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【摘要】目的：探究丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1活化细胞内Smad与p38MAPK信号传导通路的抑制作用。方法：将肾小管上皮细胞培养液中加入不同的药物，诱导组加入20μg/ml的马兜铃酸进行诱导；实验A1、A2、A3组，在诱导组的基础上分别加入5、10、20μg/ml的丹参水溶性物质SA-B；对照组不加任何药物。细胞培养24、48、72h后检测各组的TGF-β1-mRND水平、培养液中TGF-β1的含量、Smad以及p38MAPK的表达进行，记录检测结果。结果：诱导组的TGF-β1-mRND水平、TGF-β1蛋白含量分泌与对照组相比，均具有统计学意义（P<0.05），且实验组的同期诱导组相比，水平显著下降（P<0.05）。诱导组的Smad与p38MAPK合成趋势明显，而实验组Smad与p38MAPK的表达呈现下降趋势。结论：丹参的水溶性物质-SA-B对TGF-β1活化细胞内Smad与p38MAPK信号传导通路具有显著的抑制作用。
【关键词】丹参水溶性物质SA-B；TGF-β1；Smad；p38MAPK
【中图分类号】R285.5【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）09-0018-02
研究发现，丹参水溶性物质SA-B对于TGF-β1活化细胞内Smad与p38MAPK信号传导通路具有显著的抑制作用，表明丹参水溶性物质SA-B在降低肾组织转化因子-β1（TGF-β1）水平的过度表达方面，具有显著的抑制作用[1]。研究采用丹参水溶性物质SA-B，并借助马兜铃酸诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1，探究丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1活化细胞内Smad与p38MAPK的抑制作用。
1材料与方法
1.1试剂与药品丹参水溶性物质SA-B（批号：111871-201001，中国药品生物制品检定所），实验时配置成浓度分别为5、10、20μg/ml的三种试剂进行使用。TGF-β1 ELISA试剂盒（美国R&D公司）；抗Smad抗体（美国CST公司）；抗p38MAPK抗体（美国CST公司）。肾小管上皮组织细胞。
1.2实验方法将肾小管上皮细胞用含2%胎牛血清的K-SFM培养液进行培养，取第6～7代细胞进行试验。当细胞生长到80%融合时，更换无血清培养液[2]。12h以后进行细胞分组。诱导组加入20μg/ml的马兜铃酸进行诱导；实验组：分成A1、A2、A3三个小组，在诱导组的基础上分别加入5、10、20μg/ml的丹参水溶性物质SA-B；对照组不加任何药物。观察不同剂量的丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1、Smad以及p38MAPK表达水平的影响。
1.3测定方法①采用荧光定量PCR检测TGF-β1-mRND水平。②ELISA检测培养液中TGF-β1的含量，吸取培养液后分析取上清，并按照ELISA试剂盒的说明进行操作，采用酶标仪读取吸光度，并计算TGF-β1的含量。③用免疫印迹法检测Smad以及p38MAPK的表达，在细胞分裂后提取蛋白定量，加入Smad抗体（1∶[KG-*3/5]400）与p38MAPK（1∶[KG-*3/5]400）抗体；过夜以后将HRP标记的IgG（1∶[KG-*3/5]500）加入[3]。放置1h后将ECL液加入，显影后在暗室曝光，最后进行图像分析。以上三种测定方式，分别在每组细胞培养24、48、72h后进行，记录检测结果。
1.4统计学方法数据采用SPSS 20.0统计学软件进行处理，计量资料采用均数士标准差（x[TX-*3]±s）的形式表示，采用t检验；计数资料用率（%）表示，用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1-mRND水平表达的影响诱导组的TGF-β1-mRND水平在刺激24、48h后持续上升，72h有所降低，但仍处于高水平，与对照组相比，P<0.05；实验组在采用丹参水溶性物质SA-B进行干预24、48h后，TGF-β1-mRND水平显著下降，与诱导组相比，P<0.05；且在48h以后，TGF-β1-mRND的下降水平更加明显（P<0.05）。见表1。
