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[摘要]目的：探讨转化生长因子-β1（tansforming gowth factor -beta 1，TGF-β1）对长波紫外线（ultraviolet A， UVA）照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成和表达的影响。 方法：通过MTT法检测TGF-β1干预后成纤维细胞增殖活性，选择UVA照射剂量为15J/cm2， 联免疫法（ELISA）测定不同剂量即TGF-β1小剂量组（UVA+TGF-β1 0.1ng/ml）、中剂量组（UVA+TGF-β1 1ng/ml）、大剂量组（UVA+TGF-β1 10ng/ml）处理后成纤维细胞清夜中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量，半定量RT－PCR检测成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达。结果：UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞,导致成纤维细胞增殖活性下降， 给予不同剂量TGF-β1干预后，成纤维细胞增殖活性与UVA照射组比较，明显提高；成纤维细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量增加，成纤维细胞内Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达增强。 结论：TGF-β1可提高UVA照射体外培养成纤维细胞增殖活性；增加UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量，增强成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达，对皮肤成纤维细胞起保护作用。
[关键词]TGF-β1；UVA；皮肤成纤维细胞；Ⅰ型、Ⅲ型胶原
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0338-04
The effects of TGF-β1 on the synthesis and expression of Ⅰ，Ⅲ collagen in skin fibroblasts after UVA irradiation in vitro
WANG Ji-hua,LIU Yin,HE Yong-jing，DU Yong-gui，ZHAO Ya-nan
（Department of Plastic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming,650101,Yunnan）
Abstract: Objective To investigate the effects of TGF-β1 on the synthesis and expression of Ⅰ,Ⅲ collagen in skin fibroblasts after UVA irradiation in vitro. Methods Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） was used to test cell proliferation activity,and Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the content of Ⅰ,Ⅲ collagen in the supernatant of skin fibroblasts after adding different dose of TGF-β1( low dose 0.1 ng / ml,medium dose1.0 ng / ml、 high dose 10.0 ng / ml) and the fibroblasts were irradiated by UVA15 J/cm2 . The mRNA expression of Ⅰ,Ⅲ collagen by semi-quantitative( RT-PCR) Results UVA irradiation decreasesed the fibroblasts OD value.The fibroblasts OD value was markedly increased,compared to UVA irradiation group. With the dose of TGF-β1 increased，the experiment showed that large, and medium dose group OD values were markedly higher than that of the UVA irradiation group. Ⅰ,Ⅲ collagen protein content increased with the dose of TGF-β1 increased ，and the mRNA expression of Ⅰ,Ⅲ collagen also increased in a dose-dependent manner. Conclusion TGF-β1 treatment before UVA irradiation can improve skin fibroblasts proliferation activity in vitro. It is in a dose-dependent manner to promote the synthesis and the expression mRNA of collagen Ⅰ,Ⅲ on UVA irradiated fibroblasts .It help protect skin fibroblasts from irradiation.
