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【摘要】 目的 探讨白英提取物(Solanum lyratum Thunb extract，STE)对乳腺癌MCF-7细胞凋亡及凋亡相关基因survivin和caspase-3表达的影响。方法 体外培养MCF-7细胞，以2.5、5、10 mg/L STE处理MCF-7细胞48小时，并以2.5 mg/L顺铂(DDP)作为阳性对照。用MTT法检测细胞抑制率，TUNEL法检测凋亡率，半定量RT-PCR检测survivin和caspase-3 mRNA表达。结果 与正常对照组比较，STE各浓度组细胞抑制率显著上升(P<0.001)，细胞凋亡率明显升高(P<0.001)，caspase-3 mRNA表达显著上升(P<0.001)，survivin mRNA表达明显下降(P<0.05或P<0.01)。结论 STE具有诱导MCF-7细胞凋亡作用，其分子机制可能与上调caspase-3及下调survivin基因表达有关。
【关键词】 白英；MCF-7细胞；细胞凋亡；survivin； caspase-3
文章编号：1003-1383(2007)04-0357-03
中图分类号：R 737.9
文献标识码：A
Apoptosis-inducing Effect of Solanum lyratum Thunb Extract on Human Breast
Cancer MCF-7 Cells and the Expression of Apoptosis Associated Genes
WEI Xing，LI Chao-gan，NONG Song
(Department of Microbiology，Youjiang Medical College for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China)
【Abstract】 Objective To explore the apoptosis-inducing effect of Solanum lyratum Thunb extract(STE) and the expression of apoptosis associated genes survivin and caspase-3 on human breast cancer MCF-7 cells.Methods MCF-7cells were treated with 2.5，5 and 10 mg/L STE for 48 h， and the cells were treated with 2.5 mg/L DDP as positive control. The inhibitory rate was evaluated by MTT assay. Apoptotic rate was determined by TUNEL method. The expression of survivin and caspase-3 mRNA was detected by semi-quantitive RT-PCR.Results Compared with control group， the inhibitory rate was increased obviously(P<0.001)， the apoptotic rate was increased markedly(P<0.001)， the expression of caspase-3 mRNA was increased significantly(P<0.001)， while survivin mRNA was decreased markedly (P<0.05 or P<0.01) in STE groups.Conclusion STE can induce MCF-7 cells apoptosis. The molecular mechanism might be related to up-regulating expression of caspase-3 and down-regulating expression of survivin genes.
【Key words】 Solanum lyratum Thunb； MCF-7 cells； apoptosis； survivin； caspase-3
白英(Solanum lyratum Thunb，ST)为茄科植物，又称白毛藤，是常用的抗癌中草药，在临床上多用于治疗肺癌、子宫颈癌、食道癌、乳腺癌和肝癌等多种癌症[1]。研究证实，ST提取液能通过上调fas基因和下调fasL基因表达，诱导Hela细胞凋亡[2]。生存素(Survivin)是迄今发现最强的凋亡抑制因子，其主要通过抑制caspase级联反应下游的caspase-3和caspase-7活性，从而抑制细胞凋亡[3]。本研究通过观察ST提取物(STE)诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡作用，并检测凋亡相关基因survivin 和caspase-3 mRNA表达情况，以探讨ST抗乳腺癌作用及其初步分子机制。
材料和方法
1.材料 乳腺癌MCF-7细胞株由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供，胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，四甲基偶氮唑蓝(MTT)为上海普飞生物技术有限公司产品，原位细胞凋亡检测试剂盒为北京中杉金桥生物技术公司产品，RT-PCR试剂盒为Promega公司产品，PCR引物为上海生物工程公司合成。KHB-Labsystems K3酶标仪为芬兰雷勃公司生产，BX51型显微镜为日本OLYMPUS公司生产，PCR仪为杭州郎基科学仪器有限公司生产。
