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【摘要】 目的：分析雄性激素不敏感综合征（AIS）大家系的AR突变效应。方法：从AIS患者外周血中将基因组DNA提取出来，以特异的引物聚合酶联反应（PCR）扩张雄激素受体（AR）基因，单链构象多态性分析（SSCP）扩增产物，将突变的外显子筛选出来，然后对其直接进行PCR产物测序。结果：所选取的8例人员中，有2例AIS患者缺失AR基因2号外显子，其余6例存在外显子电泳条带，经过基因测序，发现其符合正常AR基因。结论：本研究方法简便实用，在临床诊断和研究AIS中具有极为有益的应用。
【关键词】 AIS； 大家系； AR突变效应
AIS指雄性激素通过靶器官上特异的AR起作用，雄性激素在AR异常的情况下发生的作用障碍。AIS家系患者表型为X-隐性遗传，46：XY表型女性但有睾丸。新发现该家系AR受体基因2701位点C→A突变（ARG→SER）。基于本组前期研究，本研究分析了AIS大家系的AR突变效应，以明确该AIS家系致病的基因突变原因，将有可能终结该家族患病基因，帮助优生优育，并为相似疾病的临床处理提供经验。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取AIS家系五代中4名携带者与3名患者、1名可疑患者。所有患者均以原发闭经就诊，均具有典型的AIS，染色体核型均为46XY，经SRY检测均为阳性。患者年龄23～38岁，平均（31.2±10.4）岁；身高161～172 cm，
平均（166.5±5.4）cm。6例双侧性腺在腹腔内，2例双侧性腺在双侧腹股沟内。内分泌检查显示：4例血睾酮为16.7～29.7 nmol/L，正常男性水平为13.0～33.0 nmol/L；2例患者的血睾酮为2.1～2.2 nmol/L，比正常男性水平低；2例没有测定。所有患者的LH均为12.4～49 IU/L，比正常男性水平（2.5～9.8 IU/L）高。6例接受了双侧性腺切除，病例检查显示均为发育不良的睾丸，有多发性支持-间质细胞瘤、发育不良的输卵管组织等存在于其中2例患者的双侧睾丸中；2例还没有接受手术。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA制备 在患者知情同意的情况下将患者的5 mL的外周静脉血取出来，然后将30 μL 0.5 mol/L的EDTA加入其中进行抗凝，对白细胞进行分离，经蛋白酶K消化后，依据常规盐析法将基因组的DNA提取出来。
1.2.2 寡核苷酸引物的设计 依据Lubahn等医学学者设计的引物改良原20～30个碱基的引物，使其变为18～30个碱基的引物，并运用计算机软件进行检测，符合引物的要求。中国科学院微生物研究所运用DNA合成仪将引物合成。PCR引物5’-3’的顺序具体如表1所示。
1.2.3 试剂 从中国科学院遗传研究所购买的10×PCR缓冲液和Taq DNA 聚合酶，从德国Beohringer公司购买4种脱氧三磷酸核苷酸，运用美国Life Technologies公司提供的药盒进行测序。
1.2.4 聚合酶联反应（RCR） 在内含10×2.5 μL PCR缓冲液的25 μL体系中扩增所有外显子，4种均为2.5 mmol/L的dNTP 1.0 μL，引物、模板、双蒸水、Taq DNA 聚合酶分别为0.5 μL、0.5 μL、20 μL、1U。用1滴石蜡油将其覆盖起来。具体反映程序为：第1个循环，在95 ℃的温度下进行5 min的变性，然后将1Utaq酶加入其中，在55 ℃的温度下进行1 min的复性，之后在72 ℃的温度下进行3 min的延伸。以后，在94 ℃的温度下进行1 min的变性，然后在55 ℃的温度下进行1 min的复性，之后在72 ℃的温度下进行2 min的延伸。共35个循环，最后在72 ℃的温度下保温10 min。
1.2.5 扩增结果检测 在2%琼脂糖凝胶中点样4 μL的PCR扩增产物，琼脂糖凝胶中含有微量溴化乙锭，将电压调整为80 V，温度调整为室温，在l×TBE （Tris-碱-EDTA）缓冲液中进行30 min钟左右的电泳，在紫外光下对特定的扩增片段的存在情况进行认真细致的观察。
1.2.6 单链构象多态性分析 在l×TBE（Tris-碱-EDTA）缓冲液中对比例为49：1的丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的混合物6%的聚丙烯酰胺非变性胶进行1 h的预电泳，均匀混合5 μL PCR扩增产物+3 μL单链DNA加样液之后，在95 ℃的温度下进行5 min的加热变性，冰浴中骤冷，使单链状态得以保持，以后分别点样电泳。电压、温度、电泳时长分别为600 V、20 ℃、3～4 h。结束电泳后，运用硝酸银对胶进行染色，用照相方法将结果保存下来或移动胶到滤纸上，将保鲜膜盖在其上，在真空状态下对其加热，然后抽干保存。
