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摘要：以4个福山包头系列大白菜品种为试材，对游离小孢子培养和植株再生过程中的一些重要因素进行了研究。结果表明，不同基因型对小孢子胚诱导率和成苗率影响较大，平均每个花蕾产胚在1.28～38.25个之间；且胚胎发生能力高的品种，成苗率较高，胚胎发生能力低的品种，成苗率也较低；培养基中添加0.1～0.3 g/L活性炭能明显提高小孢子胚诱导率；及时将成熟的子叶形胚转移至再生培养基上，对提高成苗率至关重要；琼脂浓度为1.0%～2.0%时，成苗率大大提高。
关键词：大白菜；游离小孢子；培养；活性炭
中图分类号：S634.103.6 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0013-04
AbstractThe factors affecting isolated microspore culture and plant regeneration were studied with four Chinese cabbage varieties of ‘Fushanbaotou’. The results showed that there were significant differences in embryogenesis ability of microspore and seedling rate among different genotypes. The embryo yield per bud ranged from 1.28 to 38.25. The varieties with higher embryogenesis ability had higher seedling rate， while those with lower embryogenesis ability had lower seedling rate. The addition of 0.1～0.3 g/L active charcoal could increase the induction rate of microspore-derived embryos significantly. Transferring mature cotyledonary embryos to regeneration medium in time was essential to increase plantlet regeneration rate.The solid medium with agar concentration from 1.0% to 2.0% could increase seedling rate obviously.
Key wordsChinese cabbage；Isolated microspore； Culture； Active charcoal
大白菜是原产我国的一种重要蔬菜作物，在南北方均有广泛种植[1，2]。目前生产上主要通过杂交育种获得新品种，游离小孢子培养由于其自身的优点，逐渐成为大白菜育种的重要手段之一[3～9]。自Sato等[10]首次利用大白菜小孢子获得再生植株以来，国内各科研机构也陆续对大白菜游离小孢子培养的各个影响因素进行了研究[11]，但由于受基因型和其他一些因素的影响，在小孢子胚胎诱导和再生成苗方面仍然很难形成统一的标准。
福山包头类型大白菜是优良的地方栽培品种，由于该类型大白菜在抗病毒病方面缺陷，使得种植面积逐渐下降，目前生产中使用的包头类型大白菜多为当地品种和外来品种的杂交种。为了加快遗传改良进程，缩短育种周期，对4个福山包头系列大白菜进行游离小孢子培养，对影响小孢子胚状体发生和植株再生的主要因素进行研究，以期建立起完整的培养体系，获得DH纯系。
1材料与方法
1.1试验材料
试验于2010年10月～2013年10月在中国农业大学烟台研究院进行。供试大白菜品种为‘福山包头莲’（001）、‘新烟杂3号’（002）、‘奇山秋美’（003）、‘金盛秋早’（004），由中国农业大学烟台研究院蔬菜课题组提供。供试材料于11月下旬育苗，次年2月下旬定植于试验田，3月下旬至4月下旬取花蕾进行试验。
1.2 试验方法
1.2.1游离小孢子培养大白菜植株现蕾后，于每天上午8∶00～10∶00摘取健壮植株花序，选取长度为2.0～2.5 mm的花蕾，参考付文婷等[12]的方法进行小孢子培养。
