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【摘要】 目的：研究口腔黏膜白斑及口腔鳞状细胞癌组织中APC的表达情况并分析其与临床病理特征的关系。方法：采用免疫组织化学方法检测10例正常口腔组织，20例口腔黏膜白斑，45例口腔鳞癌组织标本中APC的表达。结果：口腔正常黏膜组APC染色阳性率为90.0%，口腔白斑组APC染色阳性率为60.0%，口腔鳞癌组APC染色阳性率为24.4%。口腔正常组织与口腔鳞癌组间染色阳性率有明显统计学差异（P≤0.05），口腔白斑组与口腔鳞癌组间染色阳性率有明显统计学差异（P≤0.05），而口腔白斑组与口腔正常组织组间染色阳性率无明显统计学差异（P=0.205）。APC的表达水平与肿瘤病理分级关系密切（P=0.012），在高分化的口腔鳞状细胞癌中的表达明显高于中、低分化的口腔鳞状细胞癌，与患者的年龄（P=1.00）、性别（P=0.734）、肿瘤的T分期（P=0.902）及是否有颈淋巴结转移（P=0.419）无明显相关性。结论：APC与口腔鳞状细胞癌的发生密切相关，可作为口腔鳞癌发生和预后的检测指标。
关键词：口腔黏膜白斑，口腔鳞状细胞癌，APC，免疫组化
口腔白斑病（oral leukoplakia， OLK）是一种常见的口腔黏膜病，严重时会引起癌变，癌变率从0.11%到31.4%[1，2]不等，存在明显的种族、地区差异。口腔白斑在我国的患病率为3.13%[3]，口腔鳞癌的人群中有17%～35%[2]由该病发展而来。鳞状细胞癌是最常见的发生于口腔黏膜的恶性肿瘤， 占该部位恶性肿瘤的90%以上[4]。口腔鳞癌的发生是多因素作用的结果，而信号因子介导的传导途径异常或活化是它发生、发展的一个重要因素。抑癌基因APC（adenomatous polyposis coli）作为Wnt信号通路β-catenin降解复合体的重要组份，是近几年发现的与肿瘤发生关系密切的重要信号分子[5]。为了解APC在口腔白斑及口腔鳞状细胞癌发生、发展中的作用，本研究检测了口腔正常黏膜、口腔黏膜白斑及口腔鳞状细胞癌组织中APC蛋白的表达情况，并分析其与临床病理特征的关系。
1 资料与方法
1.1 病例来源和筛选
病例来源于郑州大学第一附属医院口腔黏膜科及口腔颌面外科2010年5月到2012年5月活检或术后标本。其中，口腔正常黏膜10例，白斑20例，鳞癌45例，共计75例。口腔鳞状细胞癌病例选择遵循以下标准： 首次接受手术治疗的病例，组织病理学诊断明确，无其它口腔恶性肿瘤病史，术前无放化疗史。其中男33例，女12例；年龄43～75岁；T分级：T1 17例， T2 13例， T3 9例， T4 6例；有淋巴结转移14例， 无淋巴结转移31例；病理学分级： 高分化20例，中、低分化25例。口腔白斑的纳入标准：口腔黏膜上的白色斑块状损害，不能被擦去，也不能被定义为其他任何损害，结合病理诊断符合口腔黏膜白斑。正常对照组取自非肿瘤性活检标本中正常口腔黏膜上皮。
1.2 试剂与方法
兔多克隆APC抗体购自美国 SANTA CRUZ公司， 免疫组织化学染色试剂盒（SP-9000）和DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。所有标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4um连续切片。采用免疫组织化学SP法，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定
APC蛋白定位于细胞浆，阳性染色者胞浆呈棕黄色。高倍镜下随机选取5个视野， 每个视野计数200个细胞。染色判定标准采用半定量分析法[3]，按细胞染色有无及深浅评分： 无染色为0分， 浅黄色为1分， 棕黄色为2分， 棕褐色为3分；按阳性细胞百分率评分： 阳性细胞百分率<5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，75%～100%为4分。结果取2项评分之积，≤4分为阴性，>4分为阳性。
1.4 统计学处理
采用SPSS 16.0软件行X2检验，检验水准α=0.05。
2.结果
2.1 APC在各组中的表达