1.2.7 测序 运用2%琼脂糖凝胶纯化经SSCP筛查出来的突变外显子的PCR产后之后，将其作为测序模板，运用双脱氧末端终止法进行直接测序，该方法的引物为γ-32P标记引物。经放射自显影后，读片。分别运用5’和3’引物进行测序，以对发现的突变进行充分的证实。经Lubahn等医学学者的雄激素受体基因序列结果作为参照，比较其与本研究的测序结果。
2 结果
2.1 PCR及基因测序结果 所选取的8例人员中，有2例AIS患者缺失AR基因2号外显子（图1），其余6例存在外显子电泳条带（图2），经过基因测序，发现其符合正常AR基因。AR Exon2 PCR产物凝胶电泳成像如图1所示。
2.2 AR基因的Exon2及相邻内含子区域碱基序列分析 2例AIS患者2号外显子两侧的内含子有缺失，内含子缺失的部位为Exon2上游2250 bp到下游3785 bp。依据正常的AR基因设计引物，在凝胶电泳中对Exon2上下游1400 bp和4000 bp长度的片段进行PCR扩增，均没有成像（图3）；在Exon2d的5’端距离Exon21700 bp、2000 bp、2250 bp、2600 bp处分别对引物进行设计，凝胶电泳PCR扩增所得产物，然后与正常的AR基因比较，发现2600 bp处电泳条带符合正常AR基因，但是1700 bp、2000 bp、2250 bp处均没有成像（图4）；在Exon2d的3’端距离Exon23569 bp、3785 bp、4165 bp、5230 bp、6103bp、7202bp处分别对引物进行设计，凝胶电泳PCR扩增所得产物，然后与正常的AR基因比较，发现4165 bp、5230 bp、6103 bp、7202 bp处电泳条带符合正常AR基因，但是3569 bp、3785 bp处均没有成像（图5、6）；AR基因外显子PCR检测及基因测序显示，2例AIS患者缺失AR基因2号外显子，附近内含子缺失碱基，共缺失碱基6000～7000 bp（图7）。 3 讨论
1953年，Morris首次对缺少男性化体征、存在睾丸但表型为女性、染色体核型为46，XY的患者报道了出来，并将该病命名为“睾丸女性化综合征”（testicular feminization syndrome，TFS），就是现在所说的“雄激素不敏感综合征”（Androgen insensitivity syndrome，AIS）[1-2]。AIS属于男性性分化异常的疾病，在所有新生男婴中，该病达到了1/20000到1/64000的发病率。该病的患者具有正常的产生和代谢空间，但由于定位于人类基因组Xq11-12的雄激素受体基因发生基因缺失、剪接位点突变、提前终止密码子或错义突变等改变，使雄激素活性受损，致靶器官对睾酮或双氢睾酮无应答，导致外生殖器男性化异常[3-5]。AIS患者的遗传性别、性腺性别和身体性别在其女性表型与染色体核型46，XY的作用下变得不一致，身份认同存在着严重障碍，给患者本人及家庭带来一生的痛苦[6-7]。即使有来自家庭成员或专业人士的道德支持及心理支持，亦可能带来严重心理问题而影响患者健康长大成人及正常生活。
AR突变的数量在2008年已经达到了300种。家族性X连锁隐性遗传是绝大多数AIS患者的AR突变的原因，占总数的70%[8]。AIS后代中，50% 46，XY为AIS，50% 46，XX为携带者[9]。依据雄激素受体的完全或不完全异常，可以将AIS分为以下三个类型，即完全性雄激素不敏感（CAIS）、不完全性AIS（部分与轻型）、脊髓肌肉萎缩症（Kennedy’s病），CAIS患者的主要临床表现是具有女性外生殖器，但是没有女性内生殖器管道，如子宫、卵巢等，但是生精功能存在障碍，机体也有男性化的特征。患者无睾丸发育不良，常以腹股沟疝或原发性闭经求诊。在青春期前具有较小的睾丸肿瘤发生风险，可以暂时不将睾丸切除，使其有足够的雌激素促女性化。但是，青春期后具有较大的睾丸肿瘤风险，达到了0.8%～5%的发生率，需要密切跟踪随访；青春期后应该将睾丸切除，用给予其小剂量雌激素替代治疗，以对其女性化进行有效的维持；如果患者有短段阴道，则可以扩张其阴道，或在成年后行阴道成形术[10]。不完全性AIS患者的主要临床表现是有一定程度的两性畸形，Wilson等医学学者称该类型患者为不完全性男性假两性畸形Ⅰ型患者；如果病情较轻，则表型为男性，但是不育；如果患者缺乏敏感的雄激素，则会呈现一定程度的男性女性化或女性男性化，伴隐睾、阴囊分裂等。
总之，测定AR基因，特别是在产前进行遗传学诊断，既能够对临床诊断进行有效的证实，又能够将携带者和患者有效区分开来。如果携带者处于育龄期，则对其进行产前诊断或着床前基因诊断，将胎儿染色体核形及相关AR基因改变明确下来。据此父母可在产前慎重选择，以利优生[15]。
参考文献
[1]超楚生，廖二元. 激素不敏感综合征[M].长沙：湖南科学技术出版社，2008：11-12.
