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目的:EMT(epithelial-mesenchymal transition)、MET(mesenchymal-epithelial transition)是上皮肿瘤细胞从原发部位转移到新部位,并定植形成新转移灶的两个重要过程.本研究发现氟尿嘧啶处理A549后,细胞顺序发生EMT-MET的变化,同时探究该过程中细胞的功能改变及分子变化。
方法:氟尿嘧啶(50uM)处理对数生长期肺癌细胞系A549 48h,然后更换为普通培养基继续培养观察;倒置显微镜观察并拍摄细胞形态变化;流式细胞术检测细胞周期发布;平板克隆形成实验检测细胞增殖及克隆形成能力;Transwell实验检测细胞侵袭转移能力;Real Time PCR检测上皮间质标志分子及侵袭转移相关分子的mRNA表达情况;Western Blot检测上皮间质标志分子及侵袭转移相关分子的蛋白表达情况。
结果:氟尿嘧啶处理48h后,部分A549细胞发生凋亡,剩余存活的细胞增殖停滞,开始发生间质梭形样变;7-15d左右,细胞进一步变为长梭形(EMT阶段);15-25d左右,长梭形细胞逐渐变回上皮形态并恢复增殖能力(MET阶段);G0/G1期细胞比例,A549未处理组(77.03％),A459 EMT组(79.63％),A549 MET组(69.64％);S期细胞比例,A549未处理组(12.66％),A459 EMT组(5.96％),A549 MET组(18.24％);克隆形成数目,A549未处理组(82.3±4.0),A459 EMT组(36.0±5.6),A549 MET组(168.7±8.6);流式和克隆形成实验结果显示EMT组细胞增殖阻滞,形成克隆能力弱,而MET组增殖能力强,形成的单克隆数目最多;transwell侵袭转移细胞数目,A549未处理组(56.7±10.2),A459 EMT组(99.7±19.4),A549 MET组(105.3±7.6),EMT组和MET组侵袭转移能力强于未处理组;Real Time PCR结果显示EMT组和MET组中间质标志分子N-cadherin、vimentin、zeb1、zeb2、snail、slug,fibronectin,侵袭转移相关分子mmp2、mmp9、caldesmon较未处理组均有不同程度上升;Western Blot结果显示EMT组和MET组中N-cadherin、vimentin、caldesmon的表达升高;同时,发现EMT组和MET组中E-cadherin在mRNA和蛋白水平表达均上调,这可能与细胞粘附介导的化疗耐药有关。
结论:A549在化疗药物氟尿嘧啶的作用下,细胞通过顺序发生EMT-MET的变化,躲避了药物诱导的凋亡,增强了侵袭转移能力,重新恢复细胞活性,获得增殖能力.提示体内肿瘤细胞也可能经历相似过程,使得氟尿嘧啶化疗失败,导致肿瘤的转移和复发。