正常组织中APC主要表达在口腔黏膜上皮的角化层细胞的胞浆中，较均匀，其表达程度为弱到中度，越靠近上皮表层表达越强，而在棘层、颗粒层及基底层低表达或无表达。10例正常组织中APC阳性表达9例，阴性表达1例，阳性表达率90.0%。在口腔黏膜白斑APC表达增强，分布范围扩大，在增生全层可见细胞浆中中等程度表达，较均匀。本组20例口腔黏膜白斑组中APC阳性表达12例，阴性表达8例，阳性表达率为60.0%。口腔鳞状细胞癌组织中APC表达在肿瘤细胞的胞浆中，部分肿瘤细胞浆中分布不均匀，在中、高分化的癌巢靠近周边细胞表达相对少，且分化程度越差，APC表达相对越少。我们研究的45例口腔鳞状细胞癌组中APC阳性表达11例，阴性34例，阳性率为24.4%。统计学分析表明，APC在口腔正常组织中与口腔鳞状癌组织中的表达有明显统计学差异（P≤0.05），在口腔黏膜白斑中与口腔鳞状细胞癌组织中的表达有明显统计学差异（P≤0.05），而APC在口腔正常组织中与口腔黏膜白斑中的表达无明显差异（P=0.205）。
2.2 APC在口腔鳞状细胞癌中表达水平与临床病理资料关系
APC的表达水平与肿瘤病理分级关系密切（P=0.012），在高分化的口腔鳞状细胞癌中的表达明显高于中、低分化的口腔鳞状细胞癌。与患者的年龄（P=1.00）、性别（P=0.734）方面无明显相关性。同时与肿瘤所处于的T分期（P=0.902）及是否有颈淋巴结转移（P=O.419）也无明显的相关性。
3 讨论
口腔鳞癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，占口腔癌的首位，临床存在早期诊断率低、治愈率低、预后差等问题。APC基因是一个抑癌基因，发现于1991年，定位于5Q21，在上皮来源的恶性肿瘤如结肠癌、食管癌、胃癌中存在不同程度的缺失，且缺失发生于癌变的早期[6]。研究表明[7]， APC基因的缺失极可能参与了口腔鳞癌的发生，应用PCR- RFLP技术分析，发现口腔鳞癌中APC基因的杂合缺失频率达29%。Wnt途径是引起肿瘤的重要途径之一，其不正确活化在许多肿瘤或癌症中都可见到，其中APC参与的β-catenin的浓度调控，被认为是Wnt途径的枢纽。APC基因直接参与Wnt信号传导途径，与Axin、Gsk-3β形成复合物，保证Wnt信号途径对细胞特化、增殖、极性以及迁移的正常调节。在正常生理状态下，Wnt通路处于关闭状态，当APC突变或缺失导致Wnt通路被激活则可引起β-catenin在胞浆内聚集并转运至核内，与转录因子TEF/LEF结合调节靶基因如c-myc、cyclind、CD44等癌基因的转录，最终导致肿瘤发生。本次研究结果显示抑癌基因APC在口腔鳞状细胞癌中的表达水平明显低于口腔正常组织，同时还发现APC的表达与肿瘤病理分级关系密切，在高分化口腔鳞癌中表达明显高于中、低分化的口腔鳞癌。通过统计学处理还发现，APC的表达水平与患者年龄（P=1.00）、性别（P=0.734）及肿瘤所处的T分期（P=0.902）、有无淋巴结转移（P=0.419）均无明显的相关性。Martayan等研究报道[8]，APC的表达与肿瘤分级、复发、转移等临床因素无关。APC基因在西方人群口腔鳞状细胞癌中发生突变并不常见，但在台湾人群中APC 基因杂合性缺失的比例较高，可能存在种族差异性。 口腔黏膜白斑是指发生在黏膜表面的白色斑块，不能被擦掉，也不能诊断为其它任何疾病者。流行病学研究表明口腔黏膜白斑发病与吸烟、过量饮酒、嚼槟榔等密切相关。黏膜白斑是口腔最常见的癌前病变，可发展为鳞状细胞癌。大量研究表明癌前病变与癌的分子遗传改变是一致的，只是程度和量上有所不同，有些癌前病变虽组织形态上尚未出现癌的表现，但分子遗传特征上已与癌相似。目前尚未有APC在口腔黏膜白斑表达的报道，我们研究中所选取的20例口腔黏膜白斑病例，阳性表达率为60.0%，与口腔正常组织组间染色阳性率无明显统计学差异，而与口腔鳞状细胞癌组间染色阳性率有明显差异，提示APC可以作为检测癌前病变向癌症发生转变的重要指标。由于本研究例数较少，仍需要进一步的探索。
总之，本研究证实APC在口腔鳞癌的发生、发展中起重要作用，与病理学分级密切相关，提示APC蛋白可作为口腔鳞状细胞癌发生和预后的检测指标。
参考文献
[1]Lee JJ， Hung HC， Cheng SJ， et al. Carcinoma and dysplasia in oral leukoplakias in Taiwan： prevalence and risk factors [J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 2006，101（4）：472-480.