2.方法
(1)药物提取 取ST(购买于百色市中医院中药房)干品粗粉50 g，用75%乙醇浸泡3 h，共浸泡3次，温度40℃，合并滤液，旋转蒸发器干燥得ST浸膏，二甲基亚枫(DMSO)溶解浸膏样品配制成浓度为10 mg/ml提取物药液， 再以细胞培养液稀释成所需浓度供实验用。
(2)实验分组和药物处理 体外按常规培养乳腺癌MCF-7细胞生长至对数增殖期，随机分为正常对照组(即不加药物处理)、STE处理组(浓度分别为2.5、5、10 mg/L)和DDP组(浓度2.5 mg/L)；更换含0(正常对照组)、2.5、5、10 mg/L STE和2.5 mg/L DDP的新鲜培养液，药物作用时间均为48 h。
(3)细胞增殖抑制试验(MTT法) 将对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞移入96孔培养板中，细胞密度约为1×104个/ml，每孔加入200 μl细胞悬液，培养24 h。吸弃孔内原培养液，加入含STE的10%胎牛血清RPMI 1640培养液200 μl，每个药物浓度设4个平行复孔，另设DDP为阳性对照组和空白对照孔。培养到44 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，继续培养4 h后终止，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μl，用震荡混合仪震荡10 min。选择492 nm波长酶标仪测定每孔光吸收值(OD值)。实验重复3次。按下公式计算抑制率：抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。
(4)TUNEL法检测细胞凋亡 细胞凋亡检测步骤按原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。药物作用后，收集各组细胞，用PBS漂洗两遍后进行细胞涂片，风干后丙酮固定15 min；细胞在渗透液(0.2%Triton X-100，0.1%柠檬酸钠)中孵育5 min，双蒸水冲洗玻片；滴加TUNEL反应混合物，37℃湿盒中孵育30 min；滴加转化剂-POD，37℃湿盒中孵育30 min，冲洗玻片；滴加DAB底物溶液，室温5~10 min；蒸馏水冲洗，苏木素复染、脱水、封片；以不加TUNEL反应混合液作为阴性对照。细胞核呈棕黄色为TUNEL反应阳性细胞(即凋亡细胞)。光镜下分析结果，随机计数10个高倍视野下阳性细胞所占百分数即为细胞凋亡率。
(5)半定量RT-PCR检测基因mRNA表达 药物处理细胞后，按Trizol试剂盒的说明书提取总RNA。Survivin，caspase-3和内对照β-actin引物借助primer premier 5.0软件设计，并经Genebank验证(见表1)。按试剂盒说明采用一步法进行RT-PCR。RT-PCR反应体系总体积50 μl，逆转录45℃×45 min，AMV RT灭活和预变性94℃×2 min，然后进行PCR 35个循环(94℃×30 s，57℃×1 min，68℃×2 min)，最后延伸68℃×7 min， 终止于4℃。各取PCR产物10 μl，加溴酚蓝指示剂2 μl，于1.5%琼脂糖凝胶上电泳约1 h(电压90伏)，用紫外透射分析仪观察结果并拍照。通过密度扫描仪扫描分析各条带的光密度，以β-actin的表达量为对照计算并比较各组survivin和caspcse-3的相对表达量。实验重复3次。
3.统计学处理 计量资料以均数±标准差(-±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验。用SPSS11.5软件进行统计学分析，P<0.05为有统计学差异。
结果
1.各组MCF-7细胞抑制率、凋亡率的比较 STE各浓度组及DDP组的细胞抑制率、凋亡率均显著高于正常对照组(P<0.001)。表2。
2.各组MCF-7细胞基因表达比较 与正常对照组比较，STE各浓度组细胞survivin mRNA表达明显下降(P<0.01或P<0.05)，caspase-3 mRNA的表达明显上升(P<0.001)。见表3。
讨论
本实验发现STE对MCF-7细胞具有明显的抑制增殖和诱导癌细胞凋亡的作用，并呈现一定的剂量依赖性(STE浓度与抑制率、凋亡率呈现正相关，两者γ值分别为0.9831和0.9379)。提示一定浓度的STE对MCF-7细胞具有较强的杀伤能力并能诱导癌细胞凋亡，诱导细胞凋亡可能是其抑制MCF-7细胞生长的机制之一。
Survivin抗凋亡作用已被研究证实，它不仅通过阻断线粒体细胞色素C释放，与下游凋亡效应因子Caspase-3和Caspase-7结合而对其活性产生直接抑制效应，而且还通过与纺缍体纤维的结合，间接抑制Caspase对纺缍体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞的完整性，从而抑制细胞凋亡[4]。另外，Survivin与细胞周期素依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4， CDK4)形成Survivin- CDK4复合体，释放出P21，而P21能进一步与线粒体Caspase-3结合，抑制其活性，阻止细胞凋亡[5]。本研究发现，STE能下调乳腺癌MCF-7细胞survivin mRNA表达，并呈现一定的剂量依赖性，提示STE诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡机制可能与下调survivin基因表达有关。