①基因型对小孢子胚胎发生的影响：取4种试材合适大小的花蕾，按平均每个培养皿4个花蕾进行游离小孢子培养。
②活性炭对小孢子胚胎发生的影响：取4种试材合适大小的花蕾，分别用添加有0、0.1、0.3、0.5、1.0、1.5 g/L活性炭的NLN-13培养基进行游离小孢子培养。
以上每个处理3皿，重复3次。
1.2.2小孢子胚再生成苗将培养21 d的子叶形胚状体接种于B5+6-BA （0.2 mg/L） +IAA （0.02 mg/L）固体培养基上（含3%的蔗糖，pH 5.8），其余参考邓英等[13]的方法。
①基因型对小孢子胚成苗的影响：将4种基因型的子叶形胚接种在琼脂浓度为1.2%的B5培养基上培养。
②胚龄对小孢子胚成苗的影响：以002为试材，分别取培养10、15、20、25、30、35、40 d的子叶形胚接种在琼脂浓度为1.2%的B5培养基上培养。
③琼脂浓度对小孢子胚成苗的影响：以002为试材，将培养21 d的子叶形胚分别转至琼脂浓度为0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和2.0%的B5培养基上培养。
以上每处理接种5瓶，每瓶接种3个胚状体，重复3次。
2 结果与分析 2.1基因型对小孢子胚胎发生的影响
由表1可以看出，供试的4个品种都获得了胚状体，但小孢子胚胎发生能力有一定差异。002产胚率最高，平均每个花蕾产胚38.25个；001最低，平均每个花蕾产胚1.28个；003与004平均每个花蕾产胚19.17和21.56个。由此可见，002、003和004胚胎发生较易，001胚胎发生较难。
3讨论
本试验对基因型和培养基添加物质在影响大白菜小孢子胚胎发生中的作用进行了研究。结果表明，基因型对小孢子产胚率影响较大，本研究中的4个大白菜品种每花蕾产胚为1.28～38.25个，高产胚率约为低产胚率的30倍，曹鸣庆[14]与马燕[15]等的研究也发现基因型是决定小孢子培养能否成功的重要因素之一。本研究除001外，其余均为杂交品种，相对复杂的遗传背景可能有利于小孢子的培养，这与牛应泽等[16]研究结果一致。
活性炭在小孢子培养中的重要作用早已被证实[17，18]。本研究显示，在NLN-13培养基中添加适宜浓度的活性炭，可明显促进大白菜小孢子胚的产生，尤其是高诱导率的品种，对活性炭的反应相对灵敏，低诱导率品种001并未表现出明显的促进作用。有学者研究认为，从培养基高温灭菌到小孢子培养过程中会产生一些有害物质，活性炭具有吸附这些有害物质的作用，从而促进了小孢子胚胎发生[6，16，19]。
本研究同样对影响子叶胚成苗的因素进行了研究。不同基因型之间成苗率差异明显，成苗率最高的是002，最低的是001，说明基因型也影响成苗率的高低。因此，对001来说，必须要大量培养才能达到所需的再生植株数量。
及时将子叶胚转移至固体培养基中培养，可有效提高成苗率。本研究显示，子叶胚再生成苗的最适胚龄为15～25 d，超过35 d后成苗率极低，这与刘凡[20]和韩阳[18]等研究结果相符。
本研究还显示，培养基中琼脂浓度超过1%时，可明显提高成苗率，这与韩阳[18]、王汉中[21]和赵冰[22]等的研究结果相符。也有学者通过在培养基表面夹垫滤纸、控制培养过程的湿度来提高成苗率[23， 24]，可见，培养基水分状况也是影响植株再生的重要因素。
参考文献：
[1]张晓东， 李利斌， 宋宜现， 等. 大白菜高效稳定遗传转化体系的建立[J]. 山东农业科学，2010（2）：1-7.
[2]李晓波， 杨翠翠， 邱念伟. 拟南芥和大白菜YABBY 蛋白家族的生物信息学分析[J]. 山东农业科学，2012，44（12）：1-6.
[3]栗根义， 高睦枪， 赵秀山， 等. 大白菜游离小孢子培养[J]. 园艺学报， 1993， 20（2）： 167-170.
[4]耿建峰， 原玉香， 张晓伟， 等. 利用游离小孢子培养技术育成早熟大白菜新品种‘豫新5号’[J]. 园艺学报， 2003， 30（2）： 249.
[5]姚秋菊， 蒋武生， 原玉香， 等. 游离小孢子培养育成早熟大白菜新品种‘豫新58号’[J]. 园艺学报， 2008， 35（6）：929.
[6]Kott L S， Polsoni L， Beversdorf W D. Cytological aspects of isolated microspore culture of Brassica napus[J]. Can. J. Bot.， 1988， 66： 1658-1664.