[2]Lodi G， Sardella A， Bez C， et al. Systematic review of randomized trials for the treatment of oral leukoplakia [J]. J Dent Educ， 2002，66（8）：896-902.
[3]方祥忠.我国部分地区134492人中口腔黏膜白斑病流行病学调查报告[J]. 临床口腔医学杂志，1986，2（1）：1-5.
[4]Verbin R.S.， Bouquot J.E. Cancer of the oral cavity and oropharynx.In： L.Barnes（ed）.Surgical pathology of the head and neck， PP：333～401.M. Dckker，New York（1993）.
[5]Hsieh A， Kim HS， Lim SO，et al.Hepatitis B viral X protein interacts with tumor suppressor adenomatous polyposis coli to activate Wnt/β-catenin signaling[J].Cancer Lett，2011，300（2）：162-172..
[6]Tamura G， Maesawa C， Suzuki Y， et al. Primary gastric carcinoma cells frequently loss heterozygosity at the APC and MCC genetic loci[J]. Jpn J Cancer Res， 1993， 84（10）：1015-1018.
[7]Chang KW，Lin SC， Mangold KA， et al. Alterations of adenomatous polyposis Coli （APC） gene in oral squamous cell carcinoma[J] . Int J Oral Maxillofac Surg， 2000， 29（3）： 223- 226.
[8]Martayan A，Sanchez-Mete L，Baldelli R，et al.Gene variants associated to malignant thyroid disease in familial adenomatous polyposis：a novel APC germline mutation[J]. Endocrinol Invest，2010，33（9）：603-606.
关键词：口腔黏膜白斑，口腔鳞状细胞癌，APC，免疫组化
口腔白斑病（oral leukoplakia， OLK）是一种常见的口腔黏膜病，严重时会引起癌变，癌变率从0.11%到31.4%[1，2]不等，存在明显的种族、地区差异。口腔白斑在我国的患病率为3.13%[3]，口腔鳞癌的人群中有17%～35%[2]由该病发展而来。鳞状细胞癌是最常见的发生于口腔黏膜的恶性肿瘤， 占该部位恶性肿瘤的90%以上[4]。口腔鳞癌的发生是多因素作用的结果，而信号因子介导的传导途径异常或活化是它发生、发展的一个重要因素。抑癌基因APC（adenomatous polyposis coli）作为Wnt信号通路β-catenin降解复合体的重要组份，是近几年发现的与肿瘤发生关系密切的重要信号分子[5]。为了解APC在口腔白斑及口腔鳞状细胞癌发生、发展中的作用，本研究检测了口腔正常黏膜、口腔黏膜白斑及口腔鳞状细胞癌组织中APC蛋白的表达情况，并分析其与临床病理特征的关系。
1 资料与方法
1.1 病例来源和筛选
病例来源于郑州大学第一附属医院口腔黏膜科及口腔颌面外科2010年5月到2012年5月活检或术后标本。其中，口腔正常黏膜10例，白斑20例，鳞癌45例，共计75例。口腔鳞状细胞癌病例选择遵循以下标准： 首次接受手术治疗的病例，组织病理学诊断明确，无其它口腔恶性肿瘤病史，术前无放化疗史。其中男33例，女12例；年龄43～75岁；T分级：T1 17例， T2 13例， T3 9例， T4 6例；有淋巴结转移14例， 无淋巴结转移31例；病理学分级： 高分化20例，中、低分化25例。口腔白斑的纳入标准：口腔黏膜上的白色斑块状损害，不能被擦去，也不能被定义为其他任何损害，结合病理诊断符合口腔黏膜白斑。正常对照组取自非肿瘤性活检标本中正常口腔黏膜上皮。