Key words: tansforming gowth factor -beta 1; ultraviolet A; skin fibroblast ; Ⅰ,Ⅲ collagen
人体皮肤接受的日光紫外线（UV）照射主要为UVA和UVB。UVA能穿透表皮到达真皮，主要造成皮肤成纤维细胞损伤，而UVB在表皮层被阻挡，很少到达真皮层，主要造成表皮角质形成细胞损伤。真皮构成皮肤的主体，通过动物光老化模型和人体皮肤检测证明，皮肤反复暴露UV下，Ⅰ、Ⅲ型前胶原合成减少，真皮胶原降解，胶原分子交联，导致胶原数量的减少和结构的改变，加上异常弹力纤维沉积，出现皮肤松弛，粗糙，色素沉积、弹性下降，皱纹增多的光老化外观。有文献报道[1-2]，UV能诱导Smad7在皮肤内表达，阻碍TGF-β/Smad信号传导通路， 在皮肤成纤维细胞，TGF-β/Smad信号传导通路受阻，可导致Ⅰ型前胶原合成减少，造成胶原丧失。Gambichler 等[3]用UVA照射正常人皮肤24h后，组织内TGF-β1和Smad3/4/7与未照射部位比较明显下调。本研究通过体外培养皮肤成纤维细胞，用UVA照射建立成纤维细胞光老化模型，探讨TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成和表达的影响。
1材料和方法
1.1 主要仪器：UVA 光源(北京光学仪器厂)，紫外线辐照计（北京师范大学），Clinibio 128C 型酶标仪(ASYS HitechGmbH,奥地利)，PCR仪( Perkin Elmer公司,美国)，紫外分光光度计 U－niversal Hood Ⅱ型紫外凝胶成像系统(Bio-Rad公司,意大利) 。
1.2 主要试剂：DMEM，小牛血清，青霉素，链霉素，胰酶， Trizol试剂(MRC,美国)；AMV－逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶( Promega,美国)；及内参照β-acting引物；MMP-1,MMP-3，TGF-β1、Ⅰ型、Ⅲ型胶原引物。Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1 ELISA试剂盒( TP I,美国) 。
1.3 皮肤成纤维细胞原代培养及传代：所用的皮肤取自20～23岁成年男性包皮环切术后的皮肤组织,共6 例，术前检查均无结缔组织疾病及其他全身系统疾病。利用组织块培养法,加入含20%小牛血清的DMEM 培养液,1周后成纤维细胞爬出。待融合80%后常规消化传代,取第5代对数增殖期细胞作为实验用细胞。
1.4 不同浓度TGF-β1干预 UVA照射体外培养的成纤维细胞：将细胞接种在6 孔板上,浓度为1×105/ml，以UVA15J/ cm2照射成纤维细胞。细胞分为5组，即正常对照组（对照组不照射也不加入TGF-β1，只加入等量PBS）、UVA单纯照射组（TGF-β1 0ng/ml）、小剂量组（UVA+TGF-β1 0.1ng/ml）、中剂量组（UVA+TGF-β1 1ng/ml）、大剂量组（UVA+TGF-β1 10.0 ng/ml）。UVA紫外灯选用北京光学仪器厂UVA360nm灯管6根并排照射，先将紫外线灯管消毒后置入超净台中，HH-S恒温水浴箱严格消毒后加入三蒸水置入超净台中，用超净台紫外灯消毒30min。照射前将长波紫外灯置于恒温水浴箱上，测量灯管与96孔板照射平面之间距离为12cm，用北京师范大学光电仪器厂紫外辐照计测量此平面UVA照射功率，测量前长波紫外灯预热30min，待照射功率稳定后测得功率为18.8mJ/s,照射时以PBS置换培养基，掀开盖子，在恒温水浴箱中将细胞暴露于UVA辐照装置下，照射距离为12cm。照射前2h加入含不同浓度TGF-β1、PBS液各3ml，培养板置入37℃恒温水浴箱中，照射后置换含10%小牛血清的DMEM置入培养箱中继续培养,24h 后收样。
1.5MTT法检测TGF-β1干预后成纤维细胞增殖活性：用含10％胎小牛血清加培养液配成单个细胞悬液，以每孔10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl，培养1天后，每孔加5mg/ml MTT溶液20μl。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解，选择492nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
1.6ELISA检测TGF-β1对UVA照射体外培养成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量的影响：收集细胞上清液标本：①建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔设3复孔，每个孔中各加入标本稀释液100μl，第一孔加标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔，如此反复作倍数稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μl 弃去，使之体积均为100μl，第八孔为空白对照；②加样：待测品孔每孔各加入待测样品100μl，每个样品设3个复孔；③将反应板充分混匀后置37℃120min；④洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干；⑤每孔中加入第一抗体工作液50μl；⑥将反应板置37℃60min；⑦ 洗板：同前；⑧每孔加酶标抗体工作液100μl；⑨将反应板置37℃60min；⑩洗板：同前；⑾每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应5～10min；⑿每孔加入50μl终止液混匀；⒀在492nm处测吸光值。