[7]Kott L S， Polsoni L. Autotoxicity in isolated microspore culture of Brassica napus [J]. Can. J. Bot.， 1988， 66： 1665-1670.
[8]Kott L S， Beversdorf W D. Enhanced plant regeneration from microspore-derived embryos of Brassica napus by chilling，partial desiccation and age selection [J]. Plant Cell Tissue Organ Culture， 1990， 23： 187-192.
[9]Fukuoka H， Ogawa T， Matsuoka M. Direct gene delivery into isolated microspores of rapeseed （Brassica napus L.） and the production of fertile transgenic plants [J]. Plant Cell Rep.，1998，17（5）：323-328.
[10]Sato T， Nishio T， Hirai M. Plant regeneration from isolated microspore culture of Chinese cabbage （Brassica campestris ssp. pekinensis） [J]. Plant Cell Rep.，1989，8（8）：486-488.
[11]王秀英， 巫东堂， 赵军良， 等. 大白菜游离小孢子培养研究进展[J]. 蔬菜， 2012（7）：46-49.
[12]付文婷， 张鲁刚， 胥宇建， 等. 大白菜游离小孢子胚诱导及植株再生[J]. 西北植物学报， 2010， 19（3）： 139-143.
[13]邓英， 陶莲， 李正丽， 等. 大白菜游离小孢子的培养及植株再生[J]. 贵州农业科学， 2012， 40（6）： 19-21.
[14]曹鸣庆， 李岩， 蒋淘， 等. 大白菜和小白菜游离小孢子培养试验简报[J]. 华北农学报， 1992， 7（2）： 119-120.
[15]马燕， 韩瑞超， 臧德奎， 等. 桂花幼胚的离体培养及生根诱导[J]. 山东农业科学， 2013， 45（3）： 7-10.
[16]牛应泽， 刘玉贞， 郭世星. 提高甘蓝型油菜游离小孢子产胚率的研究[J]. 西南农业学报， 2002， 15（1）： 24-27.
[17]徐艳辉， 冯辉， 张凯. 大白菜游离小孢子培养中若干因素对胚状体诱导和植株再生影响[J]. 北方园艺， 2001（3）：6-8.
[18]韩阳， 叶雪凌， 冯辉. 提高大白菜小孢子植株获得率的研究[J]. 园艺学报， 2005， 32（6）： 1092-1094.
[19]孙丹， 王涛涛， 叶志彪， 等. 基因型和活性炭对大白菜小孢子胚胎发生的影响[J]. 湖北农业科学，2005（6）：73-75.
[20]刘凡， 李岩， 姚磊， 等. 培养基水分状况对大白菜小孢子胚成苗的影响[J]. 农业生物技术学报， 1997， 5（2）： 131- 136.
[21]王汉中， 王新发， 刘贵华， 等. 甘蓝型杂交油菜亲本的小孢子培养技术研究[J]. 中国油料作物学报， 2004， 26（1）： 1-4.
[22]赵冰， 闻凤英， 王玉龙， 等. 青麻叶大白菜小孢子培养及新品种选育[J]. 华北农学报， 2005， 20（2）： 26-29.
[23]陈军， 陈正华， 刘澄清， 等. 甘蓝型油菜离体小孢子培养的胚胎发生[J]. 遗传学报， 1995， 22（4）： 307-315.
[24]申书兴， 赵前程， 刘世雄， 等. 四倍体大白菜小孢子植株的获得与倍性鉴定[J]. 园艺学报， 1999， 26（4）： 232-237.
关键词：大白菜；游离小孢子；培养；活性炭
中图分类号：S634.103.6 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0013-04
AbstractThe factors affecting isolated microspore culture and plant regeneration were studied with four Chinese cabbage varieties of ‘Fushanbaotou’. The results showed that there were significant differences in embryogenesis ability of microspore and seedling rate among different genotypes. The embryo yield per bud ranged from 1.28 to 38.25. The varieties with higher embryogenesis ability had higher seedling rate， while those with lower embryogenesis ability had lower seedling rate. The addition of 0.1～0.3 g/L active charcoal could increase the induction rate of microspore-derived embryos significantly. Transferring mature cotyledonary embryos to regeneration medium in time was essential to increase plantlet regeneration rate.The solid medium with agar concentration from 1.0% to 2.0% could increase seedling rate obviously.
