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目的:如何利用杂种优势生产出人们理想的材料是未来的研究重点,因此对家蚕原种与正交反交子代高温处理后的基因表达差异进行分析,试图从基因表达差异方面揭示杂种优势的机理.
方法:选择生产推广品种75xin和7532两个家蚕原种及其正反交F1(正交:75xin×7532;反交:7532×75xin)为实验材料,1-4龄常规桑叶饲养,4龄起蚕饷食前分雌雄饲养,于5龄第4天取脂肪体为研究材料,运用数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profiling,DGE)构建对应的8个DGE文库。
结果:
1.数字表达谱(DEG)测序结果统计
本实验总的参考Tags个数为55299个,其中Unambiguous reference tags为54721个,占到98.95％,而总共可以比对到14623个基因.构建的8个DGE文库,检测到969643个clean tag,7532♂雄、7532♀雌、75xin♂雄、75xin♀雌、(7532♀雌)×(75xin♂雄)雄、(7532♀雌)×(75xin♂雄)雌、(75xin♀雌)×(7532♂雄)雄、(75xin♀雌)×(7532♂雄)雌分别为:120654、113684、110608、106585、136880、123526、136537、121169.Distinct Tags分别为56200、45972、44738、42584、59658、49518、58009、45107.有6227个Tag比对到了家蚕公共数据库中预测的基因,还有7167个新转录本目前只能够在家蚕染色体定位.
2.杂交种表达模式分析
对杂交种和亲本进行表达模式分析,即杂交种与原种相比其基因转录本水平的差异,这里分成15种类型(分类标准按照表1进行):表达一致型(Co-F1,Co-expression with the parent)、F1低亲表达型(Low-F1,Low-expression of F1)、F1超亲表达型(High-F1,High-expression of F1)、母本高表达型(High-P1,High-expression of P1)、父本高表达型(High-P2,High-expression of P2)、母本低表达型(Low-P1,Low-expression of P1)、父本低表达型(Low-P2,Low-expression of P2)、中亲表达Ⅰ型(P1F1P2,Middle-expression in P1 and P2)、中亲表达Ⅱ型(P2F1P1,Middle-expressionin P2 and P1)、F1沉默表达型(Si-F1,Silence of F1)、母本沉默表达型(Si-P1,Silence of P1)、父本沉默表达型(Si-P2,Silence of P2)、F1特异表达型(Un-F1,Unique in F1)、母本特异表达型(Un-P1,Unique in P1)、父本特异表达型(Un-P2,Unique in P2).与亲代比较分析表明,不管是正交还是反交,大部分基因的表达都是相对稳定的,没有表现出差异,并且这些稳定表达的基因在正交反交中的功能聚类的种类和所占比例也是相对稳定的.可以看出,不管是在正交雌雄还是反交雌雄Co-F1所占比例都是最大的,说明大部分基因的转录水平在子代和亲代中都是没有差异的.而其他的类型所占比例相对较小,并且主要的差异类型是表现在基因的表达水平的“有”和“无”.
3.不同类型基因功能分析
首先对上述的Co-F1类型的基因进行WEGO分析(图2),结果表明不管是正交还是反交,这些基因所参与的功能路径大致是相同的,而只有在突触(synapse)、突触组成(synapse part)、病毒粒子(virion)、病毒粒子组成(virion part)是在反交中所独有的.同时差异基因的GO分析结果表明参与细胞生理过程(Cellular physiological process)、细胞代谢(cellular metabolism)、主要代谢过程(primary metabolism)所涉及的基因是最多的,分别是164个、122个、105个,表明杂交种与原种的主要差异在新陈代谢这一重要功能.差异基因的KEGG分析结果也证实参与各类新陈代谢的基因是最多的,特别表现在嘌呤代谢(Purine metabolism)、精氨酸和脯氨酸代谢(Arginine and proline metabolism)、脂肪酸代谢(Fatty acid metabolism)、丁酸乙酯代谢(Butanoate metabolism)、β-丙氨酸代谢(beta-Alanine metabolism)、丙酸代谢(Propanoatemetabolism)、色氨酸代谢(Tryptophan metabolism)、嘧啶代谢(Pyrimidine metabolism)、谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)、丙酮酸代谢(Pyruvate metabolism).另外参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解(Valine、leucine and isoleucine degradation)的基因也有11个,说明体内氨基酸的降解和稳定可能是杂种比原种表现出优势的一个重要原因.
结论:实验结果积累了丰富的数据,对进一步研究家蚕杂交种与原种的分子水平差异提供参考.