1.7 半定量RT－PCR检测TGF-β1对UVA照射体外培养成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达水平的影响： RNA提取，半定量RT－PCR分析：用磷酸缓冲液(PBS) 洗三次,使用Trizol 提取RNA。首先进行反转录反应：取10μg RNA 加入到20μl 反转录反应混合液中,经94℃ 30min,99℃ 5min 和5℃ 5min 处理。在含有反转录产物的PCR 反应液中, 分别加入：
Ⅰ型胶原引物 (285bp)
上游引物 5′-GGT TTG GAG AGG CAT GAC C-3′
下游引物 5′-TTT GGG AAA TTG AGT TTG G-3′
Ⅲ型胶原引物(447bp)
上游引物 5′－ATG GTG GCT TTC AGT TCA CC-3′
下游引物 5′-TGG GGT TTC AGA GAG TTT GG -3′
Β-acting做内参照引物(510bp)
上游引物 5′-GCA CTC TTC CAG CCT TTC CTG-3′
下游引物 5′－GGA GTA CTT GCG CTC AGG AGG AGC-3′
PCR 反应体积为25μl。扩增条件：预变性94℃6min,接着94℃50s,55℃50s,72℃1.5min，30个循环后72℃7min延伸。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外凝胶成像系统扫描成像扩增产物。
1.8 统计学处理 ：数据以(x±s)表示，用SPSS 13.0统计学软件对组间数据行单因素方差分析，P<0.05有显著性差异。
2结果
2.1 TGF-β1对成纤维细胞增殖活性的影响：选择UVA 15 J/cm2照射前给予不同剂量TGF-β1干预后，结果显示：正常对照组成纤维细胞OD值明显高于UVA 照射组，有非常显著性差异（P＜0.01）；TGF-β1处理后，随着TGF-β1剂量增加，OD值升高，大、中剂量组OD值与UVA 照射组比较，有非常显著性差异（P＜0.01）（表1）。
2.2 TGF-β1对成纤维细胞细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量的影响：正常对照组Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量明显高于UVA照射组，有非常显著性差异(P<0.01)。TGF-β1处理后，随着TGF-β1剂量增加，Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量升高，呈剂量依赖关系。大剂量组、中剂量组与UVA照射组比较，有显著性差异(P<0.01，P<0.05),大剂量组对UVA照射保护作用更明显，与UVA照射组比较，有非常显著性差异(P<0.01),小剂量组处理后Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量无显著性差异（P＞0.05）(表2)。
2.3 TGF-β1对成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响： 正常对照组Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达与UVA照射组比较，有非常显著性差异(P<0.01)。TGF-β1处理后，随着TGF-β1剂量增加，Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达增强，呈剂量依赖关系。Ⅰ型胶原,大、中剂量组明显升高，与UVA照射组比较，有非常显著性差异（P<0.01），小剂量组与UVA照射组比较，无显著性差异（P＞0.05）。Ⅲ型胶原,大剂量组与UVA照射组比较，有非常显著性差异（P<0.01），中、小剂量组与UVA照射组比较,Ⅲ型胶原mRNA表达无显著性差异（P＞0.05）。（表3，图1，图2）
3讨论
3.1转化生长因子（TGF-β）是一大类多功能的细胞生长增殖调节蛋白，由Todaro等于1978年首次发现。TGF-β家族中至少有6个结构相关的分子组成，其中TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3较多见，存在于大多数哺乳动物，具有极高的同源性，氨基酸的序列在不同类别的哺乳动物间高度保守，TGF-β1在体细胞系中所占比例最高(>90%),活性最强，TGF-β1作用范围也十分广泛。TGF-β1还是一种潜在的表皮生长抑制剂，对维持组织内环境的稳定起重要作用。然而，对真皮是正向生长因子，能诱导细胞外基质(ECM)的合成[4]。Gambichler[5]对暴露于UVA 24h后的皮肤进行检测，发现TGF-β1mRNA和 Smad3/4/7 mRNA表达与未照射组比较明显下调,免疫组化显示成纤维细胞中TGF-β1蛋白水平明显减少，说明TGF-β1的表达和TGF-β/Smad信号传导通路，在皮肤老化和UV照射导致的皮肤光老化发生过程中有着重要的作用。研究表明，全反式维甲酸能增加光老化皮肤Ⅰ型前胶原的表达，可能是因为TGF-β活性和表达增加[6-7]。 Eui[8]将17β雌二醇用于老年人皮肤，检测发现 TGF-β1, TβR-II,和Smad3增加，Ⅰ型前胶原、弹力蛋白原、纤维结合蛋白-1上调，而MMP-1表达下降，也证明17β雌二醇促进胶原的合成与TGF-β1的表达和TGF-β/Smad信号传导通路有重要关系。TGF-β1是否能促进真皮成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成，未见这方面的报道。