Key wordsChinese cabbage；Isolated microspore； Culture； Active charcoal
大白菜是原产我国的一种重要蔬菜作物，在南北方均有广泛种植[1，2]。目前生产上主要通过杂交育种获得新品种，游离小孢子培养由于其自身的优点，逐渐成为大白菜育种的重要手段之一[3～9]。自Sato等[10]首次利用大白菜小孢子获得再生植株以来，国内各科研机构也陆续对大白菜游离小孢子培养的各个影响因素进行了研究[11]，但由于受基因型和其他一些因素的影响，在小孢子胚胎诱导和再生成苗方面仍然很难形成统一的标准。
福山包头类型大白菜是优良的地方栽培品种，由于该类型大白菜在抗病毒病方面缺陷，使得种植面积逐渐下降，目前生产中使用的包头类型大白菜多为当地品种和外来品种的杂交种。为了加快遗传改良进程，缩短育种周期，对4个福山包头系列大白菜进行游离小孢子培养，对影响小孢子胚状体发生和植株再生的主要因素进行研究，以期建立起完整的培养体系，获得DH纯系。
1材料与方法
1.1试验材料
试验于2010年10月～2013年10月在中国农业大学烟台研究院进行。供试大白菜品种为‘福山包头莲’（001）、‘新烟杂3号’（002）、‘奇山秋美’（003）、‘金盛秋早’（004），由中国农业大学烟台研究院蔬菜课题组提供。供试材料于11月下旬育苗，次年2月下旬定植于试验田，3月下旬至4月下旬取花蕾进行试验。
1.2 试验方法
1.2.1游离小孢子培养大白菜植株现蕾后，于每天上午8∶00～10∶00摘取健壮植株花序，选取长度为2.0～2.5 mm的花蕾，参考付文婷等[12]的方法进行小孢子培养。
①基因型对小孢子胚胎发生的影响：取4种试材合适大小的花蕾，按平均每个培养皿4个花蕾进行游离小孢子培养。
②活性炭对小孢子胚胎发生的影响：取4种试材合适大小的花蕾，分别用添加有0、0.1、0.3、0.5、1.0、1.5 g/L活性炭的NLN-13培养基进行游离小孢子培养。
以上每个处理3皿，重复3次。
1.2.2小孢子胚再生成苗将培养21 d的子叶形胚状体接种于B5+6-BA （0.2 mg/L） +IAA （0.02 mg/L）固体培养基上（含3%的蔗糖，pH 5.8），其余参考邓英等[13]的方法。
①基因型对小孢子胚成苗的影响：将4种基因型的子叶形胚接种在琼脂浓度为1.2%的B5培养基上培养。
②胚龄对小孢子胚成苗的影响：以002为试材，分别取培养10、15、20、25、30、35、40 d的子叶形胚接种在琼脂浓度为1.2%的B5培养基上培养。
③琼脂浓度对小孢子胚成苗的影响：以002为试材，将培养21 d的子叶形胚分别转至琼脂浓度为0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和2.0%的B5培养基上培养。
以上每处理接种5瓶，每瓶接种3个胚状体，重复3次。
2 结果与分析 2.1基因型对小孢子胚胎发生的影响
由表1可以看出，供试的4个品种都获得了胚状体，但小孢子胚胎发生能力有一定差异。002产胚率最高，平均每个花蕾产胚38.25个；001最低，平均每个花蕾产胚1.28个；003与004平均每个花蕾产胚19.17和21.56个。由此可见，002、003和004胚胎发生较易，001胚胎发生较难。
3讨论
本试验对基因型和培养基添加物质在影响大白菜小孢子胚胎发生中的作用进行了研究。结果表明，基因型对小孢子产胚率影响较大，本研究中的4个大白菜品种每花蕾产胚为1.28～38.25个，高产胚率约为低产胚率的30倍，曹鸣庆[14]与马燕[15]等的研究也发现基因型是决定小孢子培养能否成功的重要因素之一。本研究除001外，其余均为杂交品种，相对复杂的遗传背景可能有利于小孢子的培养，这与牛应泽等[16]研究结果一致。
活性炭在小孢子培养中的重要作用早已被证实[17，18]。本研究显示，在NLN-13培养基中添加适宜浓度的活性炭，可明显促进大白菜小孢子胚的产生，尤其是高诱导率的品种，对活性炭的反应相对灵敏，低诱导率品种001并未表现出明显的促进作用。有学者研究认为，从培养基高温灭菌到小孢子培养过程中会产生一些有害物质，活性炭具有吸附这些有害物质的作用，从而促进了小孢子胚胎发生[6，16，19]。