Caspase-3是Fas/Apo-1介导的凋亡信号转导途径的关键效应分子，又是多种凋亡途径共同作用的因子，其表达水平的高低决定着细胞凋亡程度[6]。本实验结果证明，STE能使乳腺癌MCF-7细胞caspase-3 mRNA表达增高，提示其对MCF-7细胞凋亡的诱导可能是通过caspase-3激活而发挥作用。
综上所述，我们认为STE诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡机制可能与上调caspase-3及下调survivin基因表达有关。但Survivin和caspase-3基因在STE诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡中的关系如何，其他基因是否参与等方面，尚待深入研究。
参考文献
[1]吴婉莹，高志刚，李云谷，等.白英和欧白英的化学成分与药理活性[J].国外医药植物药分册，2001，16(6)：245-247.
[2]韦 星，李朝敢，农 嵩，等.白英提取液对Hela细胞凋亡及Fas/FasL基因表达的影响[J].中药材，2006，29(11)：1203-1206.
[3]Lacasse EC，Baird S，Korneluk RG，et al.The inhibitors of apoptosis(IAps) and their emerging role in cancer[J].Oncogene， 1998，17(25)：3247-3259.
[4]Andrade F，Roy S，Nicholoson D.et al.Granzyme B directly and efficiently cleaves sereral downstreem caspase substrates：implication for CTL-induced apoptosis[J].Immunity，1998，8(4)：451-460.
[5]Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death[J].Oncogene，2000，19(10)：1346-1353.
[6]Tormanen，Napankangas U.Expression of Caspase-3，-6 and -8 and their relation to apoptosis in non-small cell lung carcinoma[J].International journal of cancer，2001，93(2)：192-198.
(收稿日期：2007-05-22 修回日期：2007-07-12)
(编辑：梁明佩 英文审校：唐雄林)
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【关键词】 白英；MCF-7细胞；细胞凋亡；survivin； caspase-3
文章编号：1003-1383(2007)04-0357-03
中图分类号：R 737.9
文献标识码：A
Apoptosis-inducing Effect of Solanum lyratum Thunb Extract on Human Breast
Cancer MCF-7 Cells and the Expression of Apoptosis Associated Genes
WEI Xing，LI Chao-gan，NONG Song
(Department of Microbiology，Youjiang Medical College for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China)
【Abstract】 Objective To explore the apoptosis-inducing effect of Solanum lyratum Thunb extract(STE) and the expression of apoptosis associated genes survivin and caspase-3 on human breast cancer MCF-7 cells.Methods MCF-7cells were treated with 2.5，5 and 10 mg/L STE for 48 h， and the cells were treated with 2.5 mg/L DDP as positive control. The inhibitory rate was evaluated by MTT assay. Apoptotic rate was determined by TUNEL method. The expression of survivin and caspase-3 mRNA was detected by semi-quantitive RT-PCR.Results Compared with control group， the inhibitory rate was increased obviously(P<0.001)， the apoptotic rate was increased markedly(P<0.001)， the expression of caspase-3 mRNA was increased significantly(P<0.001)， while survivin mRNA was decreased markedly (P<0.05 or P<0.01) in STE groups.Conclusion STE can induce MCF-7 cells apoptosis. The molecular mechanism might be related to up-regulating expression of caspase-3 and down-regulating expression of survivin genes.