3.2 本研究通过体外培养皮肤成纤维细胞，用TGF-β1处理后以UVA15J/cm2照射建立成纤维细胞光老化模型，细胞增殖活性测定结果显示：随TGF-β1剂量增加，成纤维细胞OD值升高，说明TGF-β1能明显提高UVA照射成纤维细胞的增殖活性。Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量，随着TGF-β1剂量增加而增加，呈剂量依赖关系，说明加入TGF-β能促进Ⅰ、Ⅲ型胶原合成，增加细胞外基质。与UVA照射组比较，在大剂量组（10 ng/ml）、中剂量组（1ng/ml）明显增强Ⅰ型胶原mRNA表达，而Ⅲ型胶原mRNA表达,大剂量组（10ng/ml）时明显增强。
3.3 据文献报道， UV能下调成纤维细胞TβR-Ⅱ对TGF-β的效应能力，干扰TGF-β依赖的Ⅰ型前胶原基因表达[9-10]。烟草烟雾提取物处理体外培养的成纤维细胞，能减少TβR-Ⅱ表达，但处理前加入重组TGF-β1（10ng/ml），TβR-Ⅱ mRNA表达增加[11]。因此，本实验加入TGF－β1后Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成增加，推测可能是因为加入TGF-β1后，TβR-ⅡmRNA表达增加，增强了TβR-Ⅱ对TGF-β的效应能力，促进成纤维细胞胶原合成。
[参考文献]
[1]Quan T,He T,Kang S,et al. Ultraviolet irradiation alters transforming growth factor beta/smad pathway in human skin in vivo[J]. Investig Dermatol,2002,119,499-506.
[2]Quan T, He T, Voorhees J,et al. Ultraviolet irradiation blocks cellular responses to transforming growth factor-beta by down-regulating its type-II receptor and inducing Smad7[J]. Biol Chem,2001, 13;276(28):26349-26356.
[3]Gambichler T,Skrygan M,Tomi NS,et al. Significant downregulation of transforming growth factor-beta signal transducers in human skin following ultraviolet-A1 irradiation[J].Br J Dermatol, 2007, 156(5):951-956.
[4]Yin L,Morita A,Tsuji T.Tobacco smoke extract induces age-related changes due to modulation of TGF- beta[J].Exper Dermatol,2003: 12 (Suppl. 2): 51-56.
[5]Gambichler T, Skrygan M, Tomi NS, et al.Significant downregulation of Transforming growth factor-beta signal transducers in human skin following ultraviolet-A1 irradiation[J]. Br J Dermatol,2007,156(5):951-956. Epub 2007 Mar 23.
[6]Glick AB, Flanders KC, Danielpour D, et al. Retinoic acid induces Transforming growth factor-beta 2 in cultured keratinocytes and mouse epidermis[J]. Cell Regul,1989,1:87-97.
[7]Fisher G. Differential modulation of transforming growth factor-b 1 expression and mucin deposition by retinoic acid and sodium lauryl sulfate in human skin[J]. Invest Dermatol, 1992, 98:102-108.
[8]Eui Dong Son,Jin Young Lee,et al. Topical application of 17b-estradiol increases extracellular matrix protein synthesis by stimulating TGF-b signaling in aged human skin in vivo[J]. J Invest Dermatol 2005,124:1149 -1161.
[9]Quan T, He T, Voorhees JJ, et al. Ultraviolet irradiation blockscellular responses to transforming growth factor- beta by down-regulating its type- II receptor and inducing Smad7 [J]. J BiolChem, 2001, 276(28): 26349- 26356
[10]Fisher GJ, Kang S, Varani J, et al. Mechanisms of photoaging and chronological skin aging[J]. Arch Dermatol, 2002, 138(11):1462-1470.
[11]Yin L, Morita A, Tsuji T. Tobacco smoke extract induces age-related changes due tomodulation of TGF-β[J].Exp Dermatol,2003: 12 (Suppl. 2): 51-56.
