几丁质(甲壳素)是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的直链多聚物,是最丰富的天然高分子化合物之一,其经几丁质酶水解后的产物几丁二糖是在医药保健等领域具有很高的应用价值。由于几丁质在中性条件不可溶,因此需要经过繁琐的步骤制备成胶体几丁质才能被酶水解,而在酸性条件下几丁质的溶解性显著增加,大大提高几丁质酶的水解效率。因此本研究根据前人的报道和巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性,全基因合成了一个最适反应pH在2.0的酸性几丁质酶(AMCase)编码基因Dchit,经密码子优化的Dchit与原始AMCase基因具有76.6%的同源性。将该基因克隆到毕赤酵母表达载体上并在酵母中进行了表达,结果显示AMCase的表达水平随着诱导时间的增加而增加,第8天达到最高活性0.29 U/mL。为了进一步提高重组AMCase的表达,通过多基因插入的方法,构建了含有1、2、3、4、6拷贝AMCase表达框的重组菌株,经诱导发酵显示带有4拷贝AMCase表达框的重组菌株在摇瓶发酵中产生最高的活性0.66U/mL,相对于单拷贝表达的菌株活性提高了2.3倍。此外,使用3个辅因子在4拷贝菌株中进行共表达,结果表明,HAC1的共表达显著增加了AMCase蛋白的表达水平,AMCase活性最高达到0.95 U/mL,比单拷贝菌株提高了3.5倍。重组AMCase在3h内直接水解甲壳素为(GlcNAc)2,结果显示水解效率很低,仅有4.3%,但以可溶性更好的胶体几丁质作为底物时,转化率可达59%,我们的研究表明了AMCase首次在巴斯德毕赤酵母中成功表达,以及提高AMCase表达的策略,有助于几丁质酶的研究和应用以及壳寡糖的生产。