【摘 要】
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目的 建立高通量体内Pig-a基因突变试验方法,并采用该方法研究二甲基肼(DMH)的遗传毒性.方法 将16只5周龄雄性SD大鼠随机分为阴性对照、DMH低剂量、DMH高剂量和阳性对照组,阴性对照组ig给予灭菌注射用水,DMH组分别ig给予20和60 mg·kg-1 DMH溶液(连续3d),阳性对照组ip给予100 mg·kg-1乙基亚硝基脲(ENU)(连续3d).给药前和末次给药后第7,14和28
【机 构】
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中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心,北京100176;中山大学药学院,广东广州510006
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目的 建立高通量体内Pig-a基因突变试验方法,并采用该方法研究二甲基肼(DMH)的遗传毒性.方法 将16只5周龄雄性SD大鼠随机分为阴性对照、DMH低剂量、DMH高剂量和阳性对照组,阴性对照组ig给予灭菌注射用水,DMH组分别ig给予20和60 mg·kg-1 DMH溶液(连续3d),阳性对照组ip给予100 mg·kg-1乙基亚硝基脲(ENU)(连续3d).给药前和末次给药后第7,14和28 d尾静脉采血,取80 μl用淋巴细胞分离液处理得到高纯网织红细胞(RETs)和成熟红细胞(RBCs)液,孵育Anti-CD59-phycoerythrin和Anti-CD61-phycoerythrin抗体,再标记Anti-PE-Microbeads(抗PE顺磁微珠),定量稀释至1000 μl.准确量取15μl红细胞稀释液,用核酸染料(SYTO13-Fluorescein Isothiocyanate)和计数微球混合液稀释至1500 μl(柱前样本),用于流式分析,计算NTotalRETs/N柱前Beads和NTotal RBCs/N柱前Beads值；剩余985 μl红细胞液采用免疫磁性柱(LS columns)浓缩,得到高浓度突变型红细胞液,离心,用核酸染料和计数微球混合液稀释至300 μl(柱后样本),流式分析得到计数微球(N柱后Beads)、突变型RETs(NMutational RETs)和突变型RBCs(NMutational RBCs)数量.根据公式m=NMutational RETs.RBCs/NTotal RETsorRBCs×N柱后Beads/N柱前Beads)×100％,计算RETs和RBCs的突变率(m),所得数据采用Wilcoxon秩和检验进行统计分析.结果 本高通量法分析RETs和RBCs数目分别高达3.11 ×10 7个和8.01 ×108个,空白组动物背景值范围mRETs为0.56×10-6 ～7.83 ×10-6,mRBCs为0.35 ×10-6～6.86 ×10-6,且每个样本流式总检测时间缩短至8 min.给药后第7d时,阴性组mRETs为5.74 ×10-6,DMH低、高剂量组分别为3.23×10-6和4.82×10-6,阳性组为1.50 ×10-4,阳性组是阴性组的26.1倍；阴性组mRBCs为2.61×10-6,DMH低、高剂量组分别为1.33×10-6和2.81 ×10-6,阳性组为1.18 ×10-5,阳性组是阴性组的4.5倍.给药后第14d时,阴性组mRETs为4.15 ×10-6,DMH低、高剂量组分别为0.87 ×10-6和0.74×10-6,阳性组为5.70×10-4,阳性组是阴性组的137.3倍；阴性组mRBCs为2.68×10-6,DMH低、高剂量组分别为2.25×10-6和3.33×10-6,阳性组为4.06 ×10-5,阳性组是阴性组的15.1倍.给药后第28 d时,阴性组mRETs为3.36×10-6,DMH低、高剂量组分别为2.54 ×10-6和1.56 ×10-6,阳性组3只动物死亡,剩余1只动物mRETs为1.75 ×10-5,是阴性组的5.2倍；阴性组mRBCs为1.81 ×10-6,DMH低、高剂量组分别为2.25×10-6和3.90 ×10-6,阳性组为1.64 ×10-4,阳性组是阴性组的90.7倍.结论 成功建立了高通量体内Pig-a基因突变检测方法.与阴性组相比,阳性组RETs和RBCs Pig-a基因突变率随时间呈明显上升趋势(P＜0.05).在设计剂量范围内,DMH低、高剂量组与阴性对照相比Pig-a基因突变率无明显变化.在本实验条件下,经口给予大鼠DMH未引起Pig-a基因突变率上升.
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