重金属铅的污染影响着食品品质和安全,危害人体健康。铅对机体多个器官都会产生毒性,而其中中枢神经系统最为敏感。近年来国内外对铅神经毒性机制的研究取得了一系列的进展,然而表观遗传调控在铅神经毒性中的作用仍不是很清楚。目的:探究组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)在铅导致的神经毒性中的作用机制,为铅中毒防治提供一个有力的效应因子。方法与结果:1.研究HDAC4参与铅引起的神经毒性作用过程。以PC12细胞作为研究对象,采用10μM的铅处理24 h,通过q-PCR以及western blot检测HDAC4 mRNA以及蛋白的表达水平,实验结果表明铅暴露后HDAC4 mRNA以及蛋白水平均表现出异常提升的现象。母鼠从孕期开始饮用含有铅(250 ppm)的水,对其子代(21 d)海马中HDAC4 mRNA及蛋白的表达进行检测,结果发现体内铅暴露后HDAC4的表达与细胞上的结果一致。通过添加HDAC4抑制剂(LMK-235)以及基因手段干扰RNA(shHDAC4)观察PC12细胞突起生长情况,实验结果表明LMK-235及敲低HDAC4能够修复铅引起的细胞突起损伤,说明HDAC4参与调控铅神经毒性的过程。2.探究HDAC4核内堆积参与铅神经毒性过程及其核内堆积的上游因子。免疫细胞化学观察铅对HDAC4亚细胞分布的影响和分别提取细胞核与细胞质蛋白检测HDAC4的表达水平,实验发现铅暴露可导致HDAC4在细胞核内堆积。构建核定位信号缺失的HDAC4质粒(ΔNLS2-HDAC4)转染观察细胞突起生长,实验发现阻断HDAC4的进核过程可以回复铅引起的细胞突起损伤,说明HDAC4的细胞核部分在铅暴露后发挥着不良作用。为探究调控HDAC4核内堆积的上游因子,接下来检测铅作用下磷酸酶PP1、PP2A以及激酶CaMK mRNA的表达水平,q-PCR实验结果表明铅暴露后引起细胞内PP1和PP2A表达水平的提高,而CaMK表达减少。基因敲低PP1检测HDAC4的亚细胞分布及观测细胞突起生长情况,实验表明PP1敲低后能够将铅作用下核内堆积的HDAC4重新再分布到细胞质中,而铅暴露下转染shPP1建立损伤修复再损伤实验观测到细胞突起生长出现缺陷,则说明铅暴露通过上调PP1的表达,介导HDAC4进入细胞核的过程,进而调控铅的神经毒性过程。3.探究铅暴露影响HDAC4的共同作用分子EZH2。LMK-235处理检测胞核与胞质蛋白中HDAC4的表达,实验发现LMK-235能够回复铅暴露后PP1的表达水平同时也能够将铅暴露后核内的HDAC4再分布至细胞质中。同时免疫细胞化学检测LMK-235处理后HDAC4的亚细胞分布及其与EZH2的共定位情况,发现抑制剂LMK-235能够重新分布铅作用下核内堆积的HDAC4至细胞质,且EZH2与HDAC4在细胞中能够共定位。蛋白提取过程中添加NEM(N-乙基马来酰胺)和使用类泛素化检测试剂盒检测EZH2的类泛素化水平,实验发现铅能够增加EZH2与HDAC4之间的相互作用和EZH2的类泛素化水平,而LMK-235与ΔNLS2-HDAC4质粒能够回复这种变化。结论:HDAC4在调节铅暴露引起的神经毒性方面发挥了重要作用,且由磷酸酶PP1介导的HDAC4核内堆积被认为是铅作用下神经细胞中的一个关键分子过程。同时HDAC4的异常提升增强了它与一个新的功能伙伴——EZH2的相互作用,首次发现HDAC4促进了EZH2的类泛素化过程,且发现了一条从PP1-HDAC4-EZH2的新路径来阐述铅的神经毒性。