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【摘要】目的：研究乙肝病毒感染者血清免疫标志物，利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测其含量结果与ELISA法结果的符合程度，灵敏度及其特异性作比较分折，并了解TRFIA法测定乙肝两对半的准确性，灵敏度及其临床应用价值。方法：分别用TRFIA法和ELISA法测定乙肝病毒感染者血清标本乙肝两对半(HBV-M)结果及含量。结果：分别用TRFIA法试剂和ELISA法试剂对乙型肝炎患者血清标本中HBsAg检测TRFIA法灵敏度高于ELISA法，360例乙型肝炎患者血清中有10例标本ELISA法检测结果阴性，而用TRFIA法可以检测到。另外，对ELISA法检测HBsAg弱阳性的标本，TRFIA法检测结果为阳性，且HBsAg的浓度处在一个较低的范围内(0.5-10ng/ml之间)，两法符合率为97%；对抗-HBs的检溅，ELISA 有20例阳性，而用TRFIA法检测有28例阳性，两法符合率为98%；对HBeAg的检测，ELISA法检测31例阴性，而用TRFIA法检测均为阳性，两法符合率为91%；对抗-HB(e)的检测有44例ELISA法结果阴性，而用TRFIA法检测结果均为阳性，两法符合率为88%；对抗-HBc的检测有52例ELISA法检测结果阴性的患者，而用TRFIA法检测结果均为阳性，两法符合为86%。结论：TRFIA法与ELISA法比较，TRFIA法灵敏度明显高于ELISA法，对于一些弱阳性标本ELISA法检测不到时，TRFIA法仍可以检出。TRFIA法定量检测乙肝两对半，灵敏度高，特异性强，能够及时敏感的反应病毒在体内的感染状况，同时也为临床作为疗效观察的的指标之一。
【关键词】乙肝两对半时间分辨免疫分析技术 酶联免疫吸附试验 乙型肝炎
Time-resolved fluorescence immunoassay technology in hepatitis B two pairs of semi-quantitative detection of clinical significance，as well as enzyme-linked immunosorbent assay method and the time-resolved comparative analysis
Xu Jie Duan Zhenjun Tian Pengfei
【Abstract】Objective：To study the hepatitis B virus immune serum markers，using time-resolved fluorescence Optical immunoassay technology (TRFIA) of its content with the results of the ELISA method with the results The degree to compare the sensitivity and specificity of the pack，and learn TRFIA Determination of hepatitis B 2 Half of the accuracy，sensitivity and its clinical value. Methods：use TRFIA law and ELISA Determination of serum hepatitis B virus infection were two pairs of semi-hepatitis B (HBV-M) results and content. Results：The reagents were used TRFIA law and ELISA reagents with the hepatitis B Serum samples sensitivity of HBsAg testing TRFIA than ELISA，360 cases of B In the serum of patients with hepatitis there were 10 cases detected by ELISA results were negative，and with TRFIA Law can be detected. In addition，the ELISA for detection of HBsAg weakly positive samples TRFIA Detection positive results，and the concentration of HBsAg in a lower range (0.5-10ng/ml between)，the two laws are consistent with the rate of 97 per cent；confrontation - HBs the seizure splash，ELISA Act 20 were positive，and with TRFIA detected 28 positive cases，the two laws are consistent with the rate of 98 per cent Detection of cases of HBeAg，ELISA Splashing seized 31 cases negative，and were detected by TRFIA Positive，the two laws are consistent with the rate of 91 per cent；confrontation - HB (e) of 44 cases detected by ELISA Negative results，and with TRFIA law were positive test results，the two laws are consistent with the rate of 88 per cent；Confrontation - HBc the detection of 52 cases detected by ELISA in patients with negative results，and use TRFIA of test results were positive，two laws to comply with 86%. Conclusion：The Law and TRFIA ELISA method，the sensitivity was significantly higher than that of TRFIA ELISA method，for some weak positive samples could not be detected by ELISA，TRFIA law can still be detected. TRFIA statutory volume Two pairs of semi-detection of hepatitis B，high sensitivity，specificity，sensitivity to the timely response to the virus The infection in the body，but also for clinical observation of the effect as one of the targets.