[2]郭应禄，胡礼泉.男科学[M].北京：人民卫生出版社，2008：1435-1438.
[3]超楚生，伍汉文. 激素不敏感综合征的遗传特点[J].当代医师杂志，2009，1（4）：26-29.
[4]廖二元. 激素不敏感综合征的临床诊断及其治疗原则[J].中国实用内科杂志，2009，23（1）：1-4.
[5]应向军，撒应龙，徐佑璋，等.睾丸女性综合征4例[J].现代泌尿外科杂志，2011，8（1）：3-5.
[6]王德娟，司徒杰，邱剑光，等.完全性AIS家系报告并文献复习[J].中华腔镜泌尿外科杂志（电子版），2010，4（6）：44-46.
[7]洪伟平，许达开，苏劲.男性假两性畸形的诊断与治疗（附21例报告）[J].中华泌尿外科杂志，2008，24（11）：772-773.
[8]田秦杰，刘慧，郎景和.完全型AIS的临床特征与变异[J].中国实用妇科与产科杂志，2009，20（12）：723-725.
[9]崔正慧，金杭美.睾丸女性化综合征的研究进展[J].中国妇幼健康研究，2011，17（6）：547-549.
[10]叶璐夷，赵志民，王明华，等.雄性激素不敏感综合征家系中可育与不育患者间的差异表达基因[J].中国医学科学院学报，2006，28（2）：219-224.
（收稿日期：2013-10-08） （本文编辑：黄新珍）
【关键词】 AIS； 大家系； AR突变效应
AIS指雄性激素通过靶器官上特异的AR起作用，雄性激素在AR异常的情况下发生的作用障碍。AIS家系患者表型为X-隐性遗传，46：XY表型女性但有睾丸。新发现该家系AR受体基因2701位点C→A突变（ARG→SER）。基于本组前期研究，本研究分析了AIS大家系的AR突变效应，以明确该AIS家系致病的基因突变原因，将有可能终结该家族患病基因，帮助优生优育，并为相似疾病的临床处理提供经验。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取AIS家系五代中4名携带者与3名患者、1名可疑患者。所有患者均以原发闭经就诊，均具有典型的AIS，染色体核型均为46XY，经SRY检测均为阳性。患者年龄23～38岁，平均（31.2±10.4）岁；身高161～172 cm，
平均（166.5±5.4）cm。6例双侧性腺在腹腔内，2例双侧性腺在双侧腹股沟内。内分泌检查显示：4例血睾酮为16.7～29.7 nmol/L，正常男性水平为13.0～33.0 nmol/L；2例患者的血睾酮为2.1～2.2 nmol/L，比正常男性水平低；2例没有测定。所有患者的LH均为12.4～49 IU/L，比正常男性水平（2.5～9.8 IU/L）高。6例接受了双侧性腺切除，病例检查显示均为发育不良的睾丸，有多发性支持-间质细胞瘤、发育不良的输卵管组织等存在于其中2例患者的双侧睾丸中；2例还没有接受手术。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA制备 在患者知情同意的情况下将患者的5 mL的外周静脉血取出来，然后将30 μL 0.5 mol/L的EDTA加入其中进行抗凝，对白细胞进行分离，经蛋白酶K消化后，依据常规盐析法将基因组的DNA提取出来。
1.2.2 寡核苷酸引物的设计 依据Lubahn等医学学者设计的引物改良原20～30个碱基的引物，使其变为18～30个碱基的引物，并运用计算机软件进行检测，符合引物的要求。中国科学院微生物研究所运用DNA合成仪将引物合成。PCR引物5’-3’的顺序具体如表1所示。
1.2.3 试剂 从中国科学院遗传研究所购买的10×PCR缓冲液和Taq DNA 聚合酶，从德国Beohringer公司购买4种脱氧三磷酸核苷酸，运用美国Life Technologies公司提供的药盒进行测序。