[收稿日期]2008-09-26 [修回日期]2009-01-19
编辑/张惠娟
[关键词]TGF-β1；UVA；皮肤成纤维细胞；Ⅰ型、Ⅲ型胶原
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0338-04
The effects of TGF-β1 on the synthesis and expression of Ⅰ，Ⅲ collagen in skin fibroblasts after UVA irradiation in vitro
WANG Ji-hua,LIU Yin,HE Yong-jing，DU Yong-gui，ZHAO Ya-nan
（Department of Plastic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming,650101,Yunnan）
Abstract: Objective To investigate the effects of TGF-β1 on the synthesis and expression of Ⅰ,Ⅲ collagen in skin fibroblasts after UVA irradiation in vitro. Methods Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） was used to test cell proliferation activity,and Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the content of Ⅰ,Ⅲ collagen in the supernatant of skin fibroblasts after adding different dose of TGF-β1( low dose 0.1 ng / ml,medium dose1.0 ng / ml、 high dose 10.0 ng / ml) and the fibroblasts were irradiated by UVA15 J/cm2 . The mRNA expression of Ⅰ,Ⅲ collagen by semi-quantitative( RT-PCR) Results UVA irradiation decreasesed the fibroblasts OD value.The fibroblasts OD value was markedly increased,compared to UVA irradiation group. With the dose of TGF-β1 increased，the experiment showed that large, and medium dose group OD values were markedly higher than that of the UVA irradiation group. Ⅰ,Ⅲ collagen protein content increased with the dose of TGF-β1 increased ，and the mRNA expression of Ⅰ,Ⅲ collagen also increased in a dose-dependent manner. Conclusion TGF-β1 treatment before UVA irradiation can improve skin fibroblasts proliferation activity in vitro. It is in a dose-dependent manner to promote the synthesis and the expression mRNA of collagen Ⅰ,Ⅲ on UVA irradiated fibroblasts .It help protect skin fibroblasts from irradiation.
Key words: tansforming gowth factor -beta 1; ultraviolet A; skin fibroblast ; Ⅰ,Ⅲ collagen
人体皮肤接受的日光紫外线（UV）照射主要为UVA和UVB。UVA能穿透表皮到达真皮，主要造成皮肤成纤维细胞损伤，而UVB在表皮层被阻挡，很少到达真皮层，主要造成表皮角质形成细胞损伤。真皮构成皮肤的主体，通过动物光老化模型和人体皮肤检测证明，皮肤反复暴露UV下，Ⅰ、Ⅲ型前胶原合成减少，真皮胶原降解，胶原分子交联，导致胶原数量的减少和结构的改变，加上异常弹力纤维沉积，出现皮肤松弛，粗糙，色素沉积、弹性下降，皱纹增多的光老化外观。有文献报道[1-2]，UV能诱导Smad7在皮肤内表达，阻碍TGF-β/Smad信号传导通路， 在皮肤成纤维细胞，TGF-β/Smad信号传导通路受阻，可导致Ⅰ型前胶原合成减少，造成胶原丧失。Gambichler 等[3]用UVA照射正常人皮肤24h后，组织内TGF-β1和Smad3/4/7与未照射部位比较明显下调。本研究通过体外培养皮肤成纤维细胞，用UVA照射建立成纤维细胞光老化模型，探讨TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成和表达的影响。
1材料和方法
1.1 主要仪器：UVA 光源(北京光学仪器厂)，紫外线辐照计（北京师范大学），Clinibio 128C 型酶标仪(ASYS HitechGmbH,奥地利)，PCR仪( Perkin Elmer公司,美国)，紫外分光光度计 U－niversal Hood Ⅱ型紫外凝胶成像系统(Bio-Rad公司,意大利) 。
