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摘要[目的]以采自海南、广东、广西、福建的含羞草以及云南禄丰南苜蓿中分离的根瘤菌和根际菌为研究对象，从中筛选得到产聚β羟基丁酸（PHB）菌株227。[方法]主要采用革兰氏染色、苏丹黑染色、16SrDNA测序等方法。[结果]该菌株的生物学特征为：杆状，大小（0.5～0.9） μm×（1.2～3.0） μm，革兰氏阴性，胞内具PHB颗粒，属于伯克霍尔德氏菌（Burkholderia），同源性达98%。该菌在28 ℃条件下生长良好，细菌胞内可积累大量的PHB，摇瓶培养40 h后至稳定期，该菌株积累的PHB量可达细胞干重的最大值。[结论]该研究为PHB产生菌提供了菌株资源。
关键词根瘤菌；聚β羟基丁酸PHB；伯克霍尔德属
中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-008-03
多聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一类广泛存在于微生物细胞内的高分子生物聚酯，一般主要作为碳源和能量的贮藏物质[1]。目前，已发现PHAs至少有150种不同的单体结构。PHA 的单体结构也多种多样，其中3羟基脂肪酸单体包括3羟基丙酸到3羟基十六酸的所有成员，还有4、5、6羟基脂肪酸以及含有不饱和键、带有甲基侧链或其他功能基团的3羟基脂肪酸作为PHA 单体的情况[2]。PHAs生产的关键仍然是获得高产、高转化率的微生物菌株[3]，所以从环境中筛选出高产野生菌株是研究工作的热点。目前研究最广泛的是真养产碱杆菌（Alcaligenes eutropbus）。
聚3羟基丁酸酯（Polyhydroxybutyrate，PHB）是结构最简单的PHA 成员。1925年Lemoigne[4]首先发现了聚β羟基丁酸（PHB）。它具有机械性能非常类似于传统的塑料如聚丙烯或聚乙烯，可挤出，模制，纺成纤维，制成薄膜，并与其他合成的聚合物组成杂聚物[5]。它既可以替代石化塑料制作生产与生活用品，又可以作为医用材料（如心脏瓣膜、人造血管、缝合线、药物缓释与软组织修复）[6]，还是医学组织工程中克隆器官的优良支架材料。笔者以苜蓿含羞草根瘤菌以及根际土壤菌为研究材料，通过革兰氏染色、苏丹黑染色，筛选得到一株菌为227。
1材料与方法
1.1菌株
1.1.1菌种来源。海南、广东、广西、福建自含羞草分离的根瘤菌株，云南禄丰南苜蓿根瘤菌及获得的根瘤内生菌。
1.1.2培养基与试剂。YMA培养基组成为：KH2PO4 0.25 g，K2HPO4 0.25 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，甘露醇10 g，酵母粉0.8 g，琼脂15～18 g，pH 6.5～7.0。种子培养基组成为：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2。发酵培养基组成为：葡萄糖30 g，（NH4）2SO4 3 g，KH2PO4·12H2O 0.61 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 0.3 g，酵母粉1 g，HBO3 5 g/L，Na2MoO4 5 g/L 4 ml，pH 7.0[7]。PHB标准品由中国农业大学提供。称取3 g苏丹黑B颗粒（西德serva进口分装），溶到100 ml浓度70%的乙醇中[8]，得苏丹黑B染液。
1.2方法
1.2.1活化菌株。将保存的甘油管菌株活化到YMA固体培养基，平板倒置28 ℃培养1～2 d。
1.2.2初筛。将菌株活化后重新编号1～2 000，转接到YMA固体培养基的培养皿中，于28 ℃培养24～48 h后进行革兰氏染色。
1.2.3复筛。采用苏丹黑染色法将少许细菌热固定于载玻片上后，用3 g/L苏丹黑乙醇溶液染色10～15 min，二甲苯浸泡脱色，再用5 g/L番红水溶液复染，置油镜下观察，PHB颗粒呈蓝黑色，菌体呈红色[8]。
1.2.4PHA的提取。从试管中取一环菌接种到10 ml发酵管中，培养20 h。发酵培养基的装液量为76 ml，取培养好的种子培养液4 ml，接种量为5%，培养40 h。将发酵液以8 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗涤、离心，然后冰冻备用。 将离心获得的湿菌体悬浮于45 ml 蒸馏水中，加入浓度10%NaClO 溶液5 ml、浓度10% SDS 5 ml，使其总体积为50 ml，在35 ℃的恒温水浴中搅拌处理10 min。将处理后的菌液8 000 r/min 离心10 min，所获得的沉淀用蒸馏水和丙酮各洗涤1次，烘干，按照10 ml 氯仿/0.2 g干菌体的比例加入氯仿，抽提，过滤，滤液蒸发，除去氯仿，以析出PHB。将析出的PHB 再分别用丙酮和乙醇洗涤1次，在60～70 ℃的条件下烘干，得到白色粉末或薄膜状PHB[9]。