1.2.4 聚合酶联反应（RCR） 在内含10×2.5 μL PCR缓冲液的25 μL体系中扩增所有外显子，4种均为2.5 mmol/L的dNTP 1.0 μL，引物、模板、双蒸水、Taq DNA 聚合酶分别为0.5 μL、0.5 μL、20 μL、1U。用1滴石蜡油将其覆盖起来。具体反映程序为：第1个循环，在95 ℃的温度下进行5 min的变性，然后将1Utaq酶加入其中，在55 ℃的温度下进行1 min的复性，之后在72 ℃的温度下进行3 min的延伸。以后，在94 ℃的温度下进行1 min的变性，然后在55 ℃的温度下进行1 min的复性，之后在72 ℃的温度下进行2 min的延伸。共35个循环，最后在72 ℃的温度下保温10 min。
1.2.5 扩增结果检测 在2%琼脂糖凝胶中点样4 μL的PCR扩增产物，琼脂糖凝胶中含有微量溴化乙锭，将电压调整为80 V，温度调整为室温，在l×TBE （Tris-碱-EDTA）缓冲液中进行30 min钟左右的电泳，在紫外光下对特定的扩增片段的存在情况进行认真细致的观察。
1.2.6 单链构象多态性分析 在l×TBE（Tris-碱-EDTA）缓冲液中对比例为49：1的丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的混合物6%的聚丙烯酰胺非变性胶进行1 h的预电泳，均匀混合5 μL PCR扩增产物+3 μL单链DNA加样液之后，在95 ℃的温度下进行5 min的加热变性，冰浴中骤冷，使单链状态得以保持，以后分别点样电泳。电压、温度、电泳时长分别为600 V、20 ℃、3～4 h。结束电泳后，运用硝酸银对胶进行染色，用照相方法将结果保存下来或移动胶到滤纸上，将保鲜膜盖在其上，在真空状态下对其加热，然后抽干保存。
1.2.7 测序 运用2%琼脂糖凝胶纯化经SSCP筛查出来的突变外显子的PCR产后之后，将其作为测序模板，运用双脱氧末端终止法进行直接测序，该方法的引物为γ-32P标记引物。经放射自显影后，读片。分别运用5’和3’引物进行测序，以对发现的突变进行充分的证实。经Lubahn等医学学者的雄激素受体基因序列结果作为参照，比较其与本研究的测序结果。
2 结果
2.1 PCR及基因测序结果 所选取的8例人员中，有2例AIS患者缺失AR基因2号外显子（图1），其余6例存在外显子电泳条带（图2），经过基因测序，发现其符合正常AR基因。AR Exon2 PCR产物凝胶电泳成像如图1所示。
2.2 AR基因的Exon2及相邻内含子区域碱基序列分析 2例AIS患者2号外显子两侧的内含子有缺失，内含子缺失的部位为Exon2上游2250 bp到下游3785 bp。依据正常的AR基因设计引物，在凝胶电泳中对Exon2上下游1400 bp和4000 bp长度的片段进行PCR扩增，均没有成像（图3）；在Exon2d的5’端距离Exon21700 bp、2000 bp、2250 bp、2600 bp处分别对引物进行设计，凝胶电泳PCR扩增所得产物，然后与正常的AR基因比较，发现2600 bp处电泳条带符合正常AR基因，但是1700 bp、2000 bp、2250 bp处均没有成像（图4）；在Exon2d的3’端距离Exon23569 bp、3785 bp、4165 bp、5230 bp、6103bp、7202bp处分别对引物进行设计，凝胶电泳PCR扩增所得产物，然后与正常的AR基因比较，发现4165 bp、5230 bp、6103 bp、7202 bp处电泳条带符合正常AR基因，但是3569 bp、3785 bp处均没有成像（图5、6）；AR基因外显子PCR检测及基因测序显示，2例AIS患者缺失AR基因2号外显子，附近内含子缺失碱基，共缺失碱基6000～7000 bp（图7）。 3 讨论