2.2丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1蛋白含量的影响诱导组的TGF-β1蛋白含量分泌增加，与对照组相比，P<0.05；在72h有所降低，但仍显著高于对照组（P<0.05）；而实验组的TGF-β1蛋白含量与同时期的诱导组相比，显著下降。且在48h以后，丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1的抑制作用随着用量的增加而加强。见表2。
2.3丹参水溶性物质SA-B对Smad与p38MAPK表达的影响诱导组的Smad与p38MAPK合成趋势明显，而实验组在采用丹参水溶性物质SA-B干预后，Smad与p38MAPK的表达呈现下降趋势。且在72h后，Smad与p38MAPK的高表达持续下降。见表3 。
3讨论
丹参是临床较为常见的一种药材，在消炎、抗菌、抗凝血方面，具有显著的作用，临床上主要用于心血管系统、神经神经的保护[4]。丹参酸是丹参中的水溶性活性成分，其中以丹参酸A和丹参酸B的活性最强，在抗脂质过氧化、清除氧自由基、保护心脏、心脑血管、防治动脉粥样硬化、抗肿瘤等方面有显著的生物活性，常用于心肌缺血再灌注损伤、心脏微血管内皮细胞等的保护中。实验表明，丹参酸B在抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中的钙离子超载、改善血栓素/前列环素（TXA2/PGI2）平衡系统、减少内皮素（ET）及肿瘤坏死因子a（TNF-a）的释放、降低缺氧/复氧损伤后内皮细胞细胞间粘附分子的表达方面具有显著作用。此外，丹参的水溶性物质SA-B对于降低肾组织TGF-β1的过度表达，抑制肾小管上皮细胞的转分化与纤维化等具有显著的作用[5]。研究结果显示，丹参的水溶性物质SA-B对于降低TGF-β1-mRND表达、抑制TGF-β1蛋白含量分泌具有显著的作用，且对于TGF-β1活性细胞中的Smad与p38MAPK过量表达也有显著的抑制作用。
综上所述，丹参的水溶性物质SA-B能够抑制TGF-β1活化细胞的蛋白质含量分泌，对于细胞内的Smad与p38MAPK也具有显著的抑制作用。
参考文献
[1]刘成海，刘平，胡义扬，等.丹酚酸B盐对转化生长因子-β1刺激肝星状细胞活化与胞内信号转导的作用[J].中华医学杂志，2002，82（18）：1267-1272.
[2]杨佳，张毅，秦彩玲，等.丹参、三七的有效部位对正常大鼠血小板粘聚性及TXA2、PGI2的影响[J].中国实验方剂学杂志，2004，10（5）：21-24.
[3]武子朝，韩瑞旸，朱建彪，等.丹酚酸B通过抑制线粒体功能增加胶质瘤细胞的放疗敏感性[J].现代生物医学进展，2015，15（9）：1636-1639.
[4]吴甜莺，张雄，郑永克，等.电针联合丹酚酸B治疗对衰老模型大鼠记忆障碍的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2015，37（6）：467-469.
[5]陶艳艳，王晓玲，刘成海，等.丹酚酸B对NIH/3T3成纤维细胞TGF-β1/ERK胞内信号转导的影响[J].首都医科大学学报，2007，28（2）：192-195.
（收稿日期：2016.03.17）
【关键词】丹参水溶性物质SA-B；TGF-β1；Smad；p38MAPK
【中图分类号】R285.5【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）09-0018-02
研究发现，丹参水溶性物质SA-B对于TGF-β1活化细胞内Smad与p38MAPK信号传导通路具有显著的抑制作用，表明丹参水溶性物质SA-B在降低肾组织转化因子-β1（TGF-β1）水平的过度表达方面，具有显著的抑制作用[1]。研究采用丹参水溶性物质SA-B，并借助马兜铃酸诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1，探究丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1活化细胞内Smad与p38MAPK的抑制作用。
1材料与方法
1.1试剂与药品丹参水溶性物质SA-B（批号：111871-201001，中国药品生物制品检定所），实验时配置成浓度分别为5、10、20μg/ml的三种试剂进行使用。TGF-β1 ELISA试剂盒（美国R&D公司）；抗Smad抗体（美国CST公司）；抗p38MAPK抗体（美国CST公司）。肾小管上皮组织细胞。
1.2实验方法将肾小管上皮细胞用含2%胎牛血清的K-SFM培养液进行培养，取第6～7代细胞进行试验。当细胞生长到80%融合时，更换无血清培养液[2]。12h以后进行细胞分组。诱导组加入20μg/ml的马兜铃酸进行诱导；实验组：分成A1、A2、A3三个小组，在诱导组的基础上分别加入5、10、20μg/ml的丹参水溶性物质SA-B；对照组不加任何药物。观察不同剂量的丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1、Smad以及p38MAPK表达水平的影响。