1.2.5筛选菌株的确定。
1.2.5.1GUTC法提DNA。用浓度0.9%生理盐水收集TY斜面上的菌，每个斜面取1 ml生理盐水冲洗菌体，加入到EP管，12 000 r/min离心2 min，离心洗涤3次，弃上清液，加入600 μl GUTC缓冲液振荡、摇匀，室温放置15 min，12 000 r/min 2 min，弃上清液，加入60 μl硅藻土悬液振荡，室温放置15 min，12 000 r/min 2 min，弃上清液，加入500 μl GUTC缓冲液振荡、摇匀，室温放置15 min，12 000 r/min 2 min，弃上清液，加入600 μl 洗涤缓冲液离心洗涤2次，12 000 r/min 2 min，弃上清，加入600 μl浓度75%乙醇离心洗涤1次，12 000 r/min 2 min，弃上清，在超净工作台干燥沉淀物（硅藻土变白），加入50 μl TEbuffer 55～65 ℃保温5～7 min[10]，离心收集上清液至小EP管中。 1.2.5.2PCR扩增。反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30s，72 ℃延伸90 s，72 ℃8 min，30个循环。
2结果与分析
2.1初筛初筛的结果见图1。根据菌体中心未染色的面积的大小，筛得200株。
图1革兰氏染色后的菌体形态2.2复筛利用苏丹黑B染色初筛得到的菌株的结果见图2。菌体外围泛红、内部可见明显的蓝黑色颗粒的菌株可能是产生PHAs的细菌，最后筛得一株PH产生菌。
图2苏丹黑B染色结果2.3菌株227的形态特征菌株227杆状，两端钝圆，无芽孢，革兰氏阴性菌；细胞大小（0.5～0.9）μm×（1.2～3.0）μm；PHB颗粒胞内舍嗜苏丹黑B颗粒，占细胞大部分空间；菌落湿润光滑有光泽、边缘整齐。
2.4PHB的提取提取后得到PHB干品，见图3。
图3菌株227提取得到的PHB2.5227菌株16s rDNA测序结果及系统发育的分析测序结果如下：
将该序列已登陆到GeneBank，注册号为HM582870.1。将227菌株的16S rDNA序列在NCBI进行BLAST，所获得的同源序列为根瘤菌的16S rDNA序列，其中相似性最高的为伯克霍尔德属的菌株。227菌株与Burkholderia caribensis，Burkholderia hospita的同源性最高，均为98%，因此确定227菌株属于伯克霍尔德属。
3结论与讨论
（1）研究中，采用革兰氏染色，进行PHB产生菌的筛选。由于根瘤菌为革兰氏阴性菌，菌体内的酯类会呈现出中心亮点，类似芽孢状，呈不规则状。经苏丹黑B染色，结合显微镜检，选出PHB颗粒较大、生长较旺盛的菌株。该方法大大减少了筛选过程中的工作量，而且取得较好的效果。通过革兰氏染色、苏丹黑染色筛选得到的菌体更加准确。
（2）经初筛、复筛获一高产PHB菌株227，胞内积累大量的PHB颗粒，而且发酵周期短，为今后发酵条件的进一步研究提供保证。
（3）在经过生物学特征研究后，发现菌株227为伯克霍尔德属（Burkholderia）。它是根瘤菌中初次发现的产PHB的菌株。因此，该研究为PHB的产业化提供了菌株资源，具有很好的应用价值。
参考文献
[1] 于平，励建荣.真养产碱杆菌发酵生产PHB的培养条件优化[J].中国食品学报，2007，7（1）：59-63.
[2] STEINBCHEL A，VALENTIN H E.Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids[J].FEMS Microbiol Lett，1995，128：219-228.
[3] 陈国强.生物可降解材料产业现状与趋势分析[J].新材料产业，2007（12）：42-46.
[4] LEMOIGNE M，ANN.Etudes sur l'autolyse microbie acidification par formation d'acide βoxybutyrique[J].Ann Inst Pasteur，1925，39：144-173.
[5] KHANNA S，SRIVASTAVA A K.Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates[J].Process Biochemistry，2005（40）：607-619.
[6] 张岩峰，田立，宋水山.聚4羟基丁酸的微生物合成及医学应用[J].工程塑料应用，2011，39（1）：48-52.
[7] 张婵，董岳峰，王海宾，等.费氏中华根瘤菌合成羟基丁酸和羟基己酸共聚物的研究[J].微生物学杂志，2007，34（6）：1077-1081.
[8] 李市场，刘红霞，朱朝阳.低能离子注入油脂高产菌株黏红酵母（Rhodotorula glutinis）的选育[J].中国粮油学报，2011，26（8）：33-34.