1953年，Morris首次对缺少男性化体征、存在睾丸但表型为女性、染色体核型为46，XY的患者报道了出来，并将该病命名为“睾丸女性化综合征”（testicular feminization syndrome，TFS），就是现在所说的“雄激素不敏感综合征”（Androgen insensitivity syndrome，AIS）[1-2]。AIS属于男性性分化异常的疾病，在所有新生男婴中，该病达到了1/20000到1/64000的发病率。该病的患者具有正常的产生和代谢空间，但由于定位于人类基因组Xq11-12的雄激素受体基因发生基因缺失、剪接位点突变、提前终止密码子或错义突变等改变，使雄激素活性受损，致靶器官对睾酮或双氢睾酮无应答，导致外生殖器男性化异常[3-5]。AIS患者的遗传性别、性腺性别和身体性别在其女性表型与染色体核型46，XY的作用下变得不一致，身份认同存在着严重障碍，给患者本人及家庭带来一生的痛苦[6-7]。即使有来自家庭成员或专业人士的道德支持及心理支持，亦可能带来严重心理问题而影响患者健康长大成人及正常生活。
AR突变的数量在2008年已经达到了300种。家族性X连锁隐性遗传是绝大多数AIS患者的AR突变的原因，占总数的70%[8]。AIS后代中，50% 46，XY为AIS，50% 46，XX为携带者[9]。依据雄激素受体的完全或不完全异常，可以将AIS分为以下三个类型，即完全性雄激素不敏感（CAIS）、不完全性AIS（部分与轻型）、脊髓肌肉萎缩症（Kennedy’s病），CAIS患者的主要临床表现是具有女性外生殖器，但是没有女性内生殖器管道，如子宫、卵巢等，但是生精功能存在障碍，机体也有男性化的特征。患者无睾丸发育不良，常以腹股沟疝或原发性闭经求诊。在青春期前具有较小的睾丸肿瘤发生风险，可以暂时不将睾丸切除，使其有足够的雌激素促女性化。但是，青春期后具有较大的睾丸肿瘤风险，达到了0.8%～5%的发生率，需要密切跟踪随访；青春期后应该将睾丸切除，用给予其小剂量雌激素替代治疗，以对其女性化进行有效的维持；如果患者有短段阴道，则可以扩张其阴道，或在成年后行阴道成形术[10]。不完全性AIS患者的主要临床表现是有一定程度的两性畸形，Wilson等医学学者称该类型患者为不完全性男性假两性畸形Ⅰ型患者；如果病情较轻，则表型为男性，但是不育；如果患者缺乏敏感的雄激素，则会呈现一定程度的男性女性化或女性男性化，伴隐睾、阴囊分裂等。
总之，测定AR基因，特别是在产前进行遗传学诊断，既能够对临床诊断进行有效的证实，又能够将携带者和患者有效区分开来。如果携带者处于育龄期，则对其进行产前诊断或着床前基因诊断，将胎儿染色体核形及相关AR基因改变明确下来。据此父母可在产前慎重选择，以利优生[15]。
参考文献
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[3]超楚生，伍汉文. 激素不敏感综合征的遗传特点[J].当代医师杂志，2009，1（4）：26-29.
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[5]应向军，撒应龙，徐佑璋，等.睾丸女性综合征4例[J].现代泌尿外科杂志，2011，8（1）：3-5.
[6]王德娟，司徒杰，邱剑光，等.完全性AIS家系报告并文献复习[J].中华腔镜泌尿外科杂志（电子版），2010，4（6）：44-46.
[7]洪伟平，许达开，苏劲.男性假两性畸形的诊断与治疗（附21例报告）[J].中华泌尿外科杂志，2008，24（11）：772-773.
[8]田秦杰，刘慧，郎景和.完全型AIS的临床特征与变异[J].中国实用妇科与产科杂志，2009，20（12）：723-725.
[9]崔正慧，金杭美.睾丸女性化综合征的研究进展[J].中国妇幼健康研究，2011，17（6）：547-549.
[10]叶璐夷，赵志民，王明华，等.雄性激素不敏感综合征家系中可育与不育患者间的差异表达基因[J].中国医学科学院学报，2006，28（2）：219-224.
（收稿日期：2013-10-08） （本文编辑：黄新珍）