢番茄红素峰计算不低于3 000。
1.2.2溶液的制备。
1.2.2.1对照品溶液的制备。精密称取真空干燥后的八氢番茄红素对照品0.93 mg溶解于丙酮中，定容至10 ml，此时标准液的浓度为93 μg/ml。经微孔滤膜滤过，滤液作为对照品溶液备用。
1.2.2.2供试品溶液的制备。精密称取番茄酱约1 g，精密称重1.005 74 g，置50 ml容量瓶中，加入丙酮适量，超声提取15 min，将上清液吸入另一个50 ml容量瓶，多次，至最后上清液及番茄酱均接近无色，用丙酮定容至50 ml，摇匀，微孔滤膜过滤即得。
1.2.3系统适应性试验。取制备的对照品和供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件进行测定，考察系统的适应性。 1.2.4方法学考察。
1.2.4.1线性关系的考察。分别精密量取2、4、6、8、10、12 μl对照品溶液，注入高效液相色谱仪中，测定，以对照品量浓度（X，μg）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，建立标准曲线。
1.2.4.2精密度试验。取“1.2.2.2”中供试样品溶液，连续进样6次，每次50 μl，记录峰面积，并计算RSD。
1.2.4.3稳定性试验。取同一批样品提取的提取液，分别于0、2、4、8、12、18、24 h进行测定，计算RSD。
1.2.4.4重现性试验。取同批次样品6份，按照“1.2.2.2”方法制备供试品溶液，按样品分析方法测定峰面积，计算RSD。
1.2.4.5加样回收率试验。分别取该品6份，精密称定每份0.5 g，置于6个50 ml的容量瓶中，加入含八氢番茄红素510 μg的八氢番茄红素对照液，按“1.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下的色谱条件测定，进样量为50 μl，计算平均回收率和RSD。
1.2.5样品的含量测定。精密吸取按“1.2.2.2”方法制备的供试品溶液，进样50 μl（3次平行），按“1.2.1”项下的色谱条件进行测定。
2结果与分析
2.1系统性试验试验得出，对照品保留时间为11.8 min，样品中的八氢番茄红素与其他各峰之间分离良好（图1）。图1八氢番茄红素对照品与番茄酱样品HPLC色谱2.2方法学考察
2.2.1线性关系考察。试验计算得回归方程为Y=352 934x-1 626.7（R=1.000 0），结果表明八氢番茄红素在0.186～1.116 μg范围内线性关系良好。
2.2.2精密度试验。试验测定并记录峰面积，计算得RSD为0.66% （n=6），表明仪器精密度良好。
2.2.3穩定性试验。试验计算RSD为0.78%（n=6），结果表明该样品在24 h内稳定性良好。
2.2.4重现性试验。试验计算得RSD为2.56%，表明重现性良好。
2.2.5加样回收率试验。试验计算得到平均回收率为103.8%，RSD为1.47%（表1）；加样回收率试验合格。
2.3样品的含量测定取“1.2.2.2”中番茄酱提取液50 μl（ 经0.22 μm滤膜过滤） ，平行进样3次，按外标法计算样品中八氢番茄红素的含量，用以上方法测得市售某品牌番茄酱中八氢番茄红素的含量为107.0 mg/kg。
3结论与讨论
目前关于番茄中八氢番茄红素的含量测定鲜有报道，试验为进一步研究番茄中八氢番茄红素的含量测定提供了依据。因为八氢番茄红素为脂溶性色素，可溶于其他脂类和非极性溶剂，不溶于水，曾选用正己烷、正戊烷和丙酮作为浸提剂，结果发现正己烷和正戊烷对八氢番茄红素几乎没有提取，而丙酮作为浸提剂溶解色素的能力较强，易于回收，所以最后选用丙酮作为提取剂。
用高效液谱法测定番茄样品时，流动相曾选甲醇∶乙腈（3∶7），所得色谱峰严重拖后，在60 min内，番茄红素及八氢番茄红素均不出峰。选用甲醇∶乙腈（1∶9），能观察到番茄红素及八氢番茄红素色谱峰，但保留时间过长，不符合含量测定快速的要求；选四氢呋喃∶乙腈（1∶3），八氢番茄红素出峰时间为11.8 min，且达到基线分离。所以最后选定25%四氢呋喃∶75%乙腈作为流动相。
参考文献
[1] 宋飞翔.果蔬中的抗癌明星——西红柿[J].药物与人，2005（2）：37.
[2] 方留民.番茄可防前列腺癌[J].食品与生活，2002（5）：23.
[3] 徐晋，徐贵发.番茄红素对心血管疾病的预防作用[J].卫生研究，2008，37（3）：381-382.
[4] MATHEWSROTH M M.Antitumor activity of βCarotene，canthaxanthin and phytoene[J].Oncology，1982，39（1）：33-37.
[5] SHAAISH A，HARARI A，KAMARI Y，et al.A carotenoid algal preparation containing phytoene and phytofluene inhibited LDL oxidation in vitro[J].Plant Foods and Human Nutrition，2008，63（2）：83-86.
[6] NISHINO H，MURAKOSH M，LI H，et al.Carotenoids in cancer chemoprevention[J].Cancer and Metastasis Reviews，2002，21（3/4）：257-264.
[7] NISHINO H，SATOMI Y，TOKUDA H，et al.Cancer control by phytochemicals[J].Current Pharmaceutical Design，2007，13（33）：3394-3399.
[8] OM PRAKASH，GYANENDRA NATH SINGH，RAMAN MOHAN SINGH.Interactions of herbal extract combinations against free radical scavenging activity[J].Pharmaceutical Biology，2009，47（8）：729-733.
[9] FU FENG KUO.Multicarotenoids compositions and methods：United States ，20090312287[P].2009-12-17.