1.2 主要试剂：DMEM，小牛血清，青霉素，链霉素，胰酶， Trizol试剂(MRC,美国)；AMV－逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶( Promega,美国)；及内参照β-acting引物；MMP-1,MMP-3，TGF-β1、Ⅰ型、Ⅲ型胶原引物。Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1 ELISA试剂盒( TP I,美国) 。
1.3 皮肤成纤维细胞原代培养及传代：所用的皮肤取自20～23岁成年男性包皮环切术后的皮肤组织,共6 例，术前检查均无结缔组织疾病及其他全身系统疾病。利用组织块培养法,加入含20%小牛血清的DMEM 培养液,1周后成纤维细胞爬出。待融合80%后常规消化传代,取第5代对数增殖期细胞作为实验用细胞。
1.4 不同浓度TGF-β1干预 UVA照射体外培养的成纤维细胞：将细胞接种在6 孔板上,浓度为1×105/ml，以UVA15J/ cm2照射成纤维细胞。细胞分为5组，即正常对照组（对照组不照射也不加入TGF-β1，只加入等量PBS）、UVA单纯照射组（TGF-β1 0ng/ml）、小剂量组（UVA+TGF-β1 0.1ng/ml）、中剂量组（UVA+TGF-β1 1ng/ml）、大剂量组（UVA+TGF-β1 10.0 ng/ml）。UVA紫外灯选用北京光学仪器厂UVA360nm灯管6根并排照射，先将紫外线灯管消毒后置入超净台中，HH-S恒温水浴箱严格消毒后加入三蒸水置入超净台中，用超净台紫外灯消毒30min。照射前将长波紫外灯置于恒温水浴箱上，测量灯管与96孔板照射平面之间距离为12cm，用北京师范大学光电仪器厂紫外辐照计测量此平面UVA照射功率，测量前长波紫外灯预热30min，待照射功率稳定后测得功率为18.8mJ/s,照射时以PBS置换培养基，掀开盖子，在恒温水浴箱中将细胞暴露于UVA辐照装置下，照射距离为12cm。照射前2h加入含不同浓度TGF-β1、PBS液各3ml，培养板置入37℃恒温水浴箱中，照射后置换含10%小牛血清的DMEM置入培养箱中继续培养,24h 后收样。
1.5MTT法检测TGF-β1干预后成纤维细胞增殖活性：用含10％胎小牛血清加培养液配成单个细胞悬液，以每孔10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl，培养1天后，每孔加5mg/ml MTT溶液20μl。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解，选择492nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
1.6ELISA检测TGF-β1对UVA照射体外培养成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量的影响：收集细胞上清液标本：①建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔设3复孔，每个孔中各加入标本稀释液100μl，第一孔加标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔，如此反复作倍数稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μl 弃去，使之体积均为100μl，第八孔为空白对照；②加样：待测品孔每孔各加入待测样品100μl，每个样品设3个复孔；③将反应板充分混匀后置37℃120min；④洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干；⑤每孔中加入第一抗体工作液50μl；⑥将反应板置37℃60min；⑦ 洗板：同前；⑧每孔加酶标抗体工作液100μl；⑨将反应板置37℃60min；⑩洗板：同前；⑾每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应5～10min；⑿每孔加入50μl终止液混匀；⒀在492nm处测吸光值。
1.7 半定量RT－PCR检测TGF-β1对UVA照射体外培养成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达水平的影响： RNA提取，半定量RT－PCR分析：用磷酸缓冲液(PBS) 洗三次,使用Trizol 提取RNA。首先进行反转录反应：取10μg RNA 加入到20μl 反转录反应混合液中,经94℃ 30min,99℃ 5min 和5℃ 5min 处理。在含有反转录产物的PCR 反应液中, 分别加入：
Ⅰ型胶原引物 (285bp)
上游引物 5′-GGT TTG GAG AGG CAT GAC C-3′
下游引物 5′-TTT GGG AAA TTG AGT TTG G-3′
Ⅲ型胶原引物(447bp)
上游引物 5′－ATG GTG GCT TTC AGT TCA CC-3′
下游引物 5′-TGG GGT TTC AGA GAG TTT GG -3′
Β-acting做内参照引物(510bp)
上游引物 5′-GCA CTC TTC CAG CCT TTC CTG-3′
下游引物 5′－GGA GTA CTT GCG CTC AGG AGG AGC-3′
PCR 反应体积为25μl。扩增条件：预变性94℃6min,接着94℃50s,55℃50s,72℃1.5min，30个循环后72℃7min延伸。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外凝胶成像系统扫描成像扩增产物。