【Key words】 Solanum lyratum Thunb； MCF-7 cells； apoptosis； survivin； caspase-3
白英(Solanum lyratum Thunb，ST)为茄科植物，又称白毛藤，是常用的抗癌中草药，在临床上多用于治疗肺癌、子宫颈癌、食道癌、乳腺癌和肝癌等多种癌症[1]。研究证实，ST提取液能通过上调fas基因和下调fasL基因表达，诱导Hela细胞凋亡[2]。生存素(Survivin)是迄今发现最强的凋亡抑制因子，其主要通过抑制caspase级联反应下游的caspase-3和caspase-7活性，从而抑制细胞凋亡[3]。本研究通过观察ST提取物(STE)诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡作用，并检测凋亡相关基因survivin 和caspase-3 mRNA表达情况，以探讨ST抗乳腺癌作用及其初步分子机制。
材料和方法
1.材料 乳腺癌MCF-7细胞株由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供，胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，四甲基偶氮唑蓝(MTT)为上海普飞生物技术有限公司产品，原位细胞凋亡检测试剂盒为北京中杉金桥生物技术公司产品，RT-PCR试剂盒为Promega公司产品，PCR引物为上海生物工程公司合成。KHB-Labsystems K3酶标仪为芬兰雷勃公司生产，BX51型显微镜为日本OLYMPUS公司生产，PCR仪为杭州郎基科学仪器有限公司生产。
2.方法
(1)药物提取 取ST(购买于百色市中医院中药房)干品粗粉50 g，用75%乙醇浸泡3 h，共浸泡3次，温度40℃，合并滤液，旋转蒸发器干燥得ST浸膏，二甲基亚枫(DMSO)溶解浸膏样品配制成浓度为10 mg/ml提取物药液， 再以细胞培养液稀释成所需浓度供实验用。
(2)实验分组和药物处理 体外按常规培养乳腺癌MCF-7细胞生长至对数增殖期，随机分为正常对照组(即不加药物处理)、STE处理组(浓度分别为2.5、5、10 mg/L)和DDP组(浓度2.5 mg/L)；更换含0(正常对照组)、2.5、5、10 mg/L STE和2.5 mg/L DDP的新鲜培养液，药物作用时间均为48 h。
(3)细胞增殖抑制试验(MTT法) 将对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞移入96孔培养板中，细胞密度约为1×104个/ml，每孔加入200 μl细胞悬液，培养24 h。吸弃孔内原培养液，加入含STE的10%胎牛血清RPMI 1640培养液200 μl，每个药物浓度设4个平行复孔，另设DDP为阳性对照组和空白对照孔。培养到44 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，继续培养4 h后终止，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μl，用震荡混合仪震荡10 min。选择492 nm波长酶标仪测定每孔光吸收值(OD值)。实验重复3次。按下公式计算抑制率：抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。
(4)TUNEL法检测细胞凋亡 细胞凋亡检测步骤按原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。药物作用后，收集各组细胞，用PBS漂洗两遍后进行细胞涂片，风干后丙酮固定15 min；细胞在渗透液(0.2%Triton X-100，0.1%柠檬酸钠)中孵育5 min，双蒸水冲洗玻片；滴加TUNEL反应混合物，37℃湿盒中孵育30 min；滴加转化剂-POD，37℃湿盒中孵育30 min，冲洗玻片；滴加DAB底物溶液，室温5~10 min；蒸馏水冲洗，苏木素复染、脱水、封片；以不加TUNEL反应混合液作为阴性对照。细胞核呈棕黄色为TUNEL反应阳性细胞(即凋亡细胞)。光镜下分析结果，随机计数10个高倍视野下阳性细胞所占百分数即为细胞凋亡率。
(5)半定量RT-PCR检测基因mRNA表达 药物处理细胞后，按Trizol试剂盒的说明书提取总RNA。Survivin，caspase-3和内对照β-actin引物借助primer premier 5.0软件设计，并经Genebank验证(见表1)。按试剂盒说明采用一步法进行RT-PCR。RT-PCR反应体系总体积50 μl，逆转录45℃×45 min，AMV RT灭活和预变性94℃×2 min，然后进行PCR 35个循环(94℃×30 s，57℃×1 min，68℃×2 min)，最后延伸68℃×7 min， 终止于4℃。各取PCR产物10 μl，加溴酚蓝指示剂2 μl，于1.5%琼脂糖凝胶上电泳约1 h(电压90伏)，用紫外透射分析仪观察结果并拍照。通过密度扫描仪扫描分析各条带的光密度，以β-actin的表达量为对照计算并比较各组survivin和caspcse-3的相对表达量。实验重复3次。