本研究同样对影响子叶胚成苗的因素进行了研究。不同基因型之间成苗率差异明显，成苗率最高的是002，最低的是001，说明基因型也影响成苗率的高低。因此，对001来说，必须要大量培养才能达到所需的再生植株数量。
及时将子叶胚转移至固体培养基中培养，可有效提高成苗率。本研究显示，子叶胚再生成苗的最适胚龄为15～25 d，超过35 d后成苗率极低，这与刘凡[20]和韩阳[18]等研究结果相符。
本研究还显示，培养基中琼脂浓度超过1%时，可明显提高成苗率，这与韩阳[18]、王汉中[21]和赵冰[22]等的研究结果相符。也有学者通过在培养基表面夹垫滤纸、控制培养过程的湿度来提高成苗率[23， 24]，可见，培养基水分状况也是影响植株再生的重要因素。
参考文献：
[1]张晓东， 李利斌， 宋宜现， 等. 大白菜高效稳定遗传转化体系的建立[J]. 山东农业科学，2010（2）：1-7.
[2]李晓波， 杨翠翠， 邱念伟. 拟南芥和大白菜YABBY 蛋白家族的生物信息学分析[J]. 山东农业科学，2012，44（12）：1-6.
[3]栗根义， 高睦枪， 赵秀山， 等. 大白菜游离小孢子培养[J]. 园艺学报， 1993， 20（2）： 167-170.
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[5]姚秋菊， 蒋武生， 原玉香， 等. 游离小孢子培养育成早熟大白菜新品种‘豫新58号’[J]. 园艺学报， 2008， 35（6）：929.
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[8]Kott L S， Beversdorf W D. Enhanced plant regeneration from microspore-derived embryos of Brassica napus by chilling，partial desiccation and age selection [J]. Plant Cell Tissue Organ Culture， 1990， 23： 187-192.
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[10]Sato T， Nishio T， Hirai M. Plant regeneration from isolated microspore culture of Chinese cabbage （Brassica campestris ssp. pekinensis） [J]. Plant Cell Rep.，1989，8（8）：486-488.
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[18]韩阳， 叶雪凌， 冯辉. 提高大白菜小孢子植株获得率的研究[J]. 园艺学报， 2005， 32（6）： 1092-1094.
[19]孙丹， 王涛涛， 叶志彪， 等. 基因型和活性炭对大白菜小孢子胚胎发生的影响[J]. 湖北农业科学，2005（6）：73-75.
[20]刘凡， 李岩， 姚磊， 等. 培养基水分状况对大白菜小孢子胚成苗的影响[J]. 农业生物技术学报， 1997， 5（2）： 131- 136.
[21]王汉中， 王新发， 刘贵华， 等. 甘蓝型杂交油菜亲本的小孢子培养技术研究[J]. 中国油料作物学报， 2004， 26（1）： 1-4.
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[23]陈军， 陈正华， 刘澄清， 等. 甘蓝型油菜离体小孢子培养的胚胎发生[J]. 遗传学报， 1995， 22（4）： 307-315.
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