1.2 试剂与方法
兔多克隆APC抗体购自美国 SANTA CRUZ公司， 免疫组织化学染色试剂盒（SP-9000）和DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。所有标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4um连续切片。采用免疫组织化学SP法，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定
APC蛋白定位于细胞浆，阳性染色者胞浆呈棕黄色。高倍镜下随机选取5个视野， 每个视野计数200个细胞。染色判定标准采用半定量分析法[3]，按细胞染色有无及深浅评分： 无染色为0分， 浅黄色为1分， 棕黄色为2分， 棕褐色为3分；按阳性细胞百分率评分： 阳性细胞百分率<5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，75%～100%为4分。结果取2项评分之积，≤4分为阴性，>4分为阳性。
1.4 统计学处理
采用SPSS 16.0软件行X2检验，检验水准α=0.05。
2.结果
2.1 APC在各组中的表达
正常组织中APC主要表达在口腔黏膜上皮的角化层细胞的胞浆中，较均匀，其表达程度为弱到中度，越靠近上皮表层表达越强，而在棘层、颗粒层及基底层低表达或无表达。10例正常组织中APC阳性表达9例，阴性表达1例，阳性表达率90.0%。在口腔黏膜白斑APC表达增强，分布范围扩大，在增生全层可见细胞浆中中等程度表达，较均匀。本组20例口腔黏膜白斑组中APC阳性表达12例，阴性表达8例，阳性表达率为60.0%。口腔鳞状细胞癌组织中APC表达在肿瘤细胞的胞浆中，部分肿瘤细胞浆中分布不均匀，在中、高分化的癌巢靠近周边细胞表达相对少，且分化程度越差，APC表达相对越少。我们研究的45例口腔鳞状细胞癌组中APC阳性表达11例，阴性34例，阳性率为24.4%。统计学分析表明，APC在口腔正常组织中与口腔鳞状癌组织中的表达有明显统计学差异（P≤0.05），在口腔黏膜白斑中与口腔鳞状细胞癌组织中的表达有明显统计学差异（P≤0.05），而APC在口腔正常组织中与口腔黏膜白斑中的表达无明显差异（P=0.205）。
2.2 APC在口腔鳞状细胞癌中表达水平与临床病理资料关系
APC的表达水平与肿瘤病理分级关系密切（P=0.012），在高分化的口腔鳞状细胞癌中的表达明显高于中、低分化的口腔鳞状细胞癌。与患者的年龄（P=1.00）、性别（P=0.734）方面无明显相关性。同时与肿瘤所处于的T分期（P=0.902）及是否有颈淋巴结转移（P=O.419）也无明显的相关性。
3 讨论
口腔鳞癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，占口腔癌的首位，临床存在早期诊断率低、治愈率低、预后差等问题。APC基因是一个抑癌基因，发现于1991年，定位于5Q21，在上皮来源的恶性肿瘤如结肠癌、食管癌、胃癌中存在不同程度的缺失，且缺失发生于癌变的早期[6]。研究表明[7]， APC基因的缺失极可能参与了口腔鳞癌的发生，应用PCR- RFLP技术分析，发现口腔鳞癌中APC基因的杂合缺失频率达29%。Wnt途径是引起肿瘤的重要途径之一，其不正确活化在许多肿瘤或癌症中都可见到，其中APC参与的β-catenin的浓度调控，被认为是Wnt途径的枢纽。APC基因直接参与Wnt信号传导途径，与Axin、Gsk-3β形成复合物，保证Wnt信号途径对细胞特化、增殖、极性以及迁移的正常调节。在正常生理状态下，Wnt通路处于关闭状态，当APC突变或缺失导致Wnt通路被激活则可引起β-catenin在胞浆内聚集并转运至核内，与转录因子TEF/LEF结合调节靶基因如c-myc、cyclind、CD44等癌基因的转录，最终导致肿瘤发生。本次研究结果显示抑癌基因APC在口腔鳞状细胞癌中的表达水平明显低于口腔正常组织，同时还发现APC的表达与肿瘤病理分级关系密切，在高分化口腔鳞癌中表达明显高于中、低分化的口腔鳞癌。通过统计学处理还发现，APC的表达水平与患者年龄（P=1.00）、性别（P=0.734）及肿瘤所处的T分期（P=0.902）、有无淋巴结转移（P=0.419）均无明显的相关性。