【Key words】hepatitis B two-time-resolved immunoassay technology enzyme-linked immunosorbent assayHepatitis B
国内临床实验室最常用的乙型肝炎病毒感染者的血清学标志物主要依靠ELISA法，而且酶联免疫法应用最广。但受方法学本身的限制，它可能作为阴阳性判断，不能判断乙肝两对半具体含量，它不能完成HBV感染的动力学观察，而TRFIA是80年代初发展起来的一项超微量免疫分析技术，由于采用了稳定的稀土元素标记和增强液的放大效应，最大限度地提高了检测地灵敏度，在特异性和稳定性及测量自动化方面显示其优越性[1]，是替代放免分析的方法之一。时间分辨荧光技术的出现，其灵敏度高，特异性强，对于乙肝两对半定量检测，能够准确及时敏感地反应患者体内的乙型肝炎病毒标志物的含量。本文采用TRFIA法对360例炎患者血清标本进行HBV-M含量检测，并与ELISA法两者进行了比较分析，现报告如下，仅供参考。
1材料与方法
1.1检测对象：血标本均来自我院2005年11月~2006年11月之间门诊及住院病人360例，无性别和年龄区别，早晨空腹抽取静脉血，及时分离血清-20℃冷冻保存待检。
1.2检测试剂：ELISA试剂盒由英科(厦门)新创有限责任公司提供，时间分辨免疫荧光测定HBV-M试剂盒由广州丰华生物工程有限公司提供。
1.3检测仪器：泰莱一I时间分辨荧光免疫分析仪，DEM-III型自动酶标洗板机，FWZ-I微量振荡器。
1.4方法：ELISA法与TRFIA法测定HBV-M，操作严格按说明书进行，同时加入相应的质控物监测。
ELISA法主要步骤有：加样，孵育，洗板，加酶或底物，显色，比色，其中抗-HBc测定按1∶30稀释。
TRFIA法主要步骤有：加样，振荡，洗板，加配好的标记物工作液，振荡，洗板，加增强液振荡后上机检测，测定过程在30分钟内进行，其中抗-HBc测定按1∶30稀释。
1.5质控物有广州丰华生物工程有限公司提供。
1.6统计学分析：采用配对X2检验。
2结果
2.1时间分辨免疫荧光分析法检测乙型肝炎标志物结果见表1(X±S)
3讨论
我国是乙型肝炎患者的大国，HBV在人体内的复制量，患者机体的免疫状态和治疗效果等，一直是医生和患者十分关注的问题。近年来人们逐渐认识到TRFIA法在乙肝两对半定量检测对乙肝临床诊断具有一定的临床意义。TRFIA法检测HBV-M与ELISA法相比其特异性和敏感性都高，特别是能够检测低浓度的HBsAg和HBeAg，减少HBe感染漏诊和误诊具有较高的价值，因HBsAg阳性是HBV感染的金标准[2]。本研究发现，在360例乙型肝炎两对半检测中，两种方法通过对比发现，TRFIA法的灵敏度明显高于ELISA法，对HBsAg弱阳性的标本，ELISA法检测不到时，TRFIA法仍可以检出，且HBsAg的浓度处在一个较低的浓度范围内(0.5~10ng/m1)。另外，研究还发现用ELISA法检测抗-HBc这一项阳性时，用TRFIA法检测HBsAg，有的也可以检测出阳性，其浓度出在一个较低的范围内。对ELISA法检测HBsAg，抗-HBc两项均阳性的患者，TRFIA法检出抗-HBe也为阳性，这可能是由于方法学不同造成的。在HBV标志物的检测中，HBeAg，抗-HBe是一对比较重要的指标。由于临床上抗病毒核酸药物的广泛应用，会发现一些患者在治疗中HBeAg浓度降低出现HBeAg，抗-HBe同时阳性或HBeAg阴转，抗-HBe阳性，当检测方法的灵敏度不够时，会漏掉一些HBV低水平复制的阳性患者。HBV标志物检测是诊断乙型肝炎的必备手段，而病毒指标检测的标准直接关系到患者的诊断，合理用药和有效治疗[3]。TRFIA是一种能定量检测HBV标志物，特异性及灵敏度较高的一种新的检测方法，它的灵敏度高于ELISA法，可以检出低水平复制的标本，避免漏检，可以解决隐源性肝炎HBV标志物的诊断难题。在抗-HBV治疗过程中常会发生HBeAg向抗-HBe血清学转化，出现HBeAg和抗-HBe同时阳性或HBeAg阴转，抗一HBe低水平阳性，对低水平复制HBeAg，抗一HBe定量分析，对临床治疗及疗效观察有参考价值[4]。
TRFIA的另一优点是它的线性范围比较宽，方便进行定量。这对观察病人的感染进展情况，对治疗有无应答可得到最直接的变化数据。对临床来说，表面抗原，表面抗体和核心抗体的定量更为重要。另外，本研究还发现，大部分ELISA法检测为HBsAg.抗-HBc阳性模式的患者其实为HBeAg假阴性及抗-HBe假阴性，仅少部分可能为病毒变异的结果。研究发现ELISA法易出现假阴性。随着仪器和试剂的国产化，检验费用的降低，TRFIA因其突出的高敏感性，特异性，无放射污染等特点，是取代放免的方法之一，在乙肝两对半定量检测中有广泛的应用前景。对临床综合评价疗效，对临床合理用药，有效治疗可提供可靠的依据，值得在临床推广。
参考文献
1Yan F，Zhou J，et al Flow injection immunoassay for carcinoembrgonic antigen combined withtime-nesolved fluorometric detection，3 lmmunol Methods，2005，305：120-127
2陈紫榕，病毒性肝炎IMI，北京：人民卫生出版社，2002，6，191
3.4罗娅、周智、刘杞.乙型肝炎病毒标志物低水平复制的检测及方法学比较[J].中华肝脏病杂志，2002，2(2)：132
作者单位：730046甘肃省兰州市第二人民医院肝病研究所
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
【关键词】乙肝两对半时间分辨免疫分析技术 酶联免疫吸附试验 乙型肝炎