1.3测定方法①采用荧光定量PCR检测TGF-β1-mRND水平。②ELISA检测培养液中TGF-β1的含量，吸取培养液后分析取上清，并按照ELISA试剂盒的说明进行操作，采用酶标仪读取吸光度，并计算TGF-β1的含量。③用免疫印迹法检测Smad以及p38MAPK的表达，在细胞分裂后提取蛋白定量，加入Smad抗体（1∶[KG-*3/5]400）与p38MAPK（1∶[KG-*3/5]400）抗体；过夜以后将HRP标记的IgG（1∶[KG-*3/5]500）加入[3]。放置1h后将ECL液加入，显影后在暗室曝光，最后进行图像分析。以上三种测定方式，分别在每组细胞培养24、48、72h后进行，记录检测结果。
1.4统计学方法数据采用SPSS 20.0统计学软件进行处理，计量资料采用均数士标准差（x[TX-*3]±s）的形式表示，采用t检验；计数资料用率（%）表示，用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1-mRND水平表达的影响诱导组的TGF-β1-mRND水平在刺激24、48h后持续上升，72h有所降低，但仍处于高水平，与对照组相比，P<0.05；实验组在采用丹参水溶性物质SA-B进行干预24、48h后，TGF-β1-mRND水平显著下降，与诱导组相比，P<0.05；且在48h以后，TGF-β1-mRND的下降水平更加明显（P<0.05）。见表1。
2.2丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1蛋白含量的影响诱导组的TGF-β1蛋白含量分泌增加，与对照组相比，P<0.05；在72h有所降低，但仍显著高于对照组（P<0.05）；而实验组的TGF-β1蛋白含量与同时期的诱导组相比，显著下降。且在48h以后，丹参水溶性物质SA-B对TGF-β1的抑制作用随着用量的增加而加强。见表2。
2.3丹参水溶性物质SA-B对Smad与p38MAPK表达的影响诱导组的Smad与p38MAPK合成趋势明显，而实验组在采用丹参水溶性物质SA-B干预后，Smad与p38MAPK的表达呈现下降趋势。且在72h后，Smad与p38MAPK的高表达持续下降。见表3 。
3讨论
丹参是临床较为常见的一种药材，在消炎、抗菌、抗凝血方面，具有显著的作用，临床上主要用于心血管系统、神经神经的保护[4]。丹参酸是丹参中的水溶性活性成分，其中以丹参酸A和丹参酸B的活性最强，在抗脂质过氧化、清除氧自由基、保护心脏、心脑血管、防治动脉粥样硬化、抗肿瘤等方面有显著的生物活性，常用于心肌缺血再灌注损伤、心脏微血管内皮细胞等的保护中。实验表明，丹参酸B在抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中的钙离子超载、改善血栓素/前列环素（TXA2/PGI2）平衡系统、减少内皮素（ET）及肿瘤坏死因子a（TNF-a）的释放、降低缺氧/复氧损伤后内皮细胞细胞间粘附分子的表达方面具有显著作用。此外，丹参的水溶性物质SA-B对于降低肾组织TGF-β1的过度表达，抑制肾小管上皮细胞的转分化与纤维化等具有显著的作用[5]。研究结果显示，丹参的水溶性物质SA-B对于降低TGF-β1-mRND表达、抑制TGF-β1蛋白含量分泌具有显著的作用，且对于TGF-β1活性细胞中的Smad与p38MAPK过量表达也有显著的抑制作用。
综上所述，丹参的水溶性物质SA-B能够抑制TGF-β1活化细胞的蛋白质含量分泌，对于细胞内的Smad与p38MAPK也具有显著的抑制作用。
参考文献
[1]刘成海，刘平，胡义扬，等.丹酚酸B盐对转化生长因子-β1刺激肝星状细胞活化与胞内信号转导的作用[J].中华医学杂志，2002，82（18）：1267-1272.
[2]杨佳，张毅，秦彩玲，等.丹参、三七的有效部位对正常大鼠血小板粘聚性及TXA2、PGI2的影响[J].中国实验方剂学杂志，2004，10（5）：21-24.
[3]武子朝，韩瑞旸，朱建彪，等.丹酚酸B通过抑制线粒体功能增加胶质瘤细胞的放疗敏感性[J].现代生物医学进展，2015，15（9）：1636-1639.
[4]吴甜莺，张雄，郑永克，等.电针联合丹酚酸B治疗对衰老模型大鼠记忆障碍的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2015，37（6）：467-469.
[5]陶艳艳，王晓玲，刘成海，等.丹酚酸B对NIH/3T3成纤维细胞TGF-β1/ERK胞内信号转导的影响[J].首都医科大学学报，2007，28（2）：192-195.
（收稿日期：2016.03.17）