【摘 要】
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目的建立优化的实时荧光定量PCR的引物探针设计参数。方法设计引物和探针时的原则包括:①上、下游引物的融解温度(Tm值)应尽量相同或相差越小越好,以利于PCR退火温度的优化;
【机 构】
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浙江大学邵逸夫临床医学研究所,浙江大学肿瘤研究所,浙江省生物治疗重点实验室
【基金项目】
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浙江省科技厅项目(021103004)
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目的建立优化的实时荧光定量PCR的引物探针设计参数。方法设计引物和探针时的原则包括:①上、下游引物的融解温度(Tm值)应尽量相同或相差越小越好,以利于PCR退火温度的优化;②扩增区域应当跨越不同的外显子(在基因组DNA上至少一个以上的内含子),以利于区分基因组DNA扩增产物和cDNA扩增产物;③引物和探针的位置最好位于外显子和内含子交界处,以避免引物和探针与基因组DNA的结合;④扩增区域最好靠近基因的3’端,以减少不完全逆转录的影响。本次研究设计了实时荧光定量RT-PCR检测人甲胎蛋白mRNA的引物和探针,并提取临床肝癌组织标本中的RNA,检测其中甲胎蛋白的表达。结果本次研究设计的实时荧光定量RT-PCR检测甲胎蛋白mRNA的引物和探针具有良好的特异性,可用于临床标本的检测。结论本次研究确定的原则对提高利用TaqMan技术定量检测目的基因结果的可靠性具有很好的指导意义。
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