Time-resolved fluorescence immunoassay technology in hepatitis B two pairs of semi-quantitative detection of clinical significance，as well as enzyme-linked immunosorbent assay method and the time-resolved comparative analysis
Xu Jie Duan Zhenjun Tian Pengfei
【Abstract】Objective：To study the hepatitis B virus immune serum markers，using time-resolved fluorescence Optical immunoassay technology (TRFIA) of its content with the results of the ELISA method with the results The degree to compare the sensitivity and specificity of the pack，and learn TRFIA Determination of hepatitis B 2 Half of the accuracy，sensitivity and its clinical value. Methods：use TRFIA law and ELISA Determination of serum hepatitis B virus infection were two pairs of semi-hepatitis B (HBV-M) results and content. Results：The reagents were used TRFIA law and ELISA reagents with the hepatitis B Serum samples sensitivity of HBsAg testing TRFIA than ELISA，360 cases of B In the serum of patients with hepatitis there were 10 cases detected by ELISA results were negative，and with TRFIA Law can be detected. In addition，the ELISA for detection of HBsAg weakly positive samples TRFIA Detection positive results，and the concentration of HBsAg in a lower range (0.5-10ng/ml between)，the two laws are consistent with the rate of 97 per cent；confrontation - HBs the seizure splash，ELISA Act 20 were positive，and with TRFIA detected 28 positive cases，the two laws are consistent with the rate of 98 per cent Detection of cases of HBeAg，ELISA Splashing seized 31 cases negative，and were detected by TRFIA Positive，the two laws are consistent with the rate of 91 per cent；confrontation - HB (e) of 44 cases detected by ELISA Negative results，and with TRFIA law were positive test results，the two laws are consistent with the rate of 88 per cent；Confrontation - HBc the detection of 52 cases detected by ELISA in patients with negative results，and use TRFIA of test results were positive，two laws to comply with 86%. Conclusion：The Law and TRFIA ELISA method，the sensitivity was significantly higher than that of TRFIA ELISA method，for some weak positive samples could not be detected by ELISA，TRFIA law can still be detected. TRFIA statutory volume Two pairs of semi-detection of hepatitis B，high sensitivity，specificity，sensitivity to the timely response to the virus The infection in the body，but also for clinical observation of the effect as one of the targets.