1.8 统计学处理 ：数据以(x±s)表示，用SPSS 13.0统计学软件对组间数据行单因素方差分析，P<0.05有显著性差异。
2结果
2.1 TGF-β1对成纤维细胞增殖活性的影响：选择UVA 15 J/cm2照射前给予不同剂量TGF-β1干预后，结果显示：正常对照组成纤维细胞OD值明显高于UVA 照射组，有非常显著性差异（P＜0.01）；TGF-β1处理后，随着TGF-β1剂量增加，OD值升高，大、中剂量组OD值与UVA 照射组比较，有非常显著性差异（P＜0.01）（表1）。
2.2 TGF-β1对成纤维细胞细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量的影响：正常对照组Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量明显高于UVA照射组，有非常显著性差异(P<0.01)。TGF-β1处理后，随着TGF-β1剂量增加，Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量升高，呈剂量依赖关系。大剂量组、中剂量组与UVA照射组比较，有显著性差异(P<0.01，P<0.05),大剂量组对UVA照射保护作用更明显，与UVA照射组比较，有非常显著性差异(P<0.01),小剂量组处理后Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量无显著性差异（P＞0.05）(表2)。
2.3 TGF-β1对成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响： 正常对照组Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达与UVA照射组比较，有非常显著性差异(P<0.01)。TGF-β1处理后，随着TGF-β1剂量增加，Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达增强，呈剂量依赖关系。Ⅰ型胶原,大、中剂量组明显升高，与UVA照射组比较，有非常显著性差异（P<0.01），小剂量组与UVA照射组比较，无显著性差异（P＞0.05）。Ⅲ型胶原,大剂量组与UVA照射组比较，有非常显著性差异（P<0.01），中、小剂量组与UVA照射组比较,Ⅲ型胶原mRNA表达无显著性差异（P＞0.05）。（表3，图1，图2）
3讨论
3.1转化生长因子（TGF-β）是一大类多功能的细胞生长增殖调节蛋白，由Todaro等于1978年首次发现。TGF-β家族中至少有6个结构相关的分子组成，其中TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3较多见，存在于大多数哺乳动物，具有极高的同源性，氨基酸的序列在不同类别的哺乳动物间高度保守，TGF-β1在体细胞系中所占比例最高(>90%),活性最强，TGF-β1作用范围也十分广泛。TGF-β1还是一种潜在的表皮生长抑制剂，对维持组织内环境的稳定起重要作用。然而，对真皮是正向生长因子，能诱导细胞外基质(ECM)的合成[4]。Gambichler[5]对暴露于UVA 24h后的皮肤进行检测，发现TGF-β1mRNA和 Smad3/4/7 mRNA表达与未照射组比较明显下调,免疫组化显示成纤维细胞中TGF-β1蛋白水平明显减少，说明TGF-β1的表达和TGF-β/Smad信号传导通路，在皮肤老化和UV照射导致的皮肤光老化发生过程中有着重要的作用。研究表明，全反式维甲酸能增加光老化皮肤Ⅰ型前胶原的表达，可能是因为TGF-β活性和表达增加[6-7]。 Eui[8]将17β雌二醇用于老年人皮肤，检测发现 TGF-β1, TβR-II,和Smad3增加，Ⅰ型前胶原、弹力蛋白原、纤维结合蛋白-1上调，而MMP-1表达下降，也证明17β雌二醇促进胶原的合成与TGF-β1的表达和TGF-β/Smad信号传导通路有重要关系。TGF-β1是否能促进真皮成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成，未见这方面的报道。
3.2 本研究通过体外培养皮肤成纤维细胞，用TGF-β1处理后以UVA15J/cm2照射建立成纤维细胞光老化模型，细胞增殖活性测定结果显示：随TGF-β1剂量增加，成纤维细胞OD值升高，说明TGF-β1能明显提高UVA照射成纤维细胞的增殖活性。Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量，随着TGF-β1剂量增加而增加，呈剂量依赖关系，说明加入TGF-β能促进Ⅰ、Ⅲ型胶原合成，增加细胞外基质。与UVA照射组比较，在大剂量组（10 ng/ml）、中剂量组（1ng/ml）明显增强Ⅰ型胶原mRNA表达，而Ⅲ型胶原mRNA表达,大剂量组（10ng/ml）时明显增强。
3.3 据文献报道， UV能下调成纤维细胞TβR-Ⅱ对TGF-β的效应能力，干扰TGF-β依赖的Ⅰ型前胶原基因表达[9-10]。烟草烟雾提取物处理体外培养的成纤维细胞，能减少TβR-Ⅱ表达，但处理前加入重组TGF-β1（10ng/ml），TβR-Ⅱ mRNA表达增加[11]。因此，本实验加入TGF－β1后Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成增加，推测可能是因为加入TGF-β1后，TβR-ⅡmRNA表达增加，增强了TβR-Ⅱ对TGF-β的效应能力，促进成纤维细胞胶原合成。
[参考文献]
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[收稿日期]2008-09-26 [修回日期]2009-01-19
编辑/张惠娟