3.统计学处理 计量资料以均数±标准差(-±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验。用SPSS11.5软件进行统计学分析，P<0.05为有统计学差异。
结果
1.各组MCF-7细胞抑制率、凋亡率的比较 STE各浓度组及DDP组的细胞抑制率、凋亡率均显著高于正常对照组(P<0.001)。表2。
2.各组MCF-7细胞基因表达比较 与正常对照组比较，STE各浓度组细胞survivin mRNA表达明显下降(P<0.01或P<0.05)，caspase-3 mRNA的表达明显上升(P<0.001)。见表3。
讨论
本实验发现STE对MCF-7细胞具有明显的抑制增殖和诱导癌细胞凋亡的作用，并呈现一定的剂量依赖性(STE浓度与抑制率、凋亡率呈现正相关，两者γ值分别为0.9831和0.9379)。提示一定浓度的STE对MCF-7细胞具有较强的杀伤能力并能诱导癌细胞凋亡，诱导细胞凋亡可能是其抑制MCF-7细胞生长的机制之一。
Survivin抗凋亡作用已被研究证实，它不仅通过阻断线粒体细胞色素C释放，与下游凋亡效应因子Caspase-3和Caspase-7结合而对其活性产生直接抑制效应，而且还通过与纺缍体纤维的结合，间接抑制Caspase对纺缍体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞的完整性，从而抑制细胞凋亡[4]。另外，Survivin与细胞周期素依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4， CDK4)形成Survivin- CDK4复合体，释放出P21，而P21能进一步与线粒体Caspase-3结合，抑制其活性，阻止细胞凋亡[5]。本研究发现，STE能下调乳腺癌MCF-7细胞survivin mRNA表达，并呈现一定的剂量依赖性，提示STE诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡机制可能与下调survivin基因表达有关。
Caspase-3是Fas/Apo-1介导的凋亡信号转导途径的关键效应分子，又是多种凋亡途径共同作用的因子，其表达水平的高低决定着细胞凋亡程度[6]。本实验结果证明，STE能使乳腺癌MCF-7细胞caspase-3 mRNA表达增高，提示其对MCF-7细胞凋亡的诱导可能是通过caspase-3激活而发挥作用。
综上所述，我们认为STE诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡机制可能与上调caspase-3及下调survivin基因表达有关。但Survivin和caspase-3基因在STE诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡中的关系如何，其他基因是否参与等方面，尚待深入研究。
参考文献
[1]吴婉莹，高志刚，李云谷，等.白英和欧白英的化学成分与药理活性[J].国外医药植物药分册，2001，16(6)：245-247.
[2]韦 星，李朝敢，农 嵩，等.白英提取液对Hela细胞凋亡及Fas/FasL基因表达的影响[J].中药材，2006，29(11)：1203-1206.
[3]Lacasse EC，Baird S，Korneluk RG，et al.The inhibitors of apoptosis(IAps) and their emerging role in cancer[J].Oncogene， 1998，17(25)：3247-3259.
[4]Andrade F，Roy S，Nicholoson D.et al.Granzyme B directly and efficiently cleaves sereral downstreem caspase substrates：implication for CTL-induced apoptosis[J].Immunity，1998，8(4)：451-460.
[5]Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death[J].Oncogene，2000，19(10)：1346-1353.
[6]Tormanen，Napankangas U.Expression of Caspase-3，-6 and -8 and their relation to apoptosis in non-small cell lung carcinoma[J].International journal of cancer，2001，93(2)：192-198.
(收稿日期：2007-05-22 修回日期：2007-07-12)
(编辑：梁明佩 英文审校：唐雄林)
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