【Key words】hepatitis B two-time-resolved immunoassay technology enzyme-linked immunosorbent assayHepatitis B
国内临床实验室最常用的乙型肝炎病毒感染者的血清学标志物主要依靠ELISA法，而且酶联免疫法应用最广。但受方法学本身的限制，它可能作为阴阳性判断，不能判断乙肝两对半具体含量，它不能完成HBV感染的动力学观察，而TRFIA是80年代初发展起来的一项超微量免疫分析技术，由于采用了稳定的稀土元素标记和增强液的放大效应，最大限度地提高了检测地灵敏度，在特异性和稳定性及测量自动化方面显示其优越性[1]，是替代放免分析的方法之一。时间分辨荧光技术的出现，其灵敏度高，特异性强，对于乙肝两对半定量检测，能够准确及时敏感地反应患者体内的乙型肝炎病毒标志物的含量。本文采用TRFIA法对360例炎患者血清标本进行HBV-M含量检测，并与ELISA法两者进行了比较分析，现报告如下，仅供参考。
1材料与方法
1.1检测对象：血标本均来自我院2005年11月~2006年11月之间门诊及住院病人360例，无性别和年龄区别，早晨空腹抽取静脉血，及时分离血清-20℃冷冻保存待检。
1.2检测试剂：ELISA试剂盒由英科(厦门)新创有限责任公司提供，时间分辨免疫荧光测定HBV-M试剂盒由广州丰华生物工程有限公司提供。
1.3检测仪器：泰莱一I时间分辨荧光免疫分析仪，DEM-III型自动酶标洗板机，FWZ-I微量振荡器。
1.4方法：ELISA法与TRFIA法测定HBV-M，操作严格按说明书进行，同时加入相应的质控物监测。
ELISA法主要步骤有：加样，孵育，洗板，加酶或底物，显色，比色，其中抗-HBc测定按1∶30稀释。
TRFIA法主要步骤有：加样，振荡，洗板，加配好的标记物工作液，振荡，洗板，加增强液振荡后上机检测，测定过程在30分钟内进行，其中抗-HBc测定按1∶30稀释。
1.5质控物有广州丰华生物工程有限公司提供。
1.6统计学分析：采用配对X2检验。
2结果
2.1时间分辨免疫荧光分析法检测乙型肝炎标志物结果见表1(X±S)
3讨论
我国是乙型肝炎患者的大国，HBV在人体内的复制量，患者机体的免疫状态和治疗效果等，一直是医生和患者十分关注的问题。近年来人们逐渐认识到TRFIA法在乙肝两对半定量检测对乙肝临床诊断具有一定的临床意义。TRFIA法检测HBV-M与ELISA法相比其特异性和敏感性都高，特别是能够检测低浓度的HBsAg和HBeAg，减少HBe感染漏诊和误诊具有较高的价值，因HBsAg阳性是HBV感染的金标准[2]。本研究发现，在360例乙型肝炎两对半检测中，两种方法通过对比发现，TRFIA法的灵敏度明显高于ELISA法，对HBsAg弱阳性的标本，ELISA法检测不到时，TRFIA法仍可以检出，且HBsAg的浓度处在一个较低的浓度范围内(0.5~10ng/m1)。另外，研究还发现用ELISA法检测抗-HBc这一项阳性时，用TRFIA法检测HBsAg，有的也可以检测出阳性，其浓度出在一个较低的范围内。对ELISA法检测HBsAg，抗-HBc两项均阳性的患者，TRFIA法检出抗-HBe也为阳性，这可能是由于方法学不同造成的。在HBV标志物的检测中，HBeAg，抗-HBe是一对比较重要的指标。由于临床上抗病毒核酸药物的广泛应用，会发现一些患者在治疗中HBeAg浓度降低出现HBeAg，抗-HBe同时阳性或HBeAg阴转，抗-HBe阳性，当检测方法的灵敏度不够时，会漏掉一些HBV低水平复制的阳性患者。HBV标志物检测是诊断乙型肝炎的必备手段，而病毒指标检测的标准直接关系到患者的诊断，合理用药和有效治疗[3]。TRFIA是一种能定量检测HBV标志物，特异性及灵敏度较高的一种新的检测方法，它的灵敏度高于ELISA法，可以检出低水平复制的标本，避免漏检，可以解决隐源性肝炎HBV标志物的诊断难题。在抗-HBV治疗过程中常会发生HBeAg向抗-HBe血清学转化，出现HBeAg和抗-HBe同时阳性或HBeAg阴转，抗一HBe低水平阳性，对低水平复制HBeAg，抗一HBe定量分析，对临床治疗及疗效观察有参考价值[4]。
TRFIA的另一优点是它的线性范围比较宽，方便进行定量。这对观察病人的感染进展情况，对治疗有无应答可得到最直接的变化数据。对临床来说，表面抗原，表面抗体和核心抗体的定量更为重要。另外，本研究还发现，大部分ELISA法检测为HBsAg.抗-HBc阳性模式的患者其实为HBeAg假阴性及抗-HBe假阴性，仅少部分可能为病毒变异的结果。研究发现ELISA法易出现假阴性。随着仪器和试剂的国产化，检验费用的降低，TRFIA因其突出的高敏感性，特异性，无放射污染等特点，是取代放免的方法之一，在乙肝两对半定量检测中有广泛的应用前景。对临床综合评价疗效，对临床合理用药，有效治疗可提供可靠的依据，值得在临床推广。
参考文献
1Yan F，Zhou J，et al Flow injection immunoassay for carcinoembrgonic antigen combined withtime-nesolved fluorometric detection，3 lmmunol Methods，2005，305：120-127
2陈紫榕，病毒性肝炎IMI，北京：人民卫生出版社，2002，6，191
3.4罗娅、周智、刘杞.乙型肝炎病毒标志物低水平复制的检测及方法学比较[J].中华肝脏病杂志，2002，2(2)：132
作者单位：730046甘肃省兰州市第二人民医院肝病研究所
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”