[9] 许旭萍，陈接锋，谢华玲.次氯酸钠-氯仿提取球衣菌PHB的研究[J].福建师范大学学报：自然科学版，2004，20（1）：74-77.
[10] 刘晓凤.一株嗜盐产甲烷菌的分离、生物学特性、系统发育分析及产甲烷活性污泥利用CO的初步研究[D].成都：四川大学，2006：26-28.
关键词根瘤菌；聚β羟基丁酸PHB；伯克霍尔德属
中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-008-03
多聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一类广泛存在于微生物细胞内的高分子生物聚酯，一般主要作为碳源和能量的贮藏物质[1]。目前，已发现PHAs至少有150种不同的单体结构。PHA 的单体结构也多种多样，其中3羟基脂肪酸单体包括3羟基丙酸到3羟基十六酸的所有成员，还有4、5、6羟基脂肪酸以及含有不饱和键、带有甲基侧链或其他功能基团的3羟基脂肪酸作为PHA 单体的情况[2]。PHAs生产的关键仍然是获得高产、高转化率的微生物菌株[3]，所以从环境中筛选出高产野生菌株是研究工作的热点。目前研究最广泛的是真养产碱杆菌（Alcaligenes eutropbus）。
聚3羟基丁酸酯（Polyhydroxybutyrate，PHB）是结构最简单的PHA 成员。1925年Lemoigne[4]首先发现了聚β羟基丁酸（PHB）。它具有机械性能非常类似于传统的塑料如聚丙烯或聚乙烯，可挤出，模制，纺成纤维，制成薄膜，并与其他合成的聚合物组成杂聚物[5]。它既可以替代石化塑料制作生产与生活用品，又可以作为医用材料（如心脏瓣膜、人造血管、缝合线、药物缓释与软组织修复）[6]，还是医学组织工程中克隆器官的优良支架材料。笔者以苜蓿含羞草根瘤菌以及根际土壤菌为研究材料，通过革兰氏染色、苏丹黑染色，筛选得到一株菌为227。
1材料与方法
1.1菌株
1.1.1菌种来源。海南、广东、广西、福建自含羞草分离的根瘤菌株，云南禄丰南苜蓿根瘤菌及获得的根瘤内生菌。
1.1.2培养基与试剂。YMA培养基组成为：KH2PO4 0.25 g，K2HPO4 0.25 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，甘露醇10 g，酵母粉0.8 g，琼脂15～18 g，pH 6.5～7.0。种子培养基组成为：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2。发酵培养基组成为：葡萄糖30 g，（NH4）2SO4 3 g，KH2PO4·12H2O 0.61 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 0.3 g，酵母粉1 g，HBO3 5 g/L，Na2MoO4 5 g/L 4 ml，pH 7.0[7]。PHB标准品由中国农业大学提供。称取3 g苏丹黑B颗粒（西德serva进口分装），溶到100 ml浓度70%的乙醇中[8]，得苏丹黑B染液。
1.2方法
1.2.1活化菌株。将保存的甘油管菌株活化到YMA固体培养基，平板倒置28 ℃培养1～2 d。
1.2.2初筛。将菌株活化后重新编号1～2 000，转接到YMA固体培养基的培养皿中，于28 ℃培养24～48 h后进行革兰氏染色。
1.2.3复筛。采用苏丹黑染色法将少许细菌热固定于载玻片上后，用3 g/L苏丹黑乙醇溶液染色10～15 min，二甲苯浸泡脱色，再用5 g/L番红水溶液复染，置油镜下观察，PHB颗粒呈蓝黑色，菌体呈红色[8]。
1.2.4PHA的提取。从试管中取一环菌接种到10 ml发酵管中，培养20 h。发酵培养基的装液量为76 ml，取培养好的种子培养液4 ml，接种量为5%，培养40 h。将发酵液以8 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗涤、离心，然后冰冻备用。 将离心获得的湿菌体悬浮于45 ml 蒸馏水中，加入浓度10%NaClO 溶液5 ml、浓度10% SDS 5 ml，使其总体积为50 ml，在35 ℃的恒温水浴中搅拌处理10 min。将处理后的菌液8 000 r/min 离心10 min，所获得的沉淀用蒸馏水和丙酮各洗涤1次，烘干，按照10 ml 氯仿/0.2 g干菌体的比例加入氯仿，抽提，过滤，滤液蒸发，除去氯仿，以析出PHB。将析出的PHB 再分别用丙酮和乙醇洗涤1次，在60～70 ℃的条件下烘干，得到白色粉末或薄膜状PHB[9]。
1.2.5筛选菌株的确定。