Martayan等研究报道[8]，APC的表达与肿瘤分级、复发、转移等临床因素无关。APC基因在西方人群口腔鳞状细胞癌中发生突变并不常见，但在台湾人群中APC 基因杂合性缺失的比例较高，可能存在种族差异性。 口腔黏膜白斑是指发生在黏膜表面的白色斑块，不能被擦掉，也不能诊断为其它任何疾病者。流行病学研究表明口腔黏膜白斑发病与吸烟、过量饮酒、嚼槟榔等密切相关。黏膜白斑是口腔最常见的癌前病变，可发展为鳞状细胞癌。大量研究表明癌前病变与癌的分子遗传改变是一致的，只是程度和量上有所不同，有些癌前病变虽组织形态上尚未出现癌的表现，但分子遗传特征上已与癌相似。目前尚未有APC在口腔黏膜白斑表达的报道，我们研究中所选取的20例口腔黏膜白斑病例，阳性表达率为60.0%，与口腔正常组织组间染色阳性率无明显统计学差异，而与口腔鳞状细胞癌组间染色阳性率有明显差异，提示APC可以作为检测癌前病变向癌症发生转变的重要指标。由于本研究例数较少，仍需要进一步的探索。
总之，本研究证实APC在口腔鳞癌的发生、发展中起重要作用，与病理学分级密切相关，提示APC蛋白可作为口腔鳞状细胞癌发生和预后的检测指标。
参考文献
[1]Lee JJ， Hung HC， Cheng SJ， et al. Carcinoma and dysplasia in oral leukoplakias in Taiwan： prevalence and risk factors [J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 2006，101（4）：472-480.
[2]Lodi G， Sardella A， Bez C， et al. Systematic review of randomized trials for the treatment of oral leukoplakia [J]. J Dent Educ， 2002，66（8）：896-902.
[3]方祥忠.我国部分地区134492人中口腔黏膜白斑病流行病学调查报告[J]. 临床口腔医学杂志，1986，2（1）：1-5.
[4]Verbin R.S.， Bouquot J.E. Cancer of the oral cavity and oropharynx.In： L.Barnes（ed）.Surgical pathology of the head and neck， PP：333～401.M. Dckker，New York（1993）.
[5]Hsieh A， Kim HS， Lim SO，et al.Hepatitis B viral X protein interacts with tumor suppressor adenomatous polyposis coli to activate Wnt/β-catenin signaling[J].Cancer Lett，2011，300（2）：162-172..
[6]Tamura G， Maesawa C， Suzuki Y， et al. Primary gastric carcinoma cells frequently loss heterozygosity at the APC and MCC genetic loci[J]. Jpn J Cancer Res， 1993， 84（10）：1015-1018.
[7]Chang KW，Lin SC， Mangold KA， et al. Alterations of adenomatous polyposis Coli （APC） gene in oral squamous cell carcinoma[J] . Int J Oral Maxillofac Surg， 2000， 29（3）： 223- 226.
[8]Martayan A，Sanchez-Mete L，Baldelli R，et al.Gene variants associated to malignant thyroid disease in familial adenomatous polyposis：a novel APC germline mutation[J]. Endocrinol Invest，2010，33（9）：603-606.