1.2.5.1GUTC法提DNA。用浓度0.9%生理盐水收集TY斜面上的菌，每个斜面取1 ml生理盐水冲洗菌体，加入到EP管，12 000 r/min离心2 min，离心洗涤3次，弃上清液，加入600 μl GUTC缓冲液振荡、摇匀，室温放置15 min，12 000 r/min 2 min，弃上清液，加入60 μl硅藻土悬液振荡，室温放置15 min，12 000 r/min 2 min，弃上清液，加入500 μl GUTC缓冲液振荡、摇匀，室温放置15 min，12 000 r/min 2 min，弃上清液，加入600 μl 洗涤缓冲液离心洗涤2次，12 000 r/min 2 min，弃上清，加入600 μl浓度75%乙醇离心洗涤1次，12 000 r/min 2 min，弃上清，在超净工作台干燥沉淀物（硅藻土变白），加入50 μl TEbuffer 55～65 ℃保温5～7 min[10]，离心收集上清液至小EP管中。 1.2.5.2PCR扩增。反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30s，72 ℃延伸90 s，72 ℃8 min，30个循环。
2结果与分析
2.1初筛初筛的结果见图1。根据菌体中心未染色的面积的大小，筛得200株。
图1革兰氏染色后的菌体形态2.2复筛利用苏丹黑B染色初筛得到的菌株的结果见图2。菌体外围泛红、内部可见明显的蓝黑色颗粒的菌株可能是产生PHAs的细菌，最后筛得一株PH产生菌。
图2苏丹黑B染色结果2.3菌株227的形态特征菌株227杆状，两端钝圆，无芽孢，革兰氏阴性菌；细胞大小（0.5～0.9）μm×（1.2～3.0）μm；PHB颗粒胞内舍嗜苏丹黑B颗粒，占细胞大部分空间；菌落湿润光滑有光泽、边缘整齐。
2.4PHB的提取提取后得到PHB干品，见图3。
图3菌株227提取得到的PHB2.5227菌株16s rDNA测序结果及系统发育的分析测序结果如下：
将该序列已登陆到GeneBank，注册号为HM582870.1。将227菌株的16S rDNA序列在NCBI进行BLAST，所获得的同源序列为根瘤菌的16S rDNA序列，其中相似性最高的为伯克霍尔德属的菌株。227菌株与Burkholderia caribensis，Burkholderia hospita的同源性最高，均为98%，因此确定227菌株属于伯克霍尔德属。
3结论与讨论
（1）研究中，采用革兰氏染色，进行PHB产生菌的筛选。由于根瘤菌为革兰氏阴性菌，菌体内的酯类会呈现出中心亮点，类似芽孢状，呈不规则状。经苏丹黑B染色，结合显微镜检，选出PHB颗粒较大、生长较旺盛的菌株。该方法大大减少了筛选过程中的工作量，而且取得较好的效果。通过革兰氏染色、苏丹黑染色筛选得到的菌体更加准确。
（2）经初筛、复筛获一高产PHB菌株227，胞内积累大量的PHB颗粒，而且发酵周期短，为今后发酵条件的进一步研究提供保证。
（3）在经过生物学特征研究后，发现菌株227为伯克霍尔德属（Burkholderia）。它是根瘤菌中初次发现的产PHB的菌株。因此，该研究为PHB的产业化提供了菌株资源，具有很好的应用价值。
参考文献
[1] 于平，励建荣.真养产碱杆菌发酵生产PHB的培养条件优化[J].中国食品学报，2007，7（1）：59-63.
[2] STEINBCHEL A，VALENTIN H E.Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids[J].FEMS Microbiol Lett，1995，128：219-228.
[3] 陈国强.生物可降解材料产业现状与趋势分析[J].新材料产业，2007（12）：42-46.
[4] LEMOIGNE M，ANN.Etudes sur l'autolyse microbie acidification par formation d'acide βoxybutyrique[J].Ann Inst Pasteur，1925，39：144-173.
[5] KHANNA S，SRIVASTAVA A K.Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates[J].Process Biochemistry，2005（40）：607-619.
[6] 张岩峰，田立，宋水山.聚4羟基丁酸的微生物合成及医学应用[J].工程塑料应用，2011，39（1）：48-52.
[7] 张婵，董岳峰，王海宾，等.费氏中华根瘤菌合成羟基丁酸和羟基己酸共聚物的研究[J].微生物学杂志，2007，34（6）：1077-1081.
[8] 李市场，刘红霞，朱朝阳.低能离子注入油脂高产菌株黏红酵母（Rhodotorula glutinis）的选育[J].中国粮油学报，2011，26（8）：33-34.
[9] 许旭萍，陈接锋，谢华玲.次氯酸钠-氯仿提取球衣菌PHB的研究[J].福建师范大学学报：自然科学版，2004，20（1）：74-77.
[10] 刘晓凤.一株嗜盐产甲烷菌的分离、生物学特性、系统发育分析及产甲烷活性污泥利用CO的初步研究[D].成都：四川